La neuromodulación y mitocondrial de transporte: Imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo

El objetivo general de este procedimiento es visualizar el transporte mitocondrial y las neuronas cultivadas durante largos períodos utilizando microscopía de fluorescencia de células vivas. Esto se logra marcando primero las mitocondrias en neuronas cultivadas con una proteína fluorescente dirigida al órgano L. El segundo paso del procedimiento es adquirir imágenes del transporte mitocondrial en condiciones de control.

El tercer paso del procedimiento es adquirir series de imágenes de lapso de tiempo del transporte mitocondrial después de la administración aguda de neuromoduladores como la serotonina. El paso final del procedimiento es realizar un análisis de la serie de imágenes time-lapse adquiridas. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que los neurotransmisores modulan el transporte mitocondrial.

Tales resultados se logran solo mediante la obtención de imágenes de mitocondrias marcadas con fluorescencia en las neuronas durante largos períodos. La principal ventaja de este método sobre las técnicas existentes, como el marcaje de colorantes vitales o la transfección transitoria de GFP, es que este método hace factible realizar observaciones a largo plazo del transporte mitocondrial en neuronas cultivadas sanas. Para demostrar este procedimiento estará Chen, un miembro asociado de mi laboratorio, con el fin de proporcionar un ambiente calentado y humidificado de manera estable.

La incubadora de etapa superior está conectada a una incubadora de cultivo de tejidos estándar a través de un circuito cerrado, tapa de membrana A-P-F-T-E para placas de cultivo de vidrio de 35 milímetros Bottom permite el intercambio de gases entre el cultivo neuronal y el entorno dentro de la incubadora. Juntas, estas y otras características permiten la observación a largo plazo de neuronas cultivadas en diversas condiciones experimentales. Transfiera la placa de cultivo que contiene neuronas del hipocampo cultivadas, que expresan la proteína rojo mito turbo a una campana de cultivo de tejidos.

Reemplace la tapa de plástico con la tapa de membrana PFTE y mueva la placa de cultivo al microscopio. Sujete la base de la incubadora a la platina del microscopio y luego siéntela con cuidado en la placa de cultivo cubierta con membrana. En la abertura empotrada, alinee el recinto de la incubadora con los postes de acero de la base de la incubadora y baje el recinto sobre la base.

Apriete los tornillos de mariposa hasta lograr un buen sellado entre la carcasa y la base. Encienda el controlador de la rueda de filtros del microscopio, la fuente de luz y la cámara CCD antes de abrir el software de imágenes. En este protocolo, el libro de diapositivas cinco se utiliza para la adquisición de imágenes.

Cambie a un objetivo de inmersión en aceite de 63 x y baje la torreta del objetivo. Aplique con cuidado aceite de inmersión en la superficie del objetivo. Haga clic en el icono de la ventana de enfoque en la barra de herramientas y encienda la lámpara de campo claro moviendo el control deslizante de la lámpara.

Para ajustar la intensidad de la luz, concéntrese en un campo de células utilizando los oculares y encuentre una célula de interés. Seleccione el filtro XI tres en la pestaña de alcance usando los oculares, encuentre el plano de enfoque de las mitocondrias en las células que han sido marcadas con la proteína roja mito turbo y luego cambie a la cámara CCD. Haga clic en el icono de captura de imagen en la barra de herramientas, comenzando con un tiempo de exposición inicial de 100 milisegundos.

Encuentre la exposición óptima utilizando la prueba y encuentre los mejores botones en la ventana de captura. En el cuadro de tipo de captura. Marque la opción de lapso de tiempo y seleccione el intervalo de imagen deseado y la duración de la sesión de imágenes en las opciones de captura de lapso de tiempo.

Inicie la adquisición de imágenes de lapso de tiempo haciendo clic en el botón de inicio en la parte inferior derecha de la ventana de captura. Después de capturar una sesión de imágenes de control, administre neurotransmisores u otros reactivos a través de los puertos de inyección en la parte superior de la incubadora superior de la etapa. Tras la adición del agonista del receptor de serotonina ocho O-H-D-P-A-T-A, las mitocondrias previamente estacionarias indicadas por la punta de flecha se mueven a lo largo del axón de la neurona del hipocampo.

La velocidad media y la direccionalidad de las mitocondrias individuales se resumen antes de la adición de serotonina. La mayoría de las mitocondrias son estacionarias, sin embargo, después de la adición de serotonina, el 42% de las mitocondrias ahora exhiben movimiento direccional y viajan distancias más largas que las que exhiben movimiento direccional en ausencia de serotonina. Por el contrario, tras la adición de dopamina, el 92% de las mitocondrias están inmóviles en los últimos 15 minutos de una sesión de imágenes después de este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos para monitorear más de una señal con el fin de responder preguntas adicionales. Por ejemplo, cómo se relacionan la actividad del calcio y el transporte mitocondrial en las neuronas.