Name: Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprende a purificar células meióticas de testículo de ratón mediante citometría de flujo (FACS) con alta pureza. Este protocolo permite estudiar dinámicas del ciclo celular y perfiles de expresión génica.

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Este proyecto fue apoyado en parte por los dineros del Estado de Florida de Scripps y números premio R01GM085079 R21HD061304 y del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano, respectivamente. Este es el número 20917 manuscrito de The Scripps Research Institute.

Este protocolo se puede separar en dos etapas principales: (1) la disociación y Hoechst 33342 tinción de células de los testículos de ratón seguido, si es necesario, (2) FACS clasificación de las fracciones correspondientes meiótica, incluyendo todas las etapas de la meiosis, las células germinales de espermátidas redondas. Una vez recogidos, estas poblaciones altamente enriquecido meiótica puede ser utilizado para una amplia gama de análisis. Este protocolo describe la disociación de un testículo adulto, los volúmenes se pueden adaptar en consecuencia de los menores o de los testículos adicionales. 1. La disociación testículos <ol><li> Coloque un testículo decapsulated en un tubo de 15 ml. </li><li> Añadir 3 ml de solución salina equilibrada de Gey (GBSS), que contiene 120 U / ml de colagenasa tipo I. </li><li> Añadir 10 l de DNasa I (1mg/ml solución de valores en el 50% de glicerol) y agitar enérgicamente a mano hasta que vea los túbulos testiculares comienzan a disociarse. </li><li> Agitar horizontalmente a un máximo de 120 rpm durante 15 minutos a 33 ° C. </li><li> Se decanta por 1 min vertical a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. </li><li> Repita los pasos 1,2 a 1,5. </li><li> Añadir 2,5 ml de GBSS contiene colagenasa tipo I, 50 l de una solución de reserva 50mg/ml tripsina resuspendido en solución de HCl 1 mM, y 10 l de DNasa I (1mg/ml), e invertir el tubo varias veces. </li><li> Agitar horizontalmente a un máximo de 120 rpm durante 15 minutos a 33 ° C. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur de plástico desechables, con orificio de ancho, pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo por 3 grupos min.No debe ser visible en este momento. </li><li> Añadir 30 l de tripsina, 10 l de DNAsa I, 40 l de Hoechst 33342 resuspendieron en DMSO (10 mg / ml), e invertir el tubo varias veces. </li><li> Agitar horizontalmente a un máximo de 120 rpm durante 15 minutos a 33 ° C. </li><li> Añadir 400 l de suero fetal bovino (FCS) y mezclar invirtiendo para inactivar la tripsina. </li><li> Tinción final se realiza mediante la adición de 50 l de Hoechst 33342 resuspendieron en DMSO (10 mg / ml), y 10 l de DNasa I (1 mg / ml). </li><li> Agitar horizontalmente a un máximo de 120 rpm durante 15 minutos a 33 ° C. </li><li> La muestra de testículo disociada se pasa a través de dos GBSS de 40 micras previamente mojado filtros desechables en un tubo cónico de 50 ml, 5 l de yoduro de propidio (PI) y la solución se añade la muestra se mezcla suavemente con la pipeta varias veces con desechables Pasteur pipeta. </li><li> Muestra es transferida a una jeringa de plástico de 5 ml a través de una aguja de calibre 18. Este último es sustituido por una aguja de calibre 22 para la entrega de la muestra. La jeringa se almacena en hielo y protegido de la luz hasta que esté listo para el procesamiento de FACS. </li></ol> 2. FACS configuración y purificación <ol><li> Clasificación se realizó en un clasificador de Becton-Dickinson Aria celular IIU. Las condiciones descritas por lo tanto, se debe utilizar como punto de partida, especialmente cuando se utilizan equipos diferentes. Hemos utilizado las condiciones anteriormente descritas 7,8. </li><li> Dado que la IIU Aria no tiene un láser UV, adaptamos el protocolo para la detección de manchas Hoescht uso de un láser violeta de 405 nm, además de que utiliza un láser azul 488 nm para la detección de dispersión frontal y lateral. Además, algunos filtros se modificaron con el fin de limitar algunos filtración de láser rojo que resulta en la nitidez mejorada trama dispersa. </li><li> El láser violeta se ha configurado con un pase de banda 450/40nm para la detección de Hoescht azul de emisión y un pase de banda 585/42nm de Hoescht emisión roja. Un pase largo 502nm se utiliza para separar azul de fluorescencia de color rojo. </li><li> Una boquilla de 100 micras se utilizan con una frecuencia de caída de la unidad de 28.000 gotas / segundo. La tasa de umbral de la muestra fue de aproximadamente 4.000 eventos / segundo. La opción de control de la temperatura se utiliza para mantener la muestra y los tubos de recogida a 4 ° C toda la duración de la clasificación. Además, la función de la agitación de la muestra se utilizó a 200 rpm para evitar que la muestra de la sedimentación a lo largo de la clase. </li><li> Por lo general, dos o tres testículos fueron procesados ​​por 6 horas clase que permite la obtención de 0,5-2.0x10 6 células de cada población (véase la sección representativa). </li><li> La muestra fue ordenada en partes alícuotas de aproximadamente 750μl dispensado desde la jeringa. Mientras tanto, durante estas pausas los tubos de recolección se mantuvieron a 4 ° C, protegido de la luz, y se mezclan suavemente antes de ordenar la reanudación. </li><li> Las muestras fueron ordenados en un tubo de recogida de vidrio borosilicatado 12x75mm contiene 250μl DMEM suplementado con 10% FCS. </li></ol> 3. Los resultados representativos: Un típico perfil de FACS se muestra en la Figura 1. Todos los pasos más importantes de la meiosis se identifican y se indican en la leyenda. Si el Hoechst 33342 tinción no es óptimo, el perfil global parece mucho más compacto y menos definida. Un problema común se refiere a que no agrega suficiente DNAsa, lo que induce aglutinación rápida de las células. Además de DNAsa adicional en todos los pasos procesados ​​por lo general resuelve este problema. Congelar ªintimidar las acciones de DNAsa (almacenadas a -20 ° C) debe ser reducido al mínimo, ya que esto da lugar a una rápida pérdida de actividad de la enzima. Spo11 es la endonucleasa meiótica que dirige la doble cadena se rompe en los sitios de sitios de recombinación meiótica 12. La figura 2 muestra los perfiles típicos de un testículo Spo11 nulo en doble capítulo romper no se forman, lo que resulta en una meiosis abortiva 12, así como una pre-puberous perfil de un ratón de 13 días de edad, lo que revela la naturaleza asíncrona de esta primera ola de la meiosis. Estándar de análisis citogenético mediante la combinación de proteínas complejas sinaptonémico 3 (SCP3) y fosforilados anticuerpos histona H2AX etapa de marcadores específicos de la meiosis debe ser utilizado inicialmente para confirmar la pureza y la naturaleza de las células meióticas ordenados, como se describe elswhere 11. <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Tipo salvaje FACS meiosis perfiles. A) diagrama de dispersión se muestra Representante. Las células cerradas se muestran. Tenga en cuenta la gran cantidad de residuos presentes en los testículos adultos que contienen principalmente las membranas vacías y las colas de espermatozoides. B) Un representante parcela PI muestra la cantidad muy limitada de células PI positivas presentes en una muestra. La puerta típica se muestra. C) Un representante de tipo salvaje Hoechst 33342 se muestra el perfil de FACS. Las distintas poblaciones de células meióticas que puede ser purificado mediante este método para el estudio adicional se indican: espermatogonias (E), pre-leptotene (PL), leptotene-zygotene (L / Z), a principios de Paquiteno (PE), el medio Paquiteno ( MP), de finales del Paquiteno (LP), diplotene (D), y espermátidas redondas (RS). <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Spo11 nulo y de tipo salvaje día 13 perfiles FACS meióticas. A) Una típica Spo11 nulo perfil se muestra con un claro fracaso meiótica, donde puede haber más allá de la etapa leptotene / zygotene temprana pachytene detectado. B) El perfil de una de 13 días de edad, de tipo salvaje ratones machos se muestra la alta concentración de células leptotene / zygotene. Esta primera oleada de la meiosis es bastante asíncrono, como claramente se visualizan mediante esta metodología.

<ol><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Purification, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Lassalle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131, 479-487 (2004).</li>
<li>Bastos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+variation+in+human+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of variation in human meiotic recombination.</a> PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).</li>
<li>Roig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TRIP13%2FPCH2+is+required+for+recombination+and+normal+higher-order+chromosome+structure+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis.</a> PLoS Genet. 6, (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+occupancy+landscape+and+dynamics+at+mouse+recombination+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots.</a> EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).</li>
<li>Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Spo11+gene+is+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis.</a> Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).</li>
</ol>

El protocolo presentado en este documento permite purificar al mismo tiempo de ratones machos adultos de toda la gama de las células del estadio meiótico con una pureza muy alta, permitiendo a los investigadores estudiar la dinámica de este proceso fundamental. Células purificadas se pueden utilizar para numerosas aplicaciones que van desde la extracción de RNA 9,10, la cartografía nucleosoma 11, la detección de moléculas recombinantes, análisis de proteína, y muchos más. Sin embargo, los métodos d...

<table><tbody><tr><td>Colagenasa Tipo-1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLSS1</td><td>Disolver hasta 12.000 U/ml en GBSS, almacenar a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Worthington Biochemical</td><td>TRL3</td><td>Disolver en HCl 1 mM hasta 50 mg/ml, almacenar a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Acros Organics</td><td>230001000</td><td>Solución saturada (10 mg/ml en DMSO), almacenar a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNEP</td><td>Disolver en agua/glicerol al 50 % hasta 1 mg/ml, almacenar a -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Solución Salina Equilibrada de Gey&amp;rsquo;s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia de 6&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr></tbody></table>

citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

La naturaleza heterogénea de tipos de células en los testículos y la ausencia de modelos de cultivo celular meiótica se han obstáculos importantes para el estudio de los programas de diferenciación única que se manifiestan durante la meiosis. Dos métodos principales se han desarrollado para purificar, en distintos grados, distintas fracciones meiótica de adultos y animales inmaduros: elutriación o Staput (sedimentación) utilizando BSA y / o gradientes de Percoll. Ambos métodos se basan en el tamaño celular y la densidad para separar las células meióticas 1-5. En general, a excepción de las poblaciones de células pocos 6, estos protocolos no dar suficiente pureza de las poblaciones de células meióticas numerosos que son necesarios para los análisis moleculares detallados. Además, con estos métodos por lo general un tipo de células meióticas puede ser purificado en un momento dado, lo que añade un nivel adicional de complejidad en relación a la reproducibilidad y la homogeneidad en la comparación de muestras de células meióticas. Aquí se describe un método perfeccionado que permite visualizar fácilmente, identificar y purificar las células meióticas, a partir de células germinales de espermátidas redondas, usando FACS combinado con Hoechst 33342 tinción 7,8. Este método proporciona una visión global del proceso meiótico completo y permite purificar altamente células viables de la mayoría de la etapa de la meiosis. Estas células purificadas se pueden analizar en detalle los cambios moleculares que acompañan a la progresión a través de la meiosis, por ejemplo, cambios en la expresión génica 9,10 y la dinámica de ocupación nucleosoma en los hotspots de la recombinación meiótica 11.

Un método eficaz para obtener fracciones altamente purificadas meiótica viables de ratón testículos se describe, que combina un refinado protocolo de disociación celular, con la clasificación de células activadas fluorescentes (FACS). Este método aprovecha las diferencias en el contenido de ADN nuclear y la densidad de las fracciones discretas meióticas.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

La naturaleza heterogénea de los tipos celulares en el testículo y la ausencia de modelos de cultivo de células meióticas han sido obstáculos significativos para el estudio de la ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en purificar simultáneamente y con alta pureza una amplia gama de células mitóticas de testículos de ratón adultos para estudiar los procesos dinámicos que tienen lugar durante este ciclo celular único. Esto se logra disociando eficientemente las células testiculares mediante una serie de digestiones enzimáticas con colagenasa y tripsina en presencia de ADN. Uno para obtener una suspensión de células testiculares individuales como segundo paso.La suspensión turbia se tiñe con el colorante fluorescente vital de ADN 3 33 42 de Hulk, que permite distinguir varios tipos de células mitóticas según su contenido y densidad de ADN. A continuación, las células mitóticas se analizan mediante ordenación de células activada por fluorescencia para identificar y purificar todas las fracciones necesarias para análisis posteriores, como análisis citogenéticos o de expresión génica. Los resultados obtenidos muestran una purificación eficiente de poblaciones de células mitóticas difíciles de obtener, con alta pureza, basada en estudios completos de matrices citogenéticas y de expresión.La principal ventaja de este protocolo basado en hechos frente a métodos existentes como la centrifugación, la filtración o la sedimentación por gravedad es que permite recoger en una sola fracción la mayoría de las fracciones mitóticas con una pureza muy elevada. Las personas nuevas en este método deberán combinar conjuntos de habilidades muy diferentes para realizar una disociación eficiente de las muestras y un procesamiento posterior, seguido de un ordenamiento celular óptimo; también necesitarán buenas interacciones entre la persona que prepara las células y el operador de citometría de flujo, así como una comprensión adecuada de los fundamentos de este protocolo, esencial para el éxito. El protocolo de disociación celular será demostrado por la Dra. I. Gatun, posdoctoranda senior en nuestro laboratorio, quien ha mejorado considerablemente este protocolo.BVN Tores. Nuestro operador de citometría de flujo le guiará a través de una configuración óptima para la clasificación eficiente de células. En este protocolo, se demostrará la disociación de dos testículos de ratón adulto, aunque los volúmenes pueden adaptarse según sea necesario para ratones juveniles o para testículos adicionales.Para comenzar, añada tres mililitros de solución salina balanceada de Gaze que contenga 120 unidades por mililitro de colagenasa tipo uno en el tubo. Una disociación eficiente y completa es crucial para una tinción adecuada y un correcto aislamiento celular. La adición de una cantidad suficiente de G nasa uno, así como la colocación del tubo en posición horizontal durante la agitación, son aspectos muy importantes para lograr una disociación eficiente del tejido testicular. Coloque un testículo encapsulado en un tubo de 15 mililitros.Añada 10 microlitros de ADNasa I al testículo y agite el tubo enérgicamente a mano hasta que observe que los túbulos seminíferos comienzan a disociarse. A continuación, coloque y asegure el tubo horizontalmente en un agitador rotatorio y agite a un máximo de 120 rpm durante 15 minutos a 33 grados Celsius. Transcurridos 15 minutos, decante verticalmente durante un minuto a temperatura ambiente. Luego, use una pipeta desechable para desechar el sobrenadante. Añada tres mililitros de solución salina tamponada con Hanks que contenga colagenasa tipo I, así como 10 microlitros de ADNasa I, a la muestra.Nuevamente, agite el tubo varias veces a mano. Agite el tubo horizontalmente a un máximo de 120 RPM durante 15 minutos a 33 grados Celsius, como antes; luego decante verticalmente durante un minuto a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. A continuación, agregue 2,5 mililitros de GBSS que contenga colagenasa.Añada 50 microlitros de tripsina y 10 microlitros de dase. Invierta el tubo varias veces y agite horizontalmente a un máximo de 120 RPM durante 15 minutos a 33 grados Celsius. Después de la agitación de 15 minutos, utilice una pipeta de plástico desechable con orificio ancho para pipetear suavemente la muestra hacia arriba y hacia abajo durante tres minutos.No deben observarse grumos en este momento. A continuación, agregue 30 microlitros de tripsina, 10 microlitros de DNAs uno y 40 microlitros de Hulks 3 33 42 resuspendidos en DMSO. Invierta el tubo varias veces.Agite horizontalmente a un máximo de 120 RPM durante 15 minutos a 33 grados Celsius. Cuando finalice la agitación de la muestra, añada 400 microlitros de suero de ternero fetal y mezcle invirtiendo el tubo para inactivar la tripsina. Para realizar la tinción final, añada 50 microlitros de hoax 3 33 42 y 10 microlitros de DNAs.Una vez más, agite el tubo horizontalmente a un máximo de 120 RPM durante 15 minutos a 33 grados Celsius. Luego, se pasa la muestra de testículo disociada a través de dos filtros desechables de 40 micrones previamente humedecidos con GBSS hacia un tubo cónico de 50 mililitros. Añada cinco microlitros de solución de yoduro de propidio a la muestra y mezcle suavemente pipeteando varias veces con una pipeta Pasteur desechable.A continuación, transfiera la muestra a una jeringa de plástico de cinco mililitros mediante una aguja de calibre 18. Luego, sustituya la aguja de calibre 18 por una aguja de calibre 22 para la administración de la muestra. Finalmente, guarde la jeringa sobre hielo y protéjala de la luz hasta que la muestra esté lista para el procesamiento por fax.Para este experimento, la clasificación celular se realiza en un área Backin Dixon. Dos, las condiciones del clasificador celular se adaptaron a partir de las utilizadas previamente para un citómetro de flujo equipado con un láser ultravioleta de argón de 360 nanómetros y un láser de argón de 488 nanómetros. En última instancia, el operador del clasificador celular deberá optimizar la configuración del citómetro de flujo.Dado que el Becton Dixon Aria two U no tiene un láser UV, el protocolo para detectar la tinción de hawk se adapta utilizando un láser violeta de 405 nanómetros. Hooks se excita con el láser violeta de 405 nanómetros y se utiliza un láser azul de 488 nanómetros tanto para la excitación de PI como para la detección de dispersión directa y lateral. Además, se modifican los filtros para la detección de hos con el fin de limitar cierta fuga del láser rojo, lo que resulta en una mayor nitidez de los diagramas de dispersión.El láser violeta está configurado con un filtro de paso de banda de 450/40 nanómetros para la detección de emisión azul simulada y un filtro de paso de banda de 585/42 nanómetros para la emisión roja simulada. Se utiliza un filtro de paso largo de 502 nanómetros para separar la fluorescencia azul de la roja. A continuación se muestra la diferencia al usar dos conjuntos de filtros distintos.El filtro de 5 85 42 nanómetros proporciona poblaciones celulares más compactas que el filtro de 6 30 30 nanómetros. Por lo tanto, el operador debe estar preparado para probar diferentes combinaciones en su propio instrumento con el fin de obtener el mejor compromiso. Se utiliza una boquilla de 100 micrones con una frecuencia de impulso de gotas de 28 000 gotas por segundo.La tasa umbral de la muestra es aproximadamente de 4.000 eventos por segundo con un caudal entre uno y tres para mantener una mayor resolución. Ordene la muestra en alícuotas de aproximadamente 750 microlitros dispensados desde la jeringa. Durante estas pausas, mantenga la muestra restante en la jeringa sobre hielo y protegida de la luz. Recoja las muestras ordenadas en tubos de recolección de vidrio Borislav de 12 por 75 milímetros que contienen 250 microlitros de DMEM suplementado con 10% FCS.Para mantener la muestra en los tubos de recolección a cuatro grados Celsius, utilice la opción de control de temperatura durante toda la duración del ordenamiento. Además, utilice la función de agitación de la muestra a 200 RPM para evitar que la muestra se sedimente durante todo el proceso de ordenamiento. Cada vez que se añada una alícuota de la muestra principal, es importante agitar ligeramente los tubos de recolección para mantener la integridad de las células recolectadas.Se muestran aquí perfiles representativos de hechos donde todos los pasos principales de la meiosis de tipo salvaje se identifican en este gráfico de dispersión en el que se indican las células seleccionadas por compuerta; existe una gran cantidad de detritos que contienen principalmente membranas vacías y colas de espermatozoides presentes en los testículos adultos. Un gráfico representativo de yoduro de propidio muestra una cantidad muy limitada de células positivas para yoduro de propidio presentes en la muestra. El patrón típico se indica en este perfil representativo de tipo salvaje hoax 3 33 42 fax.Las diversas poblaciones celulares meióticas que pueden purificarse mediante este método para su posterior estudio son: espermatogonias, preleptoteno, leptoteno, zigotenos, paquiteno, diplotenos y espermátidas redondas. Estos dos últimos perfiles proceden de un testículo SPO11−/− y de un testículo de tipo salvaje de ratones de 13 días de edad. SPO11 es la endonucleasa meiótica que dirige los cortes de doble cadena hacia los sitios de puntos calientes de recombinación meiótica, y, como se observa aquí, la ausencia de SPO11 da lugar a un claro fracaso meiótico, ya que no puede detectarse ninguna etapa posterior al leptoteno, zigoteno o paquiteno temprano.En contraste, el perfil de un ratón macho de tipo silvestre de 13 días muestra una alta concentración de células zigóticas de leptina. Esta primera oleada de meiosis es bastante asincrónica, como se visualiza claramente. Al utilizar esta metodología, mientras se realiza este experimento, es importante usar una cantidad suficiente de ADN.La ciudad central permite una clasificación sin problemas. Aunque inicialmente los investigadores son reacios a utilizarla, la adición de ADN reducirá la viscosidad de la muestra y mejorará la separación y tinción de las células, además de que las células intactas no resultarán dañadas. El método FOX para aislamiento de células somáticas puede emplearse en una amplia gama de aplicaciones posteriores, como, por ejemplo, la extracción de ADN-ARN para estudiar la dinámica de la expresión génica, o para la técnica de inmunoprecipitación de cromatina con el fin de establecer diversos perfiles epigenéticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Citometría de flujo basado Purificación de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Los cigotos

Se describe un nuevo protocolo para la preparación mecánica de suspensiones de células testiculares de material de roedor, evitando enzimas y detergentes,. El método es muy simple, rápido, reproducible, y hace que las suspensiones de células de buena calidad, que son adecuados para la clasificación de flujo y la extracción de RNA.

Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares

Describimos una estrategia de clasificación para espermátidas de ratón utilizando citometría de flujo. Las espermátidas se clasifican en cuatro poblaciones de alta pureza, que incluyen espermatidas redondas (pasos 1-9 de espermiogénesis), de elongación temprana (pasos 10-12 de espermiogénesis), de elongación tardía (pasos 13-14 de espermiogénesis) y elongadas (pasos 15-16 de espermiogénesis). La tinción, el tamaño y la granulosidad del ADN se utilizan como parámetros de selección.

-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

Se presenta un protocolo mediante el uso de células activadas por fluorescencia para aislar las células dendríticas plasmacitoides (PDC) con alta pureza a partir de la médula ósea de ratones propensos al lupus para los estudios funcionales de PDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Este trabajo describe la estandarización de un método para obtener poblaciones de células germinales purificadas de tejido testicular de diferentes especies de mamíferos. Es un protocolo directo que combina la disociación mecánica de los testículos, la tinción con Hoechst-33342 y el yoduro de propidio, y la clasificación FACS, con amplias aplicaciones en estudios comparativos de la biología reproductiva masculina.

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Este artículo ilustra un método eficaz para cuantificar las mitocondrias o lisosomas en las células vivas. La combinación de tintes específicos lisosomas o las mitocondrias con fluorescente conjugados anticuerpos contra marcadores de superficie permite la cuantificación de estos orgánulos en poblaciones de mezclado de la célula, como células primarias extraídas muestras de tejido, mediante el uso de Citometría de flujo multicolor.

Cuantificación de basados en citometría de flujo multicolor de las mitocondrias y los lisosomas en las células T

Aquí se presenta un protocolo para enriquecer los espermacitos de paquiteno, espertáidos redondos y elongafines espermatíides de testículos de ratón adultos utilizando un gradiente discontinuo de densidad de albúmina sérica bovina con equipo de laboratorio estándar.

Enriquecimiento de espermaocitos y espermatídos de los testículos de ratón que utilizan equipos de laboratorio estándar

Aquí presentamos un método simple y eficiente para aislar células germinales meíticas y post-meyóticas vivas de los testículos de ratón adultos. Usando un tinte de unión de ADN excitado por violeta y clasificación celular activada por fluorescencia, se pueden aislar poblaciones de células espermatogénicas altamente enriquecidas para muchas aplicaciones posteriores.

Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Aquí, describimos un nuevo método citométrico de flujo para el aislamiento prospectivo de progenitores eritroides unitarios formadores de ráfagas tempranas (BFU-e) y eritroides unitarios formadores de colonias (UFC-e) directamente de médula ósea y bazo de ratón frescos. Este protocolo, desarrollado en base a datos transcriptómicos unicelulares, es el primero en aislar todos los progenitores eritroides del tejido con alta pureza.

Identificación y aislamiento de progenitores eritroides de unidades formadoras de ráfagas y unidades formadoras de colonias a partir de tejido de ratón mediante citometría de flujo

Para obtener pericitos corticales cerebrales de ratón que cumplan con las demandas del scRNA-seq, presentamos un protocolo FACS críticamente optimizado basado en la selección CD13⁺/CD31⁻. Nuestros refinamientos clave mejoran significativamente la viabilidad celular y la integridad del ARN, permitiendo un perfil transcriptómico fiable.

Aislamiento de pericitos de tejido cortical de ratón usando FACS para secuenciación unicelular

Aprende a purificar células meióticas de testículo de ratón mediante citometría de flujo (FACS) con alta pureza. Este protocolo permite estudiar dinámicas del ciclo celular y perfiles de expresión génica.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

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