Name: La neuromodulación y mitocondrial de transporte: Imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Aprende a visualizar el transporte mitocondrial en neuronas de hipocampo durante períodos prolongados mediante microscopía de fluorescencia. Este método utiliza proteínas fluorescentes dirigidas a mitocondrias y un incubador de etapa para observaciones estables.

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Nos gustaría dar las gracias a Donald Hutson por contribuir con su experiencia técnica y una gran habilidad en el diseño y la fabricación de la incubadora de etapa superior. También estamos agradecidos a Ayda Dashtaei por su excelente asistencia técnica. Todo el trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación de Neurociencias.

<ol><li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li>
<li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li>
<li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrawley%2C+JN+%22Current+protocols+in+neuroscience%22">Current protocols in neuroscience</a>. , J. Wiley. (1999).</li>
<li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFedoroff%2C+S+%22Protocols+for+neural+cell+culture%22">Protocols for neural cell culture</a>. , 3rd edn, Humana Press. (2001).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li>
<li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li>
</ol>

El empleo de lentivirus mediada por la expresión de una proteína fluorescente dirigidos a la mitocondria en cultivos de neuronas infectadas y un bajo costo de laboratorio construido etapa superior incubador que permite imágenes de células vivas para la concesión de prórrogas, que han sido capaces de investigar la relación entre el movimiento mitocondrial y señales de neuromoduladores , como la serotonina (5-HT), dopamina (DA), y la acetilcolina (ACh). Nuestros estudios han contribuido a esclarecer una vía de señalización que, por primera vez, los enlaces tráfico mitocondrial de los cambios en la actividad de las neuronas-modulado por neurotransmisores como la 5-HT y DA - que están en el corazón de la función neural. Nos encontramos con que el uso de proteínas fluorescentes dirigidas permite la observación de las mitocondrias en la etiqueta que viven las neuronas cultivadas durante largos períodos que pueden ser fisiológicamente más relevante que la duración mucho más corta que son posibles con colorantes vitales. Además, la intensidad de la señal de la proteína fluorescente que nos permite mantener los tiempos de exposición a corto durante la adquisición de la imagen, reduciendo al mínimo la posibilidad de photobleaching o fototoxicidad. Por último, una etapa superior sencillo y barato incubadora que mantiene la temperatura ambiente, humedad, y los niveles de CO 2, mientras se minimiza la evaporación de los medios de comunicación, nos permite seguir el movimiento de las mitocondrias en el que viven las neuronas durante horas o incluso días. Los investigadores que deseen fabricar una incubadora de etapa superior de las observaciones a largo plazo de las mitocondrias en neuronas vivas no necesita seguir los detalles precisos de nuestro diseño, siempre que las propiedades de los materiales utilizados (por ejemplo, la membrana permeable a los gases para evitar la evaporación de los medios de comunicación ) y los principios aplicados (por ejemplo, control de temperatura y humedad, de amortiguación del pH, el mantenimiento de la osmolaridad) son generalmente consistentes con lo que se describe en este protocolo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Cantidad </th><th> Descripción (y ubicación en la Figura 1) </th></tr><tr><td> 1 </td><td> Incubadora de cultivo de tejidos (H) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Resistente al calor, caja de plástico (delrin o similar) (A) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Marco de plástico de 35 mm la tapa GBM (para la colocación de membrana a una caja de petri) (M) </td></tr><tr><td> 2.1 </td><td> pies lineales claras PTFE (Teflón) de la membrana de material </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Tornillos de bronce del pulgar </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Pequeñas resistencias disipador 10kOhm (utilizados como elementos de calefacción dentro de la etapa superior de la caja-incubadora) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Transformador (fuente de corriente de 9V a las resistencias) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Terrario controlador de temperatura y de la sonda (regulación termostática de la energía a las resistencias del disipador de calor a través de transformador) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Erlenmeyer de 2000 ml (silenciador para la supresión de vibraciones en la manguera antes de la etapa superior-incubadora) (K) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8 &quot;hoja de Sorbothane (material de la junta para la base de la etapa superior-incubadora) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Hermético ABS (o similar) caja de plástico (de vivienda para la bomba de acuario) (J) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Bomba de acuario (I) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Equipo pequeño ventilador de refrigeración </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Carcasa de plástico para ventilador de refrigeración (L) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 9V transformador para el ventilador de refrigeración del ordenador </td></tr><tr><td> 20-30ft </td><td> Manguera de Nalgene o de silicona (las conexiones entre el cultivo de tejidos y las incubadoras de etapa superior, atrapa la humedad) (F, G, N) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Llaves de plástico (para abrir y cerrar el flujo de aire antes y después de la etapa superior-incubadora) (O) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> De púas de latón conectores de manguera (para las conexiones de la manguera hacia / desde la etapa-top incubadora y el recinto de la bomba de acuario) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Enchufes de bronce (para las conexiones de la manguera a / desde el escenario-top incubadora) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Enchufes de bronce (para las conexiones de la manguera a / desde el escenario-top incubadora) </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Etapa superior incubadora partes: <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7280-5MG </td></tr><tr><td> laminina </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35 mm con fondo de cristal platos </td><td> MatTek </td><td> P35GC-0-14-C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Tecnologías de la Vida </td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Tecnologías de la Vida </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Tecnologías de la Vida </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Ricas en lípidos BSA </td><td> Tecnologías de la Vida </td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L-asparagina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380-100G </td></tr><tr><td> L-prolina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8381-100G </td></tr><tr><td> La vitamina B-12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V2876-100MG </td></tr><tr><td> 5-HT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9523-25MG </td></tr><tr><td> 8-OH-DPAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8520-25MG </td></tr><tr><td> La dopamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8502-5G </td></tr><tr><td> Bromocriptina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2134-25MG </td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D047-100MG </td></tr></tbody></table>

la neuromodulación y mitocondrial de transporte: imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Para entender la relación entre el transporte mitocondrial y la función neuronal, es fundamental para observar el comportamiento de las mitocondrias en vivo las neuronas cultivadas de duración extendida 1-3. Esto es ahora posible mediante el uso de colorantes vitales y las proteínas fluorescentes con los componentes del citoesqueleto, orgánulos y otras estructuras en las células vivas pueden ser etiquetados y luego visualizados a través de microscopía de fluorescencia dinámica. Por ejemplo, en las neuronas simpáticas embrionarias de pollo, el movimiento se caracterizó mitocondrial utilizando el colorante vital importancia rodamina 123 4. En otro estudio, las mitocondrias se visualizan en las neuronas del cerebro anterior de rata mediante la transfección de mitocondrias objetivo EYFP 5. Sin embargo, las imágenes de las neuronas primarias en cuestión de minutos, horas o incluso días, presenta una serie de cuestiones. La primera de ellas son: 1) el mantenimiento de las condiciones de cultivo, tales como temperatura, humedad y pH durante las sesiones de formación de imágenes de largo, 2) una señal fuerte y estable fluorescentes para asegurar tanto la calidad de las imágenes obtenidas y la medición exacta de la intensidad de la señal durante el análisis de la imagen; y 3) la limitación de los tiempos de exposición durante la adquisición de la imagen para reducir al mínimo y evitar photobleaching fototoxicidad. Aquí se describe un protocolo que permite la observación, la visualización y análisis del movimiento mitocondrial en cultivos de neuronas del hipocampo de alta resolución temporal y bajo condiciones óptimas de mantenimiento de vida. Hemos construido un escenario económico-top incubadora que proporciona una buena regulación de la temperatura y el flujo de gas atmosférico, y también limita el grado de evaporación de medios, asegurando la estabilidad del pH y osmolaridad. Esta incubadora está conectado, a través de mangueras de entrada y de salida, a un nivel de cultivo de tejidos incubadora, que ofrece un nivel constante de humedad y una atmósfera de 5-10% CO 2 / aire. Este diseño ofrece una alternativa rentable a las incubadoras de microscopio mucho más caros que no necesariamente asegurar la viabilidad de las células durante muchas horas o incluso días. Para visualizar las mitocondrias, que infectan a las células con un lentivirus que codifica una proteína fluorescente roja que se dirige a la mitocondria. Esto asegura una señal fuerte y persistente, que, junto con el uso de una fuente de luz de xenón estable, nos permite limitar el tiempo de exposición durante la adquisición de imágenes y todo, pero se opone a photobleaching y fototoxicidad. Dos puertos de inyección en la parte superior de la incubadora de etapa superior permiten la administración aguda de los neurotransmisores y otros reactivos destinados a modular el movimiento mitocondrial. En suma, lentivirus mediada por la expresión de un orgánulo orientada proteína fluorescente de color rojo y la combinación de nuestra etapa-top incubadora, un microscopio de fluorescencia convencional invertido, cámara CCD, y la fuente de luz de xenón permiten obtener imágenes con lapso de tiempo de transporte mitocondrial en neuronas vivas más prolongados que los que sea posible en los estudios convencionales despliegue colorantes vitales dentro y fuera de la plataforma de sistemas de soporte vital.

Se describe un protocolo que permite imágenes de las mitocondrias en la vida neuronas a través de microscopía de fluorescencia durante largos períodos de tiempo. Imágenes durante períodos prolongados se lleva a cabo a través de lentivirus mediada por la expresión de una proteína mitocondrial, dirigida fluorescentes y el uso de una etapa de bajo costo-top incubadora que fue diseñado y construido en nuestro laboratorio.

La neuromodulación y mitocondrial de transporte: Imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo

Para comprender la relación entre el transporte mitocondrial y la función neuronal, es fundamental observar el comportamiento mitocondrial en cultivos vivos de...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar el transporte mitocondrial en neuronas cultivadas durante largos períodos mediante microscopía de fluorescencia en células vivas. Esto se logra primero etiquetando las mitocondrias en neuronas cultivadas con una proteína fluorescente dirigida a un orgánulo. El segundo paso del procedimiento consiste en adquirir imágenes del transporte mitocondrial en condiciones de control.El tercer paso del procedimiento consiste en obtener series de imágenes de lapso de tiempo del transporte mitocondrial tras la administración aguda de neuromoduladores como la serotonina. El paso final del procedimiento es realizar un análisis de las series de imágenes de lapso de tiempo adquiridas. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que los neurotransmisores modulan el transporte mitocondrial.Dichos resultados solo se logran mediante la obtención de imágenes de mitocondrias marcadas con fluorescencia en neuronas durante largos períodos. La principal ventaja de este método frente a técnicas existentes, como la marcación con colorantes vitales o la transfección transitoria de GFP, es que este método hace posible realizar observaciones a largo plazo del transporte mitocondrial en neuronas cultivadas sanas. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Chen, un investigador asociado de mi laboratorio, con el fin de proporcionar un ambiente establemente calentado y humedecido.El incubador de platina está conectado a un incubador estándar de cultivo de tejidos mediante un circuito cerrado, con una tapa de membrana A-P-F-T-E para placas de cultivo de 35 milímetros con fondo de vidrio que permite el intercambio de gases entre el cultivo neuronal y el ambiente dentro del incubador. Conjuntamente, estas y otras características permiten la observación a largo plazo de neuronas cultivadas bajo diversas condiciones experimentales. Transfiera la placa de cultivo que contiene neuronas hipocampales cultivadas, que expresan la proteína mito turbo roja, a una cabina de cultivo de tejidos.Sustituya la tapa de plástico por la tapa con membrana de PFTE y traslade el cultivo a la microscopía. Sujete la base del incubador al portaobjetos del microscopio y luego coloque cuidadosamente el cultivo con la membrana sobre ella. En la abertura empotrada, alinee el recinto del incubador con los pasadores de acero en la base del incubador y baje el recinto sobre la base.Ajuste los tornillos de mariposa hasta lograr un buen sellado entre el recinto y la base. Encienda el controlador de la rueda de filtros del microscopio, la fuente de luz y la cámara CCD antes de abrir el software de adquisición de imágenes. En este protocolo, se utiliza el libro de portaobjetos número cinco para la adquisición de imágenes.Cambie a un objetivo de inmersión en aceite de 63 x y baje la torreta de objetivos. Aplique cuidadosamente aceite de inmersión sobre la superficie del objetivo. Haga clic en el icono de ventana de enfoque en la barra de herramientas y encienda la lámpara de campo claro moviendo el control deslizante de la lámpara.Para ajustar la intensidad de luz, enfoque un campo de células utilizando los oculares y localice una célula de interés. Seleccione el filtro XI tres en la pestaña del microscopio usando los oculares, encuentre el plano de enfoque para las mitocondrias en las células marcadas con la proteína mito turbo roja y luego cambie a la cámara CCD. Haga clic en el icono de captura de imagen en la barra de herramientas, comenzando con un tiempo de exposición inicial de 100 milisegundos.Encuentre la exposición óptima utilizando los botones de prueba y búsqueda del mejor en la ventana de captura. En el cuadro de tipo de captura, marque la opción de lapso de tiempo y seleccione el intervalo de imágenes deseado y la duración de la sesión de adquisición bajo las opciones de captura de lapso de tiempo.Inicie la adquisición de imágenes de lapso de tiempo haciendo clic en el botón de inicio en la parte inferior derecha de la ventana de captura. Después de capturar una sesión de imagen de control, administre neurotransmisores u otros reactivos a través de los puertos de inyección en la parte superior del incubador para platina. Tras la adición del agonista del receptor de serotonina 8-OH-DPAT, las mitocondrias previamente estacionarias indicadas por la cabecera de flecha se desplazan a lo largo del axón de la neurona del hipocampo.Se resume la velocidad media y la direccionalidad de mitocondrias individuales antes de la adición de serotonina. La mayoría de las mitocondrias están estacionarias; sin embargo, tras la adición de serotonina, el 42 % de las mitocondrias ahora exhiben movimiento direccional y recorren distancias mayores que aquellas que muestran movimiento direccional en ausencia de serotonina. Por el contrario, tras la adición de dopamina, el 92 % de las mitocondrias están estacionarias en los últimos 15 minutos de una sesión de adquisición de imágenes siguiendo este procedimiento.Pueden realizarse otros métodos para monitorear más de una señal con el fin de responder preguntas adicionales. Por ejemplo, cómo están relacionadas la actividad del calcio y el transporte mitocondrial en las neuronas.

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Investigación

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Neurociencia

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