Name: Inyección de sangre autóloga al modelo hemorragia intracerebral espontánea en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprende a modelar hemorragia intracerebral espontánea en ratones mediante inyección estereotáctica de sangre autóloga en los ganglios basales. Este método permite estudiar patología cerebral y déficits neurológicos in vivo.

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El trabajo fue financiado por una beca del Instituto de Medicina Traslacional y Terapéutica, y una beca de formación del Instituto de Medicina e Ingeniería (T32HL007954) de la Universidad de Pennsylvania y la Marlene L. Cohen y Jerome H. Fleisch Académico Grant en la Universidad de Connecticut Health Center (LHS) y NIH NS-029331 (FAW).

1. Preparación del equipo <ol><li> Limpie el marco estereotáxico y la bomba con el 75% de etanol para minimizar la contaminación bacteriana. </li><li> Esterilizar la jeringa y la aguja Hamilton silicio fundido. Nota: Si la esterilización química se utiliza, asegúrese de enjuagarse varias veces con agua estéril antes del uso. </li><li> Limpie la superficie de papel de cera de parafina con un 75% de etanol y dejar secar. </li></ol> 2. Preparación de ratón para la inyección Nota: Tenga ratones entregado a su instalación de animales al menos 7 días antes de la cirugía para permitir que se aclimate al nuevo ambiente y reducir el estrés. <ol><li> Pesar del ratón para la pre-operatoria de referencia. </li><li> Inducir la anestesia con un 30% de oxígeno, 70% de óxido nitroso, y el 4% isoflurano hasta que no responden a pellizcar la cola </li><li> Inyectar al ratón con buprenorfina 0.1mg/kg por vía intraperitoneal para la analgesia postoperatoria </li><li> Afeitarse el cuero cabelludo </li><li> Los ojos con agua estéril capa de vaselina </li><li> Preparar el cuero cabelludo con betadine x 3 paños, y luego permitir que se seque el cuero cabelludo </li><li> Haga una incisión sagital cm la línea media del cuero cabelludo con bisturí quirúrgico estéril Nota: Se hace una incisión generosa permitirá la exposición completa de los hitos del cráneo. </li><li> Afeitado 1 cm de la superficie ventral de la cola a partir del 1 cm de base y preparar con betadine x 3 toallitas </li><li> Coloque el ratón sobre el marco estereotáxico Nota: Es importante asegurarse de ratón está seguro en el marco de la superficie del cráneo es paralela a la base de la estructura, con una excelente exposición de bregma y por lo menos 3 mm a la derecha del bregma. </li></ol> 3. Cirugía de la hemorragia intracerebral Notas: Durante toda la cirugía del ratón se anestesia con un 30% de oxígeno, 70% de óxido nitroso, y el 1-3% de isoflurano, continuamente mantiene a 37 ± 0,5 ° C con una resistencia térmica controlada almohadilla térmica y control de un termómetro rectal. <ol><li> Coloque la aguja estéril 27 g en una jeringa de 1 cc en el marco. </li><li> Ajuste el brazo hasta que la aguja estereotáxica es exactamente más de bregma. </li><li> Ajuste el brazo para que la aguja está en 2,5 mm lateral a bregma e inferior a la superficie del cráneo. </li><li> Gire manualmente la jeringa para trepanación del cráneo en la superficie mientras se aplica el movimiento suave hacia abajo de la atención marco de la toma de no perforar el cráneo por completo. </li><li> Se retira la aguja y el agujero de trépano completo manual con jeringa / aguja Nota: Completar el agujero de trépano a mano permite el reconocimiento inmediato cuando haya perforado la tabla interna del cráneo y minimiza el riesgo de empujar inadvertidamente la aguja en el parénquima cerebral. </li><li> Realice una incisión transversal en la superficie ventral de la cola con hoja de bisturí estéril y dejar 2-3 gotas grandes de sangre arterial a caer en el papel de cera de parafina. Entonces, rápidamente, detener el sangrado con presión con una gasa estéril. </li><li> Retirar 17 l de sangre en la jeringa y una jeringa Hamilton lugar en la bomba. </li><li> Ajuste el brazo estereotáxica a punto 5 ° medialmente con relación al eje vertical. </li><li> Ajuste cuidadosamente el brazo estereotáxica manera que la punta de la aguja sobre el agujero de trépano en el cráneo y luego baje la aguja 3,5 mm. </li><li> Espere 2 minutos y luego retirar la aguja de 0,5 mm (de modo que la punta es de 3 mm de profundidad) </li><li> Espere 5 minutos para permitir que el cerebro se expanda de nuevo alrededor de la aguja y minimizar el riesgo de reflujo de sangre por el camino de inserción de la aguja durante la inyección. </li><li> Inyectar sangre 1 l / min para 7,5 mL. </li><li> Esperar 5 minutos para permitir que la sangre inicial de coagulación y para los turnos de los tejidos que se produzcan para minimizar las elevaciones de la presión intracraneal. </li><li> Inyectar el restante 7,5 l de 1 l / minuto </li><li> Permita que la aguja permanezca en su lugar durante 25 minutos para permitir la coagulación de la sangre Nota: Si no espera por coagulación de la sangre se traducirá en la sangre de reflujo hasta el sitio de inserción de la aguja al retirar la aguja </li><li> Lentamente retire la aguja e inmediatamente enjuague con agua caliente para evitar que restos de sangre en la aguja de la coagulación y de garantizar la reutilización de agujas. </li><li> Quitar el ratón de la estructura y cerca de la cola y las incisiones del cuero cabelludo con pegamento quirúrgico veterinario. </li><li> Apague la anestesia. </li><li> Dejar el ratón para despertar mientras se calienta continuamente con libre acceso al alimento humedecido. </li><li> Volver a la jaula del ratón con la camada cuando esté completamente despierto. Lugar húmedo comida de pellets en la parte inferior de la jaula para ayudar a los animales en el acceso a los alimentos. </li></ol> 4. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2618/2618fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Sección coronal de cerebro de ratón 15 minutos después de la cirugía de la ICH. Inmediatamente después del sacrificio del cerebro fue examinado por el éxito ICH basado en la inspección macroscópica de un corte coronal en el sitio de inserción de la aguja. Hemorragias que dio seguimiento a la base del cerebro, el trayecto de la aguja más allá del cuerpo calloso, o en los ventrículos se considerará fracasada y que el ratón fue eliminado de todos los análisis. En general succe ICHlas tasas de las SS fueron 75-85% en 50 ratones con 0% de mortalidad. <img src="/files/ftp_upload/2618/2618fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Prueba de la Figura 2. Cilindro demuestra hemiparesia izquierda después de ICH derecho de los ganglios basales. (A) muestra parte trasera del ratón después de la cirugía ICH. Tenga en cuenta la colocación de la extremidad anterior derecha sólo en la pared del cilindro después de ICH izquierda los ganglios basales. (B) Gráfico de las pruebas de un cilindro de resultados de la cohorte de ratones después de la cirugía de la ICH (n = 5) en comparación con el tratamiento simulado (n = 4). Ratones Sham había todos los procedimientos, excepto la inyección de sangre (aguja se inserta en el cerebro). Cada ratón fue colocado en un cilindro de vidrio de 12 cm de diámetro interior y observaron durante 20 traseros. La colocación inicial de los miembros anteriores de la pared del cilindro fue anotado por detrás. Los movimientos posteriores (como la exploración lateral) no se obtuvo hasta que el ratón volvió a la tierra y anotó la parte trasera que viene. El índice se calcula como la lateralidad (# ubicaciones adecuadas extremidad anterior en el lado del cilindro - # izquierda colocaciones extremidad anterior) / (# + # derecha izquierda + # ambos), donde 0 indica ninguna preferencia patas delanteras y 1 indica que sólo la extremidad anterior derecha se utilizó .

<ol><li>Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Tests+After+Intracerebral+Hemorrhage+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat.</a> Stroke. 33, 2478-2484 (2002).</li>
<li>James, M., Warner, D., Laskowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Models+of+Intracerebral+Hemorrhage%3A+A+Translational+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocritical+Care%22%5BJournal%5D)">Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective.</a> Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).</li>
<li>Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Model+of+Warfarin-Associated+Intracerebral+Hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage.</a> Stroke. 39, 3397-3404 (2008).</li>
<li>Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+hemorrhage+in+mice%3A+model+characterization+and+application+for+genetically+modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).</li>
<li>Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+intracerebral+hemorrhage+using+autologous+blood+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion.</a> Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).</li>
<li>Wang, J., Fields, J., Doré, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+an+improved+preclinical+mouse+model+of+intracerebral+hemorrhage+using+double+infusion+of+autologous+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood.</a> Brain Research. 1222, 214-221 (2008).</li>
<li>Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoma+resolution+as+a+target+for+intracerebral+hemorrhage+treatment%3A+Role+for+peroxisome+proliferator-activated+receptor+%CE%B3+in+microglia%2Fmacrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages.</a> Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este modelo quirúrgico de la hemorragia intracerebral en ratones utilizando autólogo cola resultados sanguíneo de la arteria en un modelo reproducible de la hemorragia espontánea ganglios basales. Un modelo en ratones ICH ofrece la ventaja de la disponibilidad de animales transgénicos para investigar la fisiopatología, sin embargo, su pequeño tamaño hace que los procedimientos neuroquirúrgicos técnicamente más difícil que en los animales más grandes. El modelo de la colagenasa y el modelo de...

Marco estereotáxico para neurocirugía del ratón (Stoelting, 51.925) Microinfusión bomba y el procesador (UMP-3 y Micro4, Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL) Ratón más caliente (Stoelting, 50300) La anestesia por inhalación del ratón (Braintree Scientific, EZ-AF9000) 25 l herméticas borosilicato Hamilton jeringa con el émbolo y la aguja no recubierto (Compañía de Hamilton, Reno, NV, una jeringa 1702RN: 765401, férula: 30949, separador: 30946) aguja de sílice fundida cortar a la longitud de 2 cm (Hamilton, 17739) * Nota Hamilton jeringa y la aguja de sílice fundida se pueden reutilizar para múltiples cirugías si esterilizar antes de cada cirugía. Estos materiales son cruciales para evitar la coagulación de la sangre. Guantes quirúrgicos estériles Bata, gorro y mascarilla Betadine 75% de etanol 27 g de agujas estériles (de un solo uso) estéril de 1 cc jeringa (de un solo uso) hoja de bisturí estéril Cidex agua estéril buprenorfina y el isoflurano gasa estéril cuadrados de papel de cera de parafina Pegamento quirúrgico veterinario (Vetbond, 3M, St. Paul, MN)

inyección de sangre autóloga al modelo hemorragia intracerebral espontánea en ratones

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

La investigación de la fisiopatología de la lesión tras una hemorragia intracerebral (ICH) requiere un modelo animal reproducible. Aunque la ICH representa entre el 10 y el 15 % de todos los accidentes cerebrovasculares, aún no existe una terapia específica eficaz. El modelo de inyección autóloga de sangre en ratones implica la inyección estereotáxica de sangre arterial en los ganglios basales, imitando una hemorragia espontánea hipertensiva en el ser humano. Luego se puede estudiar in vivo la respuesta a la hemorragia y cuantificar los déficits neuroconductuales, lo que permite describir la patología resultante y evaluar posibles agentes terapéuticos. El procedimiento descrito en este protocolo utiliza la técnica de doble inyección para minimizar el riesgo de reflujo de sangre por el trayecto de la aguja, no emplea anticoagulantes en el sistema de bombeo y elimina todo espacio muerto y tubos expansibles en el sistema.

El modelo de inyección de sangre autóloga de la hemorragia intracerebral en ratones descritos en este protocolo se utiliza la técnica de doble inyección para minimizar el riesgo de reflujo de sangre hasta el trayecto de la aguja, no los anticoagulantes en el sistema de bombeo, y elimina todo el espacio muerto y el tubo extensible en el sistema.

Inyección de sangre autóloga al modelo hemorragia intracerebral espontánea en ratones

La investigación de la fisiopatología de la lesión tras una hemorragia intracerebral (HIC) requiere un modelo animal reproducible. Si bien la HIC representa entre el 10 y el 15% ...

El objetivo general de este procedimiento es modelar la hemorragia intracerebral espontánea en el ratón para estudiar in vivo la patología persistente y los resultados neuroconductuales. Esto se logra primero preparando al ratón para la cirugía. Se afeita y limpia la cola ventral y el cuero cabelludo.A continuación, utilizando los puntos de referencia del cráneo, se realiza un orificio de trepanación exactamente colocado a través del cráneo. En tercer lugar, se extrae sangre de la arteria de la cola y se inyecta estereotácticamente en los ganglios basales. Luego se retira cuidadosamente la aguja de inyección y se cierra la incisión.En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren inflamación localizada, muerte celular y déficit neurológico mediante inmunohistoquímica, citometría de flujo y pruebas funcionales, entre otros métodos. En general, los investigadores nuevos en el procedimiento tendrán dificultades con la coagulación sanguínea, ya que la pequeña cantidad de sangre inyectada se coagulará en el sistema durante el tiempo que tarda en realizarse la inyección. Después de inducir la anestesia con isoflurano, afeite el cuero cabelludo y limpie la piel con Betadine

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Modelos animales clínicamente relevante de hemorragia intracerebral (HIC) son necesarios para profundizar en el conocimiento de accidente cerebrovascular hemorrágico y examinar nuevas estrategias terapéuticas. En este estudio, se describe y evaluar dos modelos que implementan ICH inyecciones unilaterales de sangre autóloga o bien total o colagenasa bacteriana en los ganglios basales (corpus striatum) de ratones.

Modelado Hemorragia intracerebral en ratones: La inyección de sangre autóloga o colagenasa bacteriana

Este video muestra el procedimiento para establecer un modelo de rata con hemorragia subaracnoidea. A una rata anestesiada se le implantan sondas para medir la presión intracraneal y el flujo sanguíneo cerebral. Se identifica el sitio objetivo y se inserta la aguja en una posición prequiasmática. A continuación, se inyecta sangre autóloga en el espacio subaracnoideo, aumentando la presión intracraneal y disminuyendo el flujo sanguíneo cerebral, estableciendo el modelo.

Establecimiento de un modelo de rata con hemorragia subaracnoidea inducida por inyección de sangre autóloga

Fuente: Tang, X. et. al., Hemorragia Pontina Masiva por Inyección Dual de Sangre Autóloga. J. Vis. Exp. (2021)Este protocolo describe la infusión controlada de sangre autóloga en la región pontina del cerebro de una rata para modelar una hemorragia pontina masiva. El propósito es simular una hemorragia cerebral localizada mediante el aumento de la presión localizada.

Inducción de una hemorragia pontina masiva en un modelo de rata mediante inyección de sangre autóloga

Un modelo de ratón estándar de la hemorragia subaracnoidea por el Círculo de Willis intraluminal perforación se describe. Perforación de vasos y hemorragia subaracnoidea son monitoreados por el monitoreo de la presión intracraneal. Además diversos parámetros vitales se registran y se controlan para mantener las condiciones fisiológicas.

Un modelo murino de hemorragia subaracnoidea

Se utilizan modelos preclínicos de hemorragia intracerebral para imitar ciertos aspectos de la enfermedad clínica. Por lo tanto, se pueden explorar los mecanismos de lesión y las posibles estrategias terapéuticas. En este protocolo se describen dos modelos de hemorragia intracerebral, inyecciones intraestriadas (ganglios basales) de sangre autóloga o colagenasa.

Inyección intraestriatal de sangre autóloga o clostridial colagenasa como modelos murinos de la hemorragia intracerebral

Describimos en este protocolo un modelo estandarizado de hemorragia subaracnoidea (SAH) mediante una doble inyección de sangre entera autóloga en la cisterna magna. El alto grado de estandarización del procedimiento de doble inyección representa un modelo de media a aguda de SAH con relativa seguridad con respecto a la mortalidad.

Doble inyección directa de sangre en la Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnoidea

Presentamos un protocolo para establecer un modelo masivo de la hemorragia del pontine en una rata vía la inyección dual de la sangre autóloga.

Hemorragia pontina masiva por inyección dual de sangre autóloga

La hemorragia subaracnoidea sigue conllevando una alta carga de mortalidad y morbilidad en el hombre. Para facilitar la investigación adicional sobre la condición y su fisiopatología, se presenta un modelo pre-quiasmático de inyección única.

Inyección única prequiasmática de sangre autóloga para inducir hemorragia subaracnoidea experimental en un modelo de rata

La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo que resulta de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en el sistema nervioso central, causando defectos de locomoción. Rotenona modelos de la enfermedad de Parkinson en Drosophila. Este documento describe dos ensayos que caracterizan a las deficiencias de locomoción tanto espontáneos como inducidos por el sobresalto causado por la rotenona.

Métodos para caracterizar espontánea y de sobresalto-inducida Locomotion en un modelo de enfermedad de Parkinson inducida por rotenona-de<em&gt; Drosophila</em

Aquí se describe un método para el establecimiento de un modelo de microcefalia inducida por virus Zika en ratón. Este protocolo incluye métodos para embrionario, neonatal y adulto etapa inoculación intracerebral del virus Zika.

Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto

Aprende a modelar hemorragia intracerebral espontánea en ratones mediante inyección estereotáctica de sangre autóloga en los ganglios basales. Este método permite estudiar patología cerebral y déficits neurológicos in vivo.

Inyección de sangre autóloga al modelo hemorragia intracerebral espontánea en ratones

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