Name: Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprende a obtener registros eléctricos de neuronas piramidales en rebanadas organotípicas de neocórtex de ratas. Este método permite estudiar propiedades neuronales tras transfección genética mediante técnicas de patch-clamp.

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Los autores desean agradecer a Mayumi Sakuraba y Foehring Rebecca de asistencia técnica excepcional. Además, nos gustaría agradecer a los Dres. Rodrigo Andrade para la asistencia en la implementación de la cultura rebanada organotípicos y protocolos de transfección biolística y la Dra. Jeanne Nerbonne por darnos construcciones de ADNc para la transfección. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención: NS044163 del NINDS (a RCF).

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos estado estudiando el papel funcional de expresión y de voltaje canales de potasio en las neuronas piramidales de la corteza cerebral de rata (4, 9-11). Debido a la falta de agentes farmacológicos específicos para estos canales, se utiliza un enfoque genético para la manipulación de la expresión del canal (1,14,15,17-19). Utilizamos una preparación de la cultura organotípicos (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificada del enfoque de Stoppini et al (16), a fin de mantener la morfología celular y el patrón...

Cirugía / transfección / cultura: <ol><li> Cerebro Slicer: Campden Vibroslice # MA572 Instrumentos de Precisión Mundial, Sarasota, FL, EE.UU. </li><li> Sistema Gene Gun: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) <ul><li> Incluye: pistola de genes, manguera de helio con el regulador, la tubería de preparación de trenes (# 165 a 2.418), kit de jeringa, tubo de Tefzel, cortador de tubo, kit de optimización (# 165 hasta 2424), cortador de tubo </li><li> Bio-Rad Helio Regulador (# 165-2413) </li><li> materiales desechables de Helios de Bio-Rad: <ul><li> 1,6 micras de oro microportadores: # 165-2264 </li><li> Tubos Tefzel: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Incubadora: Forma Scientific modelo # 3110 (Thermo-Científico: (866) 984 hasta 3766). </li></ol> Los medios de comunicación: <ol><li> Suero de caballo: Hyclone donantes equina # 30074 SH. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321) </li><li> HMEM (medio mínimo esencial, más HBSS y HEPES, no glutamina: Lonza BioWhittaker Catálogo # 12-137f): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 a 6288, Opción 1. </li><li> HBSS (GIBCO Hanks solución salina tamponada, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 a 6288, Opción 1. </li><li> MEM (GIBCO medio esencial mínimo, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955 a 6288, Opción 1. </li><li> 250 ml Millipore 0,2 micras filtro: # SC6PU02RE </li><li> Pipetas de plástico de transferencia: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 ml Millipore 0,22 micras steriflip filtro (# SCGP00525) </li></ol> Artículos 8.6, diríjase a: Fisher Scientific, 1241 Blvd. Embajador, PO Box 14989, St. Louis, MO 63132. Grabación: <ol><li> Pipeta de vidrio: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 octubre Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 </li><li> Sutter P-87 extractor de electrodos horizontales: Empresa Sutter instrumento, una unidad digital, Novato, CA 94949 </li><li> Axon Instruments MultiClamp 700B amplificador: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> PCLAMP 10 software de adquisición de datos: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> lectrode posición se controla con Sutter ROE-200 manipuladores y PC-200: Sutter Instrument Company, una unidad digital, Novato, CA 94949. </li><li> Microscopio: Olympus BX-50WI microscopio vertical con IR-DIC óptica </li><li> IR-sensibles cámara OLY-150 (Olympus) o DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 Norte Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360). </li></ol>

grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Hemos estado estudiando el papel funcional de expresión y de voltaje canales de potasio en las neuronas piramidales de la corteza cerebral de rata. Debido a la falta de agentes farmacológicos específicos para estos canales, hemos tomado un enfoque genético para la manipulación de la expresión del canal. Utilizamos una preparación cultivo organotípico (16) con el fin de mantener la morfología celular y el patrón laminar de la corteza. Por lo general aislar aguda rebanadas neocortical en 8-10 días después del parto y mantener los cortes en la cultura durante 3-7 días. Esto nos permite estudiar las neuronas a una edad similar a los de nuestro trabajo con las rebanadas de agudos y reduce al mínimo el desarrollo de una exuberante conexiones excitadoras en el corte. Grabamos de forma visual se identifican las neuronas piramidales en las capas II / III o V con iluminación por infrarrojos (IR) y microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) con pinza de toda mancha de células en la corriente o voltaje-clamp. Usamos biolística (pistola de genes) de la transfección de tipo salvaje o mutante de ADN del canal de potasio para manipular la expresión de los canales para estudiar su función. Las células transfectadas son fácilmente identificables por microscopía de epifluorescencia después de co-transfección con ADNc para la proteína verde fluorescente (GFP). Se comparan las grabaciones de las células transfectadas con las neuronas adyacentes, untransfected en la misma capa de la misma división.

Este es un protocolo para preparar y mantener una rebanada preparación neocortical en la cultura organotípicos con el propósito de realizar grabaciones eléctricas de las neuronas piramidales.

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

Hemos estado estudiando la expresión y los roles funcionales de los canales de potasio dependientes de voltaje en neuronas piramidales de la neocorteza de rata. Debido a la ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener grabaciones eléctricas de neuronas parametales en cortes organotípicos de neocorteza. Esto se logra primero cortando secciones agudas de ratas en edades posnatales P8 a P10. El segundo paso del procedimiento consiste en realizar la transfección con Bic del ADNc. El tercer paso del procedimiento es cultivar los cortes durante tres a siete días.El paso final del procedimiento consiste en obtener registros eléctricos de células transfectadas utilizando el bloqueo de corriente o de voltaje. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que las células parametales en cortes organotípicos tienen propiedades similares a las de cortes agudos de la misma edad. La transfección de GFP no altera estas propiedades, lo que permite el estudio de neuronas tras manipulaciones genéticas de canales iónicos mediante registros de corriente o voltaje en célula completa.La principal ventaja de esta técnica, en comparación con los cortes agudos, es que las células pueden mantenerse en un entorno normal durante el tiempo suficiente para poder manipular genéticamente los canales iónicos. El método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los canales iónicos, como los roles funcionales de tipos específicos de canales iónicos. Prepare el flujo laminar, el flujo de vacío, los materiales quirúrgicos y las soluciones según se especifica en el manuscrito adjunto. Use guantes en todos los pasos posteriores tras filtrar el alícuota de 250 mililitros de la solución de corte, transfiriendo 40 mililitros a un vaso de precipitados de 50 mililitros.Coloque la cámara de corte, la alícuota de 40 mililitros y los 210 mililitros restantes de la solución de corte en el congelador a menos 20 grados Celsius bajo la campana de flujo laminar. Coloque 1,1 mililitros de medio de cultivo en tres pozos diagonales de una placa de seis pozos. Repita esto para una segunda.Placa de seis pocillos. Coloque las placas de seis pocillos en un incubador a 37 grados Celsius durante al menos una hora. A continuación, use tijeras estériles para acortar cuatro pipetas de transferencia que se utilizarán para transferir los cortes.Otras tres pipetas se mantienen intactas cuando las soluciones se han convertido en mezclas semifundidas. Retire la alícuota de 40 mililitros de solución de corte del congelador y colóquela bajo la campana de vacío. Sature con una mezcla de 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono.Luego, retire los 210 mililitros de solución de corte del congelador y colóquelos bajo la campana de flujo laminar con burbujas de 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono. A continuación, retire el medio de lavado del refrigerador y burbujéelo con 100% de oxígeno bajo la campana de flujo laminar.Coloque dos mililitros de medio de cultivo en una placa de Petri. Guarde el medio de cultivo restante en el refrigerador para el cambio de medio durante la semana, a fin de prepararse para el corte del cerebro. Vierta aproximadamente 10 mililitros de solución fría de corte desde el vaso de precipitados de 50 mililitros al vaso de precipitados de 25 mililitros bajo la campana de vacío.Tras la anestesia y la decapitación, extraiga el cerebro de una rata de ocho a 10 días posnatales. Lave el cerebro en el vaso de precipitados que contiene 30 mililitros de solución fría de corte durante aproximadamente 30 segundos. Luego, transfiera cuidadosamente el cerebro al vaso de precipitados de 25 mililitros.Cambie los guantes y sature los guantes con etanol. Luego, lleve el cerebro en la solución fría de corte hacia la cabina de flujo laminar. El siguiente paso es orientar y bloquear el cerebro eliminando el cerebelo y el polo frontal y realizando un corte sagital medio parcial; pegue el cerebro bloqueado sobre la platina con la corteza frontal hacia arriba.Realice cortes adicionales con el bisturí según sea necesario para limitar el tamaño de las secciones. Luego coloque la platina con el cerebro en la cámara de corte metálica esterilizada. Fije a la microtomo vibrante.Llene el baño con solución de corte fría con hielo y burbujeante. Vierta 30 mililitros de la solución de corte restante en un vaso de precipitados de 50 mililitros y burbujee con 95% oxígeno, 5% dióxido de carbono. Este vaso se utilizará para recoger las secciones.Corte secciones coronales de 250 micrones del córtex frontal parietal. Coloque al menos seis secciones en el vaso de 50 mililitros que contiene la solución de corte. A continuación, coloque aproximadamente dos mililitros de medio de lavado en una placa de Petri de 35 milímetros.Utilizando una pipeta cortada, transfiera las secciones desde la solución de corte hasta la placa de Petri que contiene el medio de lavado. Lave las secciones tres veces utilizando pipetas nuevas para añadir medio y para aspirar las soluciones residuales tras el lavado; luego transfiera las secciones a la placa de Petri de 35 milímetros que contiene el medio de cultivo. A continuación, retire las tapas del envase de los insertos de malla, pero deje los insertos dentro de sus paquetes.Luego, use pinzas para levantar un inserto de malla de su envase utilizando una pipeta de transferencia cortada. Transfiera una sección desde el medio de cultivo hasta la malla. Introduzca y coloque la sección en el centro de la membrana utilizando una pipeta de transferencia intacta.Elimine cualquier medio de cultivo en exceso. Ahora, coloque el inserto de malla con su sección en uno de los pocillos con líquido de la placa de seis pocillos. Tenga cuidado de evitar la formación de burbujas de aire debajo de la malla después de colocar una sección en cada uno de los pocillos con líquido.Coloque ambas las placas de seis pocillos de nuevo en la incubadora e incube a 37 grados Celsius durante aproximadamente una hora. Mientras tanto, limpie el área de trabajo bajo la cabina de flujo laminar en preparación para la transfección. El siguiente paso es cargar la pistola génica BioRad Helios, dejando la primera posición libre.Cargue un cartucho que contenga balas recubiertas con ADN en cada posición alternativa del portacartuchos del cañón genético. Luego, coloque el portacartuchos en el cañón genético. Primero, limpie el arma disparando un barril sin balas.Luego avance el cilindro hasta una cartucho que contenga CDNA.Bullets. Tome las placas de seis pocillos del incubador y colóquelas bajo la campana de flujo laminar sosteniendo la pistola verticalmente justo encima de la parte superior de la placa de seis pocillos; dispare un cartucho a 100 PSI, luego avance el cilindro y límpielo nuevamente disparando un cartucho vacío. Dispare los cartuchos restantes con un disparo por cartucho.Después de la colocación, devuelva las placas de seis pocillos al incubador e incube los cortes a 37 grados Celsius durante dos a siete días con 5% de dióxido de carbono durante el período de incubación. Cambie el medio cada dos días siguiendo este procedimiento: trabajando bajo la campana de flujo laminar, agregue medio nuevo a los tres pocillos vacíos. Luego, devuelva la placa de seis pocillos al incubador durante al menos una hora; transcurrida una hora, regrese la placa de seis pocillos a la campana laminar y utilice pinzas curvas limpias con etanol para trasladar cada inserto de malla junto con su corte a un nuevo pocillo, aspire el medio antiguo y devuelva la placa al incubador.Después de varios días de incubación, los cortes están listos para los registros de célula completa. Retire una placa de seis pocillos de la incubadora bajo la campana de flujo laminar. Utilice pinzas curvas limpias con etanol para retirar un inserto de malla y su corte.Luego, coloque nuevamente la placa de seis pocillos en el incubador. A continuación, transfiera la placa de Petri con el inserto de malla y el corte al área de registro, aplicando tensión con pinzas o una pieza flexible de metal. Utilice un escalpelo número 11 para cortar la malla alrededor del corte si es necesario y finalice los cortes con las tijeras.Luego, use pinzas para transferir la sección y la malla adjunta a la cámara de registro. Sobre la platina de un microscopio invertido, sumerja la sección en un líquido artificial del líquido cefalorraquídeo relacionado con carbógeno bajo óptica IR DIC. Visualice las neuronas parametales en las capas dos, tres o cinco mediante fluorescencia epi y el filtro fitz.Localice las células transfectadas verdes bajo microscopía IR DIC. Busque las balas de ADNc, que aparecen como pequeños puntos negros dentro de las células. Seleccione una célula transfectada para el registro de célula completa.A continuación, avance un microelectrodo hacia la célula seleccionada y utilice succión suave para lograr un sello de gigaohmios. Luego aplique succión adicional para romper la membrana celular y obtener el modo de celda completa. La célula ya está lista para realizar grabaciones en régimen de corriente o en régimen de voltaje.Esta figura muestra una imagen fluorescente de células transfectadas con ADNc para GFP. Las siguientes grabaciones se obtuvieron de células transfectadas con ADNc para GFP. Aquí se muestra un potencial de acción en una célula parametal de la capa tres en respuesta a una inyección de corriente supraumbral de 10 milisegundos.Esta figura muestra la actividad de disparo repetitivo de una neurona parametal de la capa cinco en respuesta a una inyección de corriente de 400 picoamperios durante dos segundos. Esta figura muestra un registro de bloqueo de voltaje de una neurona parametal de la capa cinco. Se utilizó tetrodotoxina para bloquear la corriente de sodio dependiente del voltaje.Los trazos representan corrientes salientes de potasio provocadas por una serie de pasos de voltaje de 500 milisegundos desde un potencial de reposo de menos 70 milivoltios. Una vez dominado, el ligero preparado y la transfección pueden realizarse en aproximadamente dos horas, incluido el tiempo de preparación. Al intentar este procedimiento.Es importante mantener condiciones estériles y limitar el grosor y las dimensiones del corte para evitar el secado. Gracias por ver este video. Buena suerte con su experimento.Gracias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo describe un ensayo de corte organotípicos optimizado para el cerebro postnatal y de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración de los neuroblastos en la corriente migratoria rostral.

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

Este video muestra cómo colocar una pipeta de punta fina cerca de cortes de cerebro, formando un sello con una célula neuronal. La succión rompe la membrana celular, creando así una pinza de parche de celda completa que permite mediciones de corriente para experimentos de electrofisiología.

Establecimiento de una configuración de pinza de voltaje de celda completa para registros electrofisiológicos en cortes de cerebro

Este video describe un método para obtener imágenes y registrar simultáneamente la actividad eléctrica de cortes de cerebro transgénicos que contienen proteínas fluorescentes específicas de neuronas. El procedimiento consiste en mantener el corte de cerebro en una cámara de perfusión con líquido cefalorraquídeo artificial aireado, utilizar una fuente de luz para excitar las células marcadas con fluorescencia y registrar las señales eléctricas con una sonda multicanal y una pinza de parche.

Monitorización óptica y electrofisiológica simultánea de células neuronales en cortes de cerebro

registros de pares son registros simultáneos de pinza de parche de célula completa de dos neuronas conectadas sinápticamente, lo que permite una caracterización electrofisiológica y farmacológica precisa de las sinapsis entre neuronas individuales. Aquí describimos la metodología detallada y los requisitos para establecer esta técnica en cultivos organotípicos de cortes de hipocampo en cualquier laboratorio equipado para electrofisiología.

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Los protocolos de bucle cerrado están cada vez más extendidos en la electrofisiología moderna. Presentamos una forma sencilla, versátil y económica de realizar protocolos electrofisiológicos complejos en neuronas piramidales corticales in vitro, utilizando un ordenador de sobremesa y una placa de adquisición digital.

En tiempo real Electrofisiología: Usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales Dinámica y allá

Aquí, se presenta un procedimiento para activar selectivamente una proteína neuronal con un pulso corto de luz mediante la codificación genética de un aminoácido no natural foto-reactivo en una proteína neuronal diana expresada en neuronas en cultivo o in vivo.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

Este protocolo muestra la implementación de un optimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de protección recuperación de preparación de corte de cerebro. Una formulación de medios de comunicación solo se utiliza para obtener confiablemente rebanadas de cerebro sano de animales de cualquier edad y para diversas aplicaciones experimentales.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

En este artículo discutimos tres preparaciones de cerebro utilizadas para la grabación de abrazadera de parche de células enteras a estudiar el circuito retinotectal de los renacuajos de Xenopus laevis . Cada preparación, con sus propias ventajas específicas, contribuye a la maleabilidad experimental de los renacuajos de Xenopus como modelo para el estudio de la función neuronal del circuito.

Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

Aquí, describimos los pasos esenciales para las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) en el segmento de la médula espinal en vitro . Este método permite que las propiedades intrínsecas de la membrana, transmisión sináptica y caracterización morfológica de las neuronas de la SG a estudiar.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Aquí, presentamos protocolos para la preparación de rebanadas cerebrales agudas que contienen el núcleo de geniculado lateral y la investigación electrofisiológica de la función de sinapsis retinogénica y corticogénica. Este protocolo proporciona una manera eficiente de estudiar las sinapsis con la probabilidad de alta y baja liberación en las mismas rebanadas cerebrales agudas.

Investigaciones electrofisiológicas de la función de sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Aprende a obtener registros eléctricos de neuronas piramidales en rebanadas organotípicas de neocórtex de ratas. Este método permite estudiar propiedades neuronales tras transfección genética mediante técnicas de patch-clamp.

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

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