La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar y cuantificar la señalización BMP en células de cultivo tisular. Las BMP se unen a receptores en la superficie celular y FOSFORILAN a tres efectores Smad: Smad1, Smad5 y SMAD8. Estos forman complejos con Smad4 y translocan al núcleo, donde coordinan la transcripción.

Aquí utilizamos el ensayo de amplificación por ligación (PLA) para visualizar los complejos que se forman entre los efectores endógenos de SMA y Smad4 en células de cultivo tisular con o sin estimulación por BMP. Este procedimiento comienza con el uso paralelo de dos anticuerpos primarios, uno de los cuales reconoce a los tres efectores de SMA fosforilados y el otro reconoce a Smad4. Los anticuerpos secundarios, denominados sondas PLA, cada uno con una cadena corta de ADN unida, se unen a los anticuerpos primarios cuando las sondas PLA se encuentran en proximidad cercana. Las cadenas de ADN interactúan mediante la adición posterior de dos oligonucleótidos de ADN que forman un círculo.

Estos se unen mediante ligación enzimática y forman un círculo que se amplifica a través de la replicación en círculo rodante tras la reacción de amplificación. La hibridación de sondas de oligonucleótidos complementarios marcados resalta los puntos fluorescentes del producto asociados con la amplificación de cada producto circularizado. Los productos de ADN son fácilmente visibles.

Cuando se observan bajo un microscopio de fluorescencia, los puntos corresponden a complejos entre el efector, seds y smad cuatro, que indican una señalización BMP activa en la célula. Las principales ventajas de la PLA frente a los métodos existentes son su facilidad de uso, alta sensibilidad, ausencia de fondo y la posibilidad de cuantificar la señalización BMP activa in situ. La vía BMP es esencial para el desarrollo de varios órganos y tejidos, así como para procesos como la proliferación y diferenciación de células madre.

El PLA puede utilizarse para abordar preguntas clave sobre la dinámica, los niveles y la localización subcelular de la señalización BMP, pero también puede emplearse para diagnóstico. Dado que esta vía está implicada en varias enfermedades, el BLA puede utilizarse para estudiar otros componentes de transducción de señales de la vía BMP u otras vías, y puede adaptarse para trabajar en secciones de tejido o embriones completos. Para comenzar el ensayo de ligación in situ por proximidad, prepare cultivos celulares: las células Neuro 2A se cultivan en GMEM suplementado con 10 % de FBS, ácidos aminoácidos no esenciales al 1×, piruvato al 1× y L-glutamina al 1×.

Divida las células utilizando tripsina y siembre entre 15 000 y 20 000 células por pocillo. Incube las células en un portaobjetos con cámara de 16 pocillos a 37 grados Celsius en un incubador con atmósfera humedecida al 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de 24 horas.

Sustituya el medio de cultivo por GMEM libre de suero suplementado e incube durante dos o tres horas más para los controles. Mantenga tres pocillos con células en cultivo y condiciones normales después de la segunda incubación. Inhiba la vía BMP tratando las células con dos micromoles de dorsa morfina o induzca la señalización tratando las células con BMP4 durante 10 a 60 minutos.

Después de la estimulación celular, aspire el medio de los pocillos y lave suavemente las células con PBS para evitar la desprendimiento celular. No pipete el PBS directamente sobre las células. Luego, aspire el PBS y retire las cámaras, pero deje el silicio alrededor de los pocillos.

Añada 50 microlitros de paraformaldehído al 4% recién preparado y filtrado a los pocillos e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Después de la fijación, lave las células con PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación en un frasco Coplin. Repita el lavado dos veces para un total de tres lavados.

A continuación, permeabilice las células con Triton X-100 al 0,5 % en PBS en un frasco Coplin e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Luego, lave las células con tween 20 al 0,05 % y TBS tres veces durante cinco minutos por cada lavado con agitación en un frasco de acoplamiento. Inicie el procedimiento de bloqueo golpeando suavemente la portaobjetos para eliminar la última solución de lavado.

Teniendo cuidado de no permitir que las células se sequen. Añada una gota de DUO link a la solución de bloqueo en cada pozo. Incube las células en la solución de bloqueo durante 30 minutos a 37 grados Celsius en una cámara humedecida precalentada, compuesta por una caja vacía de puntas de pipeta con agua destilada.

Para preparar las soluciones de anticuerpos primarios, diluya el anticuerpo anti-fosfo-SMAD 1 5 8 y el anticuerpo anti-SMAD 4 uno a 100 en el diluyente de anticuerpos Duo Link 2. Utilice cada anticuerpo por separado y en combinación. Ahora, golpee suavemente la lámina para eliminar la solución bloqueante y agregue 40 microlitros de las soluciones de anticuerpos en los pozos correspondientes; como control negativo, puede incluirse solo el diluyente.

Realice este paso rápidamente para que las células no se sequen. Incube ahora las laminillas a 37 grados Celsius en una cámara humedecida y precalentada durante una hora. Durante la incubación, diluya las dos sondas PLA en el diluyente.

Para cada mezcla de reacción, mezcle ocho microlitros de cada sonda y 24 microlitros de diluyente, de modo que las sondas queden diluidas uno a cinco en la solución. Después de la incubación de una hora, elimine la solución del anticuerpo primario golpeando suavemente y lave los portaobjetos dos veces con Duo link a tampón de lavado A durante cinco minutos cada vez a temperatura ambiente con agitación en un frasco de acoplamiento. Cuando finalicen los lavados, elimine golpeando suavemente el tampón de lavado A restante de los portaobjetos y añada 40 microlitros de la solución de sondas PLA a cada uno.

Ahora incube las laminillas a 37 grados Celsius en una cámara humedecida previamente calentada. Durante una hora, agregue el dúo enlazador al stock de ligación y prepare un volumen para la mezcla de ligación. Primero, vortexee el dúo enlazador al stock de ligación y dilúyalo a una concentración de una vez en agua de alta pureza.

Tenga en cuenta que la enzima ligasa se añade en una dilución de uno a 40 en esta solución y se necesitan 40 microlitros de la mezcla por pocillo. Tras la incubación, retire la solución del marcador PLA de los portaobjetos y lávelos dos veces con tampón de lavado. Durante el último lavado, agite durante cinco minutos a temperatura ambiente en un frasco de acoplamiento; al mismo tiempo, saque el Ligasa Duo link de un bloque congelador y añádalo a la solución de ligación hasta una dilución final de uno a 40 y vortexee.

Ahora, retire el volumen final del tampón de lavado A de las laminillas y agregue 40 microlitros de la ligación. Mezcle con la enzima en cada una mientras l. Incube las laminillas en una cámara de humedad precalentada durante 30 minutos.

Descongele el stock de amplificación DUO link a 37 grados Celsius y prepárelo para el paso de amplificación durante la incubación diluyendo el stock de amplificación DUO Link en agua de alta pureza hasta una concentración de uno por. Mantenga los reactivos protegidos de la luz porque son sensibles a la luz. Cuando se complete el paso de ligación, elimine la solución golpeando suavemente y lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado A durante dos minutos cada vez a temperatura ambiente con agitación en un frasco de acoplamiento; durante el último lavado, añada la polimerasa duo link a la solución de amplificación hasta una dilución final de 1:280 y vortexee. Después de eliminar el tampón de lavado golpeando suavemente, añada 40 microlitros de la mezcla de amplificación a cada pocillo e incube los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada y oscura durante 100 minutos a 37 grados Celsius.

Una vez completada la incubación de amplificación, elimine por golpecitos la solución de polimerasa de los portaobjetos y lávelos dos veces en tampón de lavado B, durante 10 minutos por lavado, con agitación en un frasco de acoplamiento; mantenga los portaobjetos protegidos de la luz durante este paso porque los reactivos son sensibles a la luz. Después de los dos lavados, sumerja brevemente en tampón de lavado B al 0,1 veces. Ahora retire completamente el silicio del portaobjetos de 16 pocillos y añada aproximadamente 40 microlitros del dúo.

Coloque un medio de montaje con dappy sobre un cubreobjetos y colóquelo suavemente sobre las muestras, presionando ligeramente para que no queden burbujas de aire debajo del cubreobjetos. Fije y selle el cubreobjetos sobre el portaobjetos utilizando esmalte de uñas, dejando que transcurran al menos 15 minutos antes de la adquisición de imágenes. Estas son imágenes confocales de células tratadas con dos micromoles de dorsa morfina, un inhibidor de la vía BMP, o tratadas con 25 nanogramos por mililitro de BMP cuatro durante 60 minutos.

Se utilizaron anticuerpos contra Phospho Smad 1 58 y Smad cuatro para detectar los complejos Smad activos, visibles como puntos rojos. Los núcleos celulares se tiñeron de azul con DAPI. Las señales de PLA se contaron mediante el software de herramienta de imagen DUO link y el número promedio de puntos en el núcleo por célula se presenta en la gráfica.

No se observa tinción cuando se utiliza cada uno de los anticuerpos primarios por separado, lo que indica que no hay señal de fondo de las sondas PLA ni posterior ligación de los oligonucleótidos. Asimismo, no se detectan puntos en otro control negativo que incluye ambos anticuerpos primarios. En las células neuro dos A, el inmunoblot en gel de SDS revela SMAD 1 5 8 fosforilado en células no tratadas y en células tratadas con BMP.

Sin embargo, los niveles de smad fosforilada se reducen notablemente en las células tratadas con morfina dorsal. El anticuerpo contra PCNA proporciona un control de carga. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo seguir los pasos y la configuración que sugerimos para obtener resultados en menos de seis horas tras la fijación de las células.

En resumen, los pasos son bloqueo, incubación con el anticuerpo primario, incubación con las sondas PLA, ligación y amplificación, y montaje para la obtención de imágenes.