La neuromodulación y mitocondrial de transporte: Imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo

El objetivo general de este procedimiento es visualizar el transporte mitocondrial en neuronas cultivadas durante largos períodos mediante microscopía de fluorescencia en células vivas. Esto se logra primero etiquetando las mitocondrias en neuronas cultivadas con una proteína fluorescente dirigida a un orgánulo. El segundo paso del procedimiento consiste en adquirir imágenes del transporte mitocondrial en condiciones de control.

El tercer paso del procedimiento consiste en obtener series de imágenes de lapso de tiempo del transporte mitocondrial tras la administración aguda de neuromoduladores como la serotonina. El paso final del procedimiento es realizar un análisis de las series de imágenes de lapso de tiempo adquiridas. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que los neurotransmisores modulan el transporte mitocondrial.

Dichos resultados solo se logran mediante la obtención de imágenes de mitocondrias marcadas con fluorescencia en neuronas durante largos períodos. La principal ventaja de este método frente a técnicas existentes, como la marcación con colorantes vitales o la transfección transitoria de GFP, es que este método hace posible realizar observaciones a largo plazo del transporte mitocondrial en neuronas cultivadas sanas. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Chen, un investigador asociado de mi laboratorio, con el fin de proporcionar un ambiente establemente calentado y humedecido.

El incubador de platina está conectado a un incubador estándar de cultivo de tejidos mediante un circuito cerrado, con una tapa de membrana A-P-F-T-E para placas de cultivo de 35 milímetros con fondo de vidrio que permite el intercambio de gases entre el cultivo neuronal y el ambiente dentro del incubador. Conjuntamente, estas y otras características permiten la observación a largo plazo de neuronas cultivadas bajo diversas condiciones experimentales. Transfiera la placa de cultivo que contiene neuronas hipocampales cultivadas, que expresan la proteína mito turbo roja, a una cabina de cultivo de tejidos.

Sustituya la tapa de plástico por la tapa con membrana de PFTE y traslade el cultivo a la microscopía. Sujete la base del incubador al portaobjetos del microscopio y luego coloque cuidadosamente el cultivo con la membrana sobre ella. En la abertura empotrada, alinee el recinto del incubador con los pasadores de acero en la base del incubador y baje el recinto sobre la base.

Ajuste los tornillos de mariposa hasta lograr un buen sellado entre el recinto y la base. Encienda el controlador de la rueda de filtros del microscopio, la fuente de luz y la cámara CCD antes de abrir el software de adquisición de imágenes. En este protocolo, se utiliza el libro de portaobjetos número cinco para la adquisición de imágenes.

Cambie a un objetivo de inmersión en aceite de 63 x y baje la torreta de objetivos. Aplique cuidadosamente aceite de inmersión sobre la superficie del objetivo. Haga clic en el icono de ventana de enfoque en la barra de herramientas y encienda la lámpara de campo claro moviendo el control deslizante de la lámpara.

Para ajustar la intensidad de luz, enfoque un campo de células utilizando los oculares y localice una célula de interés. Seleccione el filtro XI tres en la pestaña del microscopio usando los oculares, encuentre el plano de enfoque para las mitocondrias en las células marcadas con la proteína mito turbo roja y luego cambie a la cámara CCD. Haga clic en el icono de captura de imagen en la barra de herramientas, comenzando con un tiempo de exposición inicial de 100 milisegundos.

Encuentre la exposición óptima utilizando los botones de prueba y búsqueda del mejor en la ventana de captura. En el cuadro de tipo de captura, marque la opción de lapso de tiempo y seleccione el intervalo de imágenes deseado y la duración de la sesión de adquisición bajo las opciones de captura de lapso de tiempo.

Inicie la adquisición de imágenes de lapso de tiempo haciendo clic en el botón de inicio en la parte inferior derecha de la ventana de captura. Después de capturar una sesión de imagen de control, administre neurotransmisores u otros reactivos a través de los puertos de inyección en la parte superior del incubador para platina. Tras la adición del agonista del receptor de serotonina 8-OH-DPAT, las mitocondrias previamente estacionarias indicadas por la cabecera de flecha se desplazan a lo largo del axón de la neurona del hipocampo.

Se resume la velocidad media y la direccionalidad de mitocondrias individuales antes de la adición de serotonina. La mayoría de las mitocondrias están estacionarias; sin embargo, tras la adición de serotonina, el 42 % de las mitocondrias ahora exhiben movimiento direccional y recorren distancias mayores que aquellas que muestran movimiento direccional en ausencia de serotonina. Por el contrario, tras la adición de dopamina, el 92 % de las mitocondrias están estacionarias en los últimos 15 minutos de una sesión de adquisición de imágenes siguiendo este procedimiento.

Pueden realizarse otros métodos para monitorear más de una señal con el fin de responder preguntas adicionales. Por ejemplo, cómo están relacionadas la actividad del calcio y el transporte mitocondrial en las neuronas.