Ensayo in vivo del canino función muscular

El objetivo general de este procedimiento es medir y caracterizar las propiedades mecánicas de los músculos de las extremidades traseras en el perro vivo mediante métodos no invasivos. Esto se logra primero posicionando adecuadamente al perro en el equipo de fisiología. El segundo paso del procedimiento consiste en medir y registrar el torque isométrico del espasmo y el torque tibiotarsiano flexor tónico.

El tercer paso del procedimiento consiste en realizar contracciones excéntricas. El paso final del procedimiento es medir y registrar el impulso isométrico, el par y el par tetánico durante la extensión tibio-tarsiana. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la fuerza muscular de la extremidad trasera y la respuesta a contracciones excéntricas repetidas mediante un método fisiológico no invasivo.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los ensayos de músculo aislado ex vivo, que son estudios terminales, es que el método utilizado aquí puede repetirse a lo largo del tiempo porque es no invasivo y bien tolerado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología muscular, como la respuesta del músculo a lesiones inducidas por contracción o a la fatiga. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento o diagnóstico de distrofias musculares, ya que el método mide la función muscular en perros u otros mamíferos grandes.

Se requieren animales de este tamaño en estudios preclínicos de muchas terapias nuevas antes de los ensayos clínicos y su uso en pacientes. Aunque este método puede ofrecer información sobre modelos caninos, también puede aplicarse a otros sistemas de modelos animales, como primates no humanos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al cuidado necesario al colocar los electrodos de estimulación y al conocimiento de lo que se debe esperar de los trazos de torque. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de colocación de los electrodos son difíciles de aprender debido a la precisión requerida para obtener la respuesta máxima de torque de los músculos.

Bajo estudio, se utilizan dos protocolos escritos en el software de control muscular dinámico o DMC para definir los parámetros de estimulación y registro de datos. El primer protocolo, el protocolo de contracción isométrica, se emplea tanto para las contracciones de espasmo como para las contracciones tetánicas. El segundo protocolo, denominado protocolo de lesión por estiramiento excéntrico, se utiliza para las contracciones excéntricas. La configuración del estimulador y las secuencias de software empleadas para cada protocolo se indican en la tabla mostrada aquí; las contracciones de espasmo se provocan mediante una estimulación de un hercio.

Las contracciones títonas y excéntricas se provocan mediante una estimulación de 50 hercios. En el caso de la contracción excéntrica, se superpone un estiramiento al músculo en contracción. Estos experimentos consisten en provocar varios tipos de contracciones musculares, estimulando el nervio peroneo para obtener contracciones títonas, o excéntricas, de un músculo flexor, y estimulando el nervio tibial para provocar contracciones títonas o títonas de un músculo extensor.

Después de anestesiar al perro, verifique el reflejo palpebral para asegurarse de que el animal esté profundamente anestesiado. Monitoree cuidadosamente el dióxido de carbono, la oximetría de pulso y la temperatura. Durante el procedimiento, afeite el pelo en la rodilla lateral donde se colocarán los electrodos estimulantes.

A continuación, coloque al perro sobre la mesa de fisiología. Coloque la extremidad pélvica en posición recumbente dorsal de modo que el fémur y la tibia formen un ángulo recto, y la tibia esté paralela a la superficie de la mesa. Verifique que el pedal de fuerza pueda girar con seguridad. Debe sentirse rígido cuando se mueve manualmente.

A continuación, encienda el equipo de fisiología y active el pedal. El movimiento del pedal está controlado por el motor servo, el cual es regulado por la computadora. Ahora, coloque suavemente la pata del perro sobre el medidor del pedal y registre la longitud de la pata del perro desde el eje central de rotación hasta el extremo del dedo lateral.

Luego sujete la pata del perro en el pedal con una venda elástica autoadherente. El transductor en el pedal registra la fuerza de las contracciones musculares de la pata. Configure los electrodos de estimulación conectando los electrodos monopolar blindados de calibre 24 a la unidad de aislamiento del estímulo.

Con las manos enguantadas, limpie la piel del perro con alcohol y palpe el nervio peroneo común justo distal al peroné proximal lateral con un dedo marcando la zona del nervio; inserte cuidadosamente el electrodo catódico negro bajo la piel y coloque el electrodo anódico rojo bajo la piel, justo externo al periostio, paralelo y ligeramente distal al electrodo catódico. Ambos electrodos deben quedar ahora internos al nervio peroneo común, justo distal a la cabeza del peroné. A continuación, active el estimulador a un hercio y observe la respuesta de contracción en el monitor.

Realice pequeños ajustes en las posiciones de los electrodos según sea necesario para obtener la mayor amplitud posible del espasmo muscular. Una vez que los electrodos estén bien posicionados, active el software DMC para registrar una respuesta de espasmo. El siguiente paso consiste en provocar una contracción tónica sin mover los electrodos.

Configure el estimulador según lo especificado en la tabla para una contracción tética. Luego active el protocolo de contracción isométrica en el software para generar una contracción tética isométrica del músculo. El siguiente experimento, el protocolo de lesión por estiramiento excéntrico, también se realiza sin mover los electrodos.

Configure el estimulador para una contracción excéntrica e inicie la estimulación. En este protocolo, el nervio se estimula 10 veces a 50 hercios durante un segundo. Durante ese segundo, los músculos flexores se contraen isométricamente durante los primeros 800 milisegundos, y luego el músculo se estira durante los últimos 200 milisegundos.

Después de un conjunto de 10 contracciones excéntricas, permita que el músculo descanse durante cuatro minutos. Luego, repita el protocolo de lesión por estiramiento excéntrico otras dos veces, con un descanso de cuatro minutos entre cada serie para estimular el músculo extensor. Mueva los electrodos al nervio tibial insertando los electrodos perpendicularmente a la piel y proximal a la colocación original de los electrodos utilizada para la flexión. El punto aproximado de colocación se encuentra a lo largo de una línea que biseca el ángulo de 90 grados formado por la rodilla.

El nervio tibial se encuentra más profundo y adyacente al nervio peroneo común. Mueva los electrodos según sea necesario para provocar potenciales de contracción óptimos. Una vez que los electrodos estén colocados, provoque una contracción máxima utilizando el protocolo isométrico sin mover los electrodos.

Cambie la configuración del estimulador según lo especificado para las contracciones téticas. Luego active y registre una contracción tética del músculo extensor tibio-tarsiano. Se utiliza el programa de análisis muscular dinámico o DMA para analizar el par y la información temporal de las contracciones musculares.

En esta figura, la estimulación del nervio tibial a un hercio activó contracciones individuales de los músculos extensores tibiales del tarso para el análisis de datos; las posiciones de los tres cursores se establecen de la siguiente manera. El cursor azul se coloca en el punto donde el par comienza a aumentar desde el par en reposo. El cursor amarillo se sitúa donde el par regresa al valor de reposo.

Después de la fase de relajación, el cursor blanco no es necesario y por lo tanto se coloca a la derecha del cursor amarillo. Esta figura muestra la estimulación isométrica de torque titánica del nervio tibial con un tren de 1,5 segundos de pulsos de 50 hertz, lo que resultó en una contracción tetánica del músculo extensor tarsal tibial. Para el análisis de datos, se colocan los cursores azul y amarillo.

En cuanto al análisis del espasmo en esta figura, se indujeron contracciones excéntricas en los flexores tibiales tarso. La estimulación percutánea del nervio perineal activó una contracción isométrica inicial durante 800 milisegundos, momento en el cual se impuso un estiramiento forzado sobre la pata. Para este análisis de datos, el cursor azul se coloca en el punto donde el par isométrico comienza a aumentar a partir del par en reposo.

El cursor amarillo se coloca en el punto donde el par de torsión del estiramiento excéntrico comienza a aumentar desde la meseta isométrica. El cursor blanco se coloca donde el par de torsión regresa al par de reposo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar un protocolo impreso con puntos de control paso a paso siguiendo este procedimiento.

Otros métodos, como las biopsias musculares, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como el tipo de fibra muscular o la expresión del transgén después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología muscular exploraran las respuestas al ejercicio en caninos con distrofia muscular. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo no invasivo de fisiología muscular en caninos.