Name: Punción en el dedo de sangre Metodología de muestreo para la determinación de la inducida por el ejercicio apoptosis de los linfocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Aprende a medir la apoptosis de linfocitos inducida por ejercicio mediante punción digital y citometría de flujo. Este método rápido y mínimamente invasivo mejora la precisión en estudios de inmunología del ejercicio.

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Esta investigación fue financiada por una beca de la Facultad Nuevo en el Consejo de Becas de la Facultad en la Universidad de Western Kentucky.

1. Punción en el dedo de muestra de sangre <ol><li> Recolección de sangre entera se toma típicamente en reposo por una medida de referencia (normalmente después de 10-15 minutos de descanso sentado), durante o inmediatamente después de una sesión de ejercicio, y durante todo el período post-ejercicio (por lo general a partir de 1-3 horas tras el cese de la ejercicio). </li><li> Utilizando las precauciones universales, en primer lugar esterilizar la yema del dedo con el 70% de alcohol isopropílico. </li><li> Punción A continuación, el sitio usando una lanceta automatizado o dispositivo similar. A pesar de que el uso de una lanceta de calibre 30 para proporcionar la comodidad tema, una aguja de calibre grande podrían ser utilizados. </li><li> Limpie la primera gota de sangre, y luego recoger la sangre en tubos capilares o microvettes tratados con heparina de litio para evitar la coagulación. </li></ol> 2. Fenotipo celular y la apoptosis de tinción <ol><li> Añadir 10 l de sangre entera heparinizada al panel de anticuerpos tituló en 250 l de tampón de unión (véase el cuadro 1 esquema). Hemos utilizado un factor de dilución 1:20 con éxito, pero cada laboratorio debe su título de reactivos para determinar la mejor solución de trabajo. Tabla 1. Anticuerpos del panel para la determinación de la apoptosis inducida por el ejercicio en subconjuntos de leucocitos. Principios de la apoptosis se define por la expresión de anexina V, mientras que la apoptosis tarde fue definida por el doble etiquetado positivo con anexina V y 7-AAD. Las células necróticas se anexina V y 7-AAD + sólo las células. <table border="1"><tbody><tr><td> Un tubo </td><td> Tubo 2 </td><td> Tubo 3 </td><td> Tubo de 4 </td></tr><tr><td> Las únicas células del tubo </td><td> Anexina V - FITC </td><td> Anexina V - FITC </td><td> Anexina V - FITC </td></tr><tr><td></td><td> Contra CD4 Humanos - PE </td><td> Anti-CD8 Humanos - PE </td><td> Contra CD19 humano - PE </td></tr><tr><td></td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td></tr><tr><td></td><td> Humanos contra CD45RA - APC </td><td> Humanos contra CD45RA - APC </td><td></td></tr></tbody></table> 7-AAD = 7-amino-actinomicina D, APC = aloficocianina, CD4 = linfocitos T, CD8 = supresor / linfocitos T citotóxicos, CD19 = linfocitos B, CD45RA = subconjuntos de células ingenuas, FITC = isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina = PE. </li><li> Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. </li><li> Centrifugar a 1075 g durante 5-10 minutos. </li><li> Se decanta, añadir 300 l Glóbulos Rojos tampón de lisis, y completamente vórtice. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. </li><li> Añadir 300 l de PBS para detener la reacción RBC lisis. </li><li> Centrifugar a 1075 g durante 5-10 minutos. </li><li> Se decanta, rack, y se añaden 50 l de tampón de unión. </li><li> Analizar por citometría de flujo. </li></ol> Se recomienda que, como mínimo, los siguientes controles se utilizaron: un tubo de células sólo para servir como un control negativo en la detección de autofluorescencia de fondo, y tubos que contienen cada uno fluorocromo para ajustar la compensación de la preparación inicial del citómetro de flujo. Además, se han utilizado cuentas de compensación estándar con éxito para crear nuestros experimentos.

<ol><li>Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+does+not+contribute+to+the+blood+lymphocytopenia+observed+after+intensive+and+downhill+treadmill+running+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans.</a> Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).</li>
<li>Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise%2C+lymphocyte+apoptosis+and+F2-isoprostanes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).</li>
<li>Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+apoptosis+after+exhaustive+and+moderate+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise.</a> J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).</li>
<li>Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise+does+not+cause+lymphocyte+DNA+damage+or+increased+apoptosis+in+well-trained+endurance+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).</li>
<li>Wang, J. -S., Huang, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+intensity+on+lymphocyte+apoptosis+induced+by+oxidative+stress+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+apoptosis+of+lymphocytes+depends+on+training+status%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).</li>
<li>Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+treatment+influences+the+yield+of+apoptotic+lymphocytes+after+maximal+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).</li>
</ol>

Un procedimiento de recogida de muestras de invasión mínima y su posterior análisis se demuestra en el análisis de las fases temprana y tardía inducida por el ejercicio de la apoptosis de los linfocitos. También es posible excluir con claridad las células, que son necrosis, apoptosis y no. Este procedimiento supera los inconvenientes y las molestias asociadas con la punción venosa invasiva de la región antecubital en múltiples momentos antes, durante e inmediatamente después del ejercicio, o asegurar un catéter para la ...

<table><tbody><tr><td>Tampón de unión para citometría de flujo</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo lanceta</td><td>Accu Check Soft Touch</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>Tubos capilares heparinizados</td><td>Chase Scientific Glass, Inc.</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>GmC Lab</td><td>Gilson, Inc.</td><td>PMS-880</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V-FITC conjugada</td><td></td><td>Biovision Inc.</td><td>K201-400-1</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PE conjugado</td><td>Antihumano, clon RPA-T4</td><td>eBioscience</td><td>12-0049-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8-PE conjugado</td><td>Antihumano, clon OKT8</td><td>eBioscience</td><td>12-0086-73</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE conjugado</td><td>Antihumano, clon HIB19</td><td>eBioscience</td><td>12-0199-42</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción de viabilidad 7-AAD</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA-APC conjugado</td><td>Antihumano, clon HI100</td><td>eBioscience</td><td>17-0458-42</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>C6</td><td>Accuri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

punción en el dedo de sangre metodología de muestreo para la determinación de la inducida por el ejercicio apoptosis de los linfocitos

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

El ejercicio es un estímulo fisiológico capaz de inducir la apoptosis en las células inmunes. Hasta la fecha, diversas limitaciones han sido identificados con la medición de este fenómeno, especialmente en relación con la cantidad de tiempo necesario para aislar y tratar a una muestra de sangre antes de la evaluación de la muerte celular. Debido a esto, es difícil determinar si los aumentos reportados en la apoptosis de las células inmunitarias se puede contribuir al efecto real del ejercicio sobre el sistema, o son un reflejo de la época y el procesamiento necesario para obtener finalmente esta medida. En este artículo se demuestra un procedimiento rápido y mínimamente invasivo para el análisis del ejercicio de la apoptosis inducida por linfocitos. A diferencia de otras técnicas, la sangre entera se añade a un panel de anticuerpos inmediatamente después de obtener una muestra. Tras el período de incubación, los glóbulos rojos son lisadas y las muestras están listas para ser analizadas. El uso de un procedimiento de muestreo del dedo reduce el volumen de sangre requerido, y reduce al mínimo las molestias a los sujetos.

El ejercicio es capaz de inducir la apoptosis en las células inmunes. Hay varias limitaciones de medición, especialmente en relación con la cantidad de tiempo necesario para aislar y tratar a una muestra de sangre antes de la evaluación. Demostrado es un procedimiento rápido y mínimamente invasivo para el análisis de la apoptosis inducida por el ejercicio de linfocitos.

Punción en el dedo de sangre Metodología de muestreo para la determinación de la inducida por el ejercicio apoptosis de los linfocitos

El ejercicio es un estímulo fisiológico capaz de inducir la apoptosis en las células inmunitarias. Hasta la fecha, se han identificado diversas limitaciones en la medición...

Hola, soy James Volta del Programa de Ciencias del Ejercicio en el Departamento de Kinesiología, Recreación y Deportes de la Universidad de Kentucky Occidental. Y lo que vamos a hacer es mostrarles el procedimiento que hemos desarrollado y que utilizamos para medir el ejercicio inducido en la apoptosis de linfocitos. Así que vamos a echarle un vistazo.Se obtiene una muestra de sangre mediante punción digital utilizando precauciones universales para la gota de sangre. Se esteriliza la yema del dedo y luego se realiza la punción. Se elimina la primera gota de sangre y a continuación se recoge la sangre en tubos capilares o microplacas.10 microlitros de sangre entera se pipetearon en un panel de anticuerpos que contiene citometría de flujo, tampón amortiguador adecuado, fluorocromos incluyendo anexina V, siete aminoactin D, ya sea CD4, CD8 o CD19 y CD45ra, además de un tubo con solo células; hemos utilizado perlas de compensación como control para ayudar a configurar nuestros experimentos. La muestra se mezcla completamente en vórtex y luego se deja incubar a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 30 minutos. Tras la incubación, las muestras se centrifugan durante 10 minutos y

finger-stick-blood-sampling-methodology-for-determination-exercise

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Mediadas por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se pueden utilizar para evaluar las respuestas autorreactivas y los mecanismos de estudio de la muerte celular in vitro. Sin embargo, utilizando células vivas, las técnicas de microscopía confocal microscópicos con tintes fluorescentes, el tipo y la cinética de muerte celular, así como las rutas utilizadas se pueden estudiar con mayor detalle.

Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

Este vídeo demuestra el uso del ensayo ELISpot para evaluar la función de los linfocitos B secretores de anticuerpos, ASCs. Los anticuerpos secretados por las ASC interactúan con los fragmentos de anticuerpos policlonales unidos a la membrana, que son detectados por los anticuerpos IgG o IgM conjugados con enzimas. La mancha de color producida en cada pocillo indica la presencia del isotipo del anticuerpo específico, que se correlaciona con la actividad secretora de las células B.

Evaluación funcional de linfocitos B secretores de anticuerpos mediante el ensayo ELISpot

Este video muestra una técnica in vitro para estimular linfocitos a través de Haemophilus influenzae (NTHi) no tipificable y para evaluar la respuesta inmune. La incubación de células mononucleares aisladas de sangre periférica (PBMC) con NTHi hace que las células bacterianas estimulen los linfocitos T, lo que conduce a la producción de citocinas. Al inhibir la secreción de citocinas, se realiza una tinción de inmunofluorescencia para detectar las citocinas intracelulares acumuladas en los...

Una técnica in vitro para estimular linfocitos a través de bacterias patógenas

El propósito de este video es presentar la técnica modificada de biopsia del músculo esquelético de Bergström en sujetos humanos.

Procedimientos de biopsia de músculo esquelético humano utilizando la técnica de Bergström Modificado

El propósito de este manuscrito es presentar un método para medir la fagocitosis de monocitos y granulocitos y la actividad de estallido oxidativo en muestras de sangre humana.

La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

La sangre periférica humana se utiliza habitualmente para la evaluación de la respuesta inmunitaria humoral. En este trabajo, se describen los métodos para aislar las células B humanas de la sangre periférica, diferenciar las células B humanas en células B secretoras de anticuerpos (Ab) en cultivo y enumerar el total de IgM- e IgG-ASC mediante un ensayo ELISpot.

El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

Este trabajo describe un flujo de trabajo avanzado para la determinación precisa y rápida del recuento de células NK (Natural Killer) y la citotoxicidad de las células NK en muestras de sangre humana.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

El estudio del metabolismo es cada vez más relevante para la investigación inmunológica. Aquí, presentamos un método optimizado para medir la glucólisis y la respiración mitocondrial en esplenocitos de ratón y linfocitos T y B.

Un protocolo optimizado para analizar la glucólisis y respiración mitocondrial en los linfocitos

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Realización de ejercicio máximo y submáximo resistencia pruebas para medir las respuestas fisiológicas y biológicas al ejercicio agudo en seres humanos

Aprende a medir la apoptosis de linfocitos inducida por ejercicio mediante punción digital y citometría de flujo. Este método rápido y mínimamente invasivo mejora la precisión en estudios de inmunología del ejercicio.

Punción en el dedo de sangre Metodología de muestreo para la determinación de la inducida por el ejercicio apoptosis de los linfocitos (Video) | JoVE Journal

Punción en el dedo de sangre Metodología de muestreo para la determinación de la inducida por el ejercicio apoptosis de los linfocitos

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