La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar y cuantificar la señalización de BMP en células de cultivo de tejidos. Las BMP se unen a los receptores en la superficie celular y FOSFOLATO tres, efectores smad, smad uno, smad cinco y SMAD ocho. Estos forman complejos con smad four y se translocan al núcleo donde orquestan la transcripción.

Aquí utilizamos PLA para visualizar los complejos que se forman entre los efectores endógenos de SMA y smad four en células de cultivo de tejidos con o sin estimulación BMP. Esto comienza con el uso paralelo de dos anticuerpos primarios, uno de los cuales reconoce los tres efectores fosforilados, smma, y el otro de los cuales reconoce cuatro anticuerpos secundarios llamados sondas de PLA, cada una con una hebra de ADN corta única unida a ella, se une a los anticuerpos primarios donde las sondas de PLA están muy próximas. Las hebras de ADN interactúan a través de una adición posterior de dos círculos formando oligonucleótidos de ADN.

Estos se unen mediante ligadura enzimática y forman un círculo que se amplifica a través de la replicación del círculo rodante después de la reacción de amplificación. La hibridación de sondas de oligonucleótidos complementarios marcados pone de manifiesto el producto de puntos fluorescentes asociados a la amplificación de cada una de ellas. Los productos de ADN son fácilmente visibles.

Cuando se observan bajo un microscopio de fluorescencia, las manchas corresponden a complejos entre efector, seds y smad cuatro, que significan la señalización activa de BMP en la célula. Las principales ventajas del PLA sobre los métodos existentes es que es fácil de usar, altamente sensible y sin antecedentes, y se puede utilizar para cuantificar la señalización activa de BMP in situ. La vía BMP es esencial para el desarrollo de varios órganos y tejidos y para procesos como la proliferación y diferenciación de células madre.

El PLA se puede utilizar para abordar preguntas clave sobre la dinámica de señalización de BMP, los niveles y la localización subcelular, pero también se puede utilizar para el diagnóstico. Debido a que esta vía subyace a varias enfermedades, el BLA se puede utilizar para estudiar otros componentes de la transacción de señales de la BMP u otras vías y se puede adaptar para trabajar en secciones de tejido o embriones completos. Para comenzar el ensayo de ligadura de proximidad in situ, prepare los cultivos celulares Neuro se cultivan dos células A en GMEM suplementadas con 10% de FBS, una vez piruvato y una vez L glutamina.

Divida las celdas con tripsina y coloque de 15.000 a 20.000 células por pocillo. En un portaobjetos de 16 pocillos, incube las células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante 24 horas. Después de 24 horas.

Reemplace el medio de cultivo con GMEM suplementado sin suero e incube durante dos o tres horas más para los controles. Mantenga tres pocillos con células en condiciones normales de cultivo y después de la segunda incubación. Inhibir la vía BMP mediante el tratamiento de las células con morfina dorsa de dos micromolares o inducir la señalización mediante el tratamiento de las células con BMP cuatro durante 10 a 60 minutos.

Después de la estimulación celular, aspire el medio de los pocillos y lave suavemente las células con PBS para evitar el desprendimiento celular. No pipetee el PBS directamente sobre las células. A continuación, aspire el PBS y retire las cámaras, pero deje el silicio alrededor de los pocillos.

Añadir 50 microlitros de formaldehído al 4%, recién preparado y filtrado, a los pocillos e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitar. Después de la fijación, lavar las células con PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación en un frasco de copin. Repita el lavado dos veces para un total de tres lavados.

A continuación, permear las células con 0,5%Triton X 100 en PBS en un frasco de copin e incubarlas durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. A continuación, lavar las células con 0,05%tween 20 y TB S3 veces durante cinco minutos por lavado con agitación en un frasco de acoplamiento. Inicie el procedimiento de bloqueo golpeando la corredera para eliminar la solución de lavado final.

Tenga cuidado de no permitir que las células se sequen. Agregue una gota de enlace DUO a la solución de bloqueo a cada uno. Incubar bien las células en solución de bloqueo durante 30 minutos a 37 grados centígrados en una cámara humidificada precalentada que consiste en una caja de punta de pipeta vacía con agua destilada.

Para preparar las soluciones de anticuerpos primarios, diluya anti phospho smad 1, 5, 8 y anti SMAD cuatro de uno a 100 en diluyente de anticuerpos de enlace dúo dos. Use cada anticuerpo solo y en combinación. Ahora golpee el portaobjetos para eliminar la solución de bloqueo del portaobjetos y agregue 40 microlitros de las soluciones de anticuerpos a los pocillos apropiados y solo se puede incluir el control negativo con diluyente.

Realice este paso rápidamente para que las células no se sequen. Ahora incube los portaobjetos a 37 grados centígrados en una cámara humidificada precalentada durante una hora. Durante la incubación, diluya las dos sondas de PLA en diluyente.

Para cada reacción, mezcle ocho microlitros de cada sonda y 24 microlitros de diluyente de modo que las sondas se diluyan de uno a cinco en la solución. Después de la incubación de una hora, retire la solución de anticuerpos primarios y lave los portaobjetos dos veces con Duo link to Wash Buffer a durante cinco minutos cada uno a temperatura ambiente con agitación en un frasco de acoplamiento. Cuando se completen los lavados, retire el tampón de lavado A restante de los portaobjetos y agregue 40 microlitros de la solución de sonda de PLA a cada uno.

Pues bien, ahora incuba los portaobjetos a 37 grados centígrados en una cámara humidificada precalentada. Durante una hora, el dúo se conecta a la culata de ligadura y prepara un volumen para la mezcla de ligadura. Mediante un primer vórtice, el dúo se une a la culata de ligadura y se diluye una vez en agua de alta pureza.

Tenga en cuenta que la enzima ligasa se agrega de uno a 40 en esta solución y se necesitan 40 microlitros de la mezcla por pocillo. Después de la incubación, retire la solución de sonda de PLA de los portaobjetos y lávelos dos veces con Wash Buffer. A durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación en un frasco de acoplamiento durante el último lavado, tomar Duo link Ligase en un bloque de congelación y luego agregarlo a la solución de ligadura hasta una dilución final de uno a 40 y Vortex.

A continuación, retira el volumen final de Wash Buffer A de los portaobjetos y añade 40 microlitros de la ligadura. Mezclar con la enzima a cada uno mientras l. Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada durante 30 minutos.

A 37 grados Celsius, descongele el material de amplificación DUO Link y prepárese para el paso de amplificación durante la incubación diluyendo el material de amplificación DUO Link en agua de alta pureza una vez Mantenga los reactivos fuera de la luz porque son sensibles a la luz. Una vez finalizado el paso de ligadura, retire la solución y lave los portaobjetos dos veces con Wash Buffer A durante dos minutos cada uno a temperatura ambiente con agitación en un frasco de acoplamiento durante el último lavado, agregue la polimerasa duo link a la solución de amplificación hasta una dilución final de 1 2 80 y vortex. Después de extraer el tampón de lavado, agregue 40 microlitros de amplificación mezclados a cada pocillo e incube los portaobjetos en una cámara de humedad oscura precalentada durante 100 minutos a 37 grados centígrados.

Una vez completada la incubación de la amplificación, retire la solución de polimerasa de los portaobjetos y lávelos en el tampón de lavado B dos veces durante 10 minutos por lavado con vegetación en un frasco de acoplamiento, mantenga los portaobjetos alejados de la luz durante este paso porque los reactivos son sensibles a la luz. Siga los dos lavados con una inmersión en 0.1 veces el tampón de lavado B. Ahora retire completamente el silicio del 16. Bien deslizar luego a aproximadamente 40 microlitros del dúo.

Conecte el medio de montaje con dappy a un cubreobjetos y colóquelo suavemente sobre las muestras, presionándolo ligeramente para que no queden burbujas de aire debajo del cubreobjetos, fije y selle el cubreobjetos en el portaobjetos con esmalte de uñas, dejando al menos 15 minutos antes de la toma de imágenes. Se trata de imágenes confocales de células que fueron tratadas con morfina dorsal de dos micromolares, un inhibidor de la vía BMP o tratadas con 25 nanogramos por mililitro. BMP cuatro durante 60 minutos.

utilizaron anticuerpos contra Phospho Smad 1, 58 y Smad 4 para detectar los complejos smad activos y se observan como manchas rojas. La célula nuclear sostenida en azul por dpi. Las señales de PLA se contaron con el software de la herramienta de imagen DUO link y el número promedio de puntos en el núcleo por célula se presenta en el gráfico.

No se observa tinción cuando se usa cualquiera de los anticuerpos primarios solos, lo que indica que no hay hallazgos de fondo de las sondas de PLA y posterior ligadura de los oligonucleótidos. Asimismo, no se detectan manchas en otro testigo negativo que emita ambos anticuerpos primarios. En las células neuro dos A, la inmunotransferencia de la página SDS revela SMAD 1 5 8 relacionada con el fosfo en células no tratadas y tratadas con BMP.

Sin embargo, los niveles de fosfosfera se reducen notablemente en las células tratadas con morfina dorsal. El anticuerpo contra el PCNA proporciona un control de carga. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo seguir los pasos y la configuración que sugerimos para obtener resultados en menos de seis horas después de la fijación de las células.

En resumen, los pasos son el bloqueo de la incubación de anticuerpos primarios, la incubación de PLA prob, la amplificación de la ligadura, el montaje de una imagen.