Name: La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-03T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar la señalización BMP en células en cultivo mediante el ensayo de ligadura de proximidad in situ. Este método permite detectar complejos efectores activados por BMP4 con alta sensibilidad.

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Esta investigación está financiada por el MRC y las subvenciones BBSRC. Damos las gracias a Agata Zieba y Pardalis Katerina en el Laboratorio de Ulf Landegren de la Universidad de Uppsala para ayudar con la creación de la técnica y consejos útiles. Olink Biosience para la ayuda técnica y la presentación.

1. Revestimiento de las células y el tratamiento con BMP <ol><li> Cultivo de células en Neuro2a GMEM suplementado con FBS al 10%, 1x no aminoácidos esenciales (NEAM), 1x piruvato sódico y 1 de L-glutamina. División de las células con tripsina (0,05%-EDTA) y la placa de 15.000-20.000 células por pocillo en una diapositiva de cámara de 16 también. Cultura HEK293T o células COS7 en DMEM suplementado con FBS al 10%, 1x L-glutamina y 1 de penicilina / estreptomicina. Esterilizar diapositivas Polysine por inmersión en etanol al 70% y el uso de la pluma Immedge dibujar 1 cm 2 pozos. División de las células con tripsina (0,05%-EDTA) y la placa de 20.000 a 25.000 células por pocillo en medio de 50 microlitros. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en un humidificado 5% incubadora de CO 2. </li><li> Después de 24 h reemplazar el medio con suero libre GMEM (suplementado con 0,1% de albúmina, 1x NEAM, 1x piruvato sódico y 1 de L-glutamina) para Neuro2a o con DMEM libre de suero (suplementado con L-glutamina y 1 de penicilina / estreptomicina) para HEK293T / COS7 e incubar las células durante 2-3 h. Mantener tres pozos con células bajo condiciones de cultivo normal (es decir, 10% de SFB) para utilizar como controles. </li><li> Tratar las células con dorsomorphin (inhibidor de la vía BMP, 2 M) o BMP4 (25 ng / ml) durante el tiempo deseado (por ejemplo, durante 10 min-1 h) 5. </li></ol> 2. Fijación y permeabilización <ol><li> Preparar el fijador, el 4% PFA. Pesar 4 g de PFA para preparar una solución al 4% en 100 ml de PBS. Calentar la solución a 50 ° C hasta que quede claro. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 micras y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. Use fijador fresco (no se almacenan por más de 2 días). </li><li> Aspirar el medio de los pocillos y lavar con 1XPBS. No pipetear las soluciones directamente sobre las células ya que esto puede resultar en el desprendimiento de las células. Antes de ir al siguiente paso, si la cámara de diapositivas se utilizan quitar las cámaras, pero deja el silicio alrededor de los pozos. </li><li> Añadir 50 l PFA al 4% e incubar durante 10 minutos, a temperatura ambiente, sin agitación. </li><li> Se lavan las células con PBS durante 3 x 5 minutos en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li><li> Tratar las células con 0,5% Triton X-100 en PBS durante 10 minutos sin agitación a temperatura ambiente. </li><li> Lavan las células con el 0,05% de Tween 20 en TBS (TBS-T) de 3 x 5 minutos en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Bloqueo de <ol><li> Toque de la TBS-T. Añadir una gota de solución de bloqueo Duolink II (1x) por pocillo. </li><li> Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada durante 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 4. Anticuerpos primarios <ol><li> Mezclar y diluir aP-Smad1/5/8 (policlonal de conejo) a 1:100 y un Smad4 (monoclonal de ratón) a 1:100 en el diluyente de anticuerpos Duolink II (1x). Prepare también aP-Smad1/5/8 y solo uno-Smad4 en las mismas concentraciones que se utiliza para los controles. </li><li> Elimine la solución de bloqueo de las diapositivas. Retire como una solución mucho más el bloqueo como sea posible, pero tenga cuidado de no dejar que las células seco antes de añadir el anticuerpo. Añadir 40 ml de las soluciones de anticuerpos a los pozos. En un bien agregar diluyente de anticuerpos sólo como un control negativo adicional. </li></ol> 5. PLA sondas <ol><li> Diluir las dos sondas de PLA (Duolink II anti-ratón de menos y Duolink II anti-conejo PLUS) 1:05 en diluyente de anticuerpos. </li><li> Elimine la solución de anticuerpo primario de las diapositivas. Este lavado 2 veces 5 minutos cada uno con 1x buffer Duolink II Lavado A en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li><li> Elimine la solución de lavado A partir de las diapositivas y añadir la solución de PLA de la sonda (40 l / pocillo). Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada durante 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 6. La ligadura <ol><li> El vórtice Duolink II Ligadura de valores (5 veces) y se diluye 1:5 en agua de alta pureza y mezcla. Al calcular el volumen del agua, tener en cuenta el volumen de la ligasa, que se añadirá a una dilución final de 1:40 justo antes de la adición de la mezcla de los pozos. </li><li> Elimine la solución de la sonda PLA de las diapositivas. Lavar los portaobjetos en el tampón de lavado 1 x 2 veces por 5 minutos cada uno en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li><li> Saque la ligasa del congelador con un bloque de congelación (-20 ° C). Añadir la ligasa a la solución de ligación (preparado en el punto 6.1) a una dilución 1:40 y agitar. </li><li> Elimine la solución de lavado A partir de las diapositivas y añadir la solución de ligación-ligasa a cada pocillo (40 l / pocillo). Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada durante 30 minutos a 37 ° C. </li></ol> 7. Amplificación Nota: La luz reactivos sensibles. Mantenga las diapositivas de la luz. <ol><li> Diluir el stock Duolink II de amplificación (5 veces) 1:5 en agua de alta pureza y mezcla. Al calcular el volumen del agua en cuenta el volumen de la polimerasa, que se añadirá a una dilución final de 1:80 justo antes de la adición de la mezcla de the pozos. </li><li> Elimine la solución de ligación-ligasa de las diapositivas. Lavar los portaobjetos en tampón de lavado 1X con una de 2 por 2 minutos cada uno en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li><li> Saque la polimerasa del congelador con un bloque de congelación (-20 ° C). Añadir la polimerasa para la solución de amplificación (preparado en 7.1) a una dilución 1:80 y agitar. </li><li> Elimine la solución de lavado A partir de las diapositivas y añadir la solución de amplificación de la polimerasa a cada pocillo (40 l / pocillo). Incubación los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada a 100 minutos a 37 ° C. </li></ol> 8. Preparación para la imagen Nota: La luz reactivos sensibles. Mantenga las diapositivas de la luz. <ol><li> Elimine la solución de amplificación de la polimerasa a partir de las diapositivas y de lavado de 2 veces 10 minutos cada uno en 1x Wash Buffer Duolink II B en un frasco Coplin con agitación a temperatura ambiente. </li><li> Sumergir los portaobjetos en el tampón de lavado de 0,1 x B. </li><li> Quitar la silicona de la diapositiva 16, así por completo. Añadir ~ 40μl de la II Duolink medio de montaje con DAPI en el cubreobjetos y suavemente a cabo sobre las muestras presionando ligeramente para que no queden burbujas de aire bajo el cubreobjetos. Fijar y sellar el cubreobjetos sobre el portaobjetos con esmalte de uñas. Espere por lo menos 15 minutos antes de proceder a la imagen. </li><li> Analizar las muestras con un microscopio confocal o de fluorescencia. La obtención de imágenes digitales. </li></ol> 9. Cuantificación Nota: La luz reactivos sensibles. Mantenga las diapositivas de la luz. <ol><li> Use Duolink ImageTool contar las señales en las imágenes para obtener una medida del nivel de señalización. </li><li> Comparar las mediciones y realizar un gráfico. </li></ol> 10. Resultados representante El resultado de un experimento in situ PLA muestra manchas fluorescentes como discretos. La ubicación de la señal depende de las proteínas específicas de estudio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. In situ del EPL en las células después de la estimulación Neuro2a BMP4. Las células fueron tratadas con M dorsomorphin 2 (inhibidor de la vía BMP) (A) o 25 BMP4 ng / ml (B) durante 60 minutos o se deja sin tratar (CE). Los anticuerpos contra P-Smad1/5/8 Smad4 y se utiliza para detectar los complejos activos en A y B. Los anticuerpos primarios aP-Smad1/5/8 solo (C) y un Smad4 solo (D) o la omisión de la primaria anticuerpos (E) se utilizaron como controles. Azul: DAPI; Rojo: señal de PLA. Imágenes fueron obtenidas con un microscopio Leica SP5 confocal. (F) Las señales de PLA se contó con el software Duolink ImageTool y el número promedio de puntos en el núcleo de cada célula se presenta en el gráfico. (G), las células Neuro2a se deja sin tratar o tratados con Dorsomorphin (2 mM) o BMP4 (25 ng / ml) durante 60 min. Se usaron las células y las proteínas fueron sometidas a SDS-PAGE y se analizaron por inmunotransferencia con aP-Smad1/5/8 y PCNA como control de carga. (*) No específica de banda. Tenga en cuenta que el anticuerpo aP-Smad1/5/8 no puede distinguir entre los tres diferentes proteínas presentes en el complejo con Smad4.

<ol><li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun%2FAP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun%2FFra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 Forthcoming.</li>
<li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li>
<li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor%2Fretinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li>
</ol>

La producción de este video-artículo fue patrocinado por OLINK que hace un reactivo utilizado en el procedimiento de ensayo de la ligadura de proximidad.

La visualización de los complejos de proteínas in situ está en gran demanda, sobre todo para los estudios en donde la interacción de proteínas de señalización y modificación de proteínas son los medios que las células usan para enviar una señal de su superficie al núcleo. No ha sido posible visualizar y cuantificar los complejos entre dos proteínas endógenas in situ con inmunofluorescencia antes. Co-localización de anticuerpos muestra de baja resolución y no se puede utilizar para visualizar una verdadera interacción. PLA es una nueva técnica que los investigadores han empezado a utilizar en diferentes sistemas con gran éxito 6, 7. En este sentido, se muestra cómo utilizar PLA no sólo para visualizar, sino también cuantificar los complejos endógenos entre efectores Smad activado aguas abajo de la estimulación BMP con el tiempo. Hemos utilizado diferentes células de cultivo de tejidos incluyendo Neuro2a y se basó en anticuerpos comerciales planteadas en las diferentes especies (ratón y conejo-Smad4 aP-Smad1/5/8) para lograr esto (fig 1). Este método nos permitió, por primera vez, para ver la activación de los efectores BMP-complejos con el tiempo y no sólo la presencia de la fosforilado Smad1/5/8, que no todos pueden participar en complejos activos con Smad4. Contamos con las señales (Fig. 1F) y se comparó la medida con la cuantificación obtenidos de inmunoblot de las mismas células 8 (Figura 1G). Llegamos a la conclusión de que el número de puntos de proporcionar una medición precisa comparativo de los niveles de señalización a través del tiempo. La técnica se aplicó también en otras líneas celulares (HEK293T y COS7) con resultados similares (datos no mostrados). El principio de la tecnología se basa en dos sondas únicos incluidos en el kit Duolink. Cada sonda PLA consiste en un anticuerpo secundario unido a un oligonucleótido sintético único, que actúa como un periodista. La proximidad de las sondas permite la ligadura de ADN en el lugar exacto donde estas sondas se unen en la proximidad. La distancia de los oligonucleótidos, que permite la hibridación de ADN y la ligadura es pequeño (40 nm &lt;) y por lo tanto, sólo las proteínas que interactúan puede permitir que la ligadura. El ADN ligado entonces puede ser amplificado y detectado con la hibridación de los oligonucleótidos etiqueta de la secuencia amplificada. La amplificación es específica, ya que depende de los principios de hibridación ADN-ADN y también proporciona una alta sensibilidad como el ADN ligado se amplifica varias veces que resulta en la mejora de la ligadura de evento inicial. El ADN amplificado se detecta por hibridación con oligonucleótidos marcados y produce un lugar visible y bastante grandes. Medida que los puntos se puede contar, la señal de PLA no sólo proporciona la información exacta espaciales (la ubicación de los eventos de interacción), sino también una manera objetiva de cuantificar estos eventos 4.2. Otras técnicas que se emplean para la detección de interacciones de proteínas incluyen co-inmunoprecipitación, inmunofluorescencia y la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). Co-immunoprecipitation ensayos son ampliamente utilizados que permite el aislamiento de los complejos de proteínas. El método se acompaña de inmunotransferencia lo que significa que las proteínas se expresan en niveles relativamente altos a fin de detectar. Los problemas de fondo de alta o de la unión no específica de algunas proteínas de los granos son a veces difíciles de superar en co-inmunoprecipitación. Además, co-immunoprecipitation ensayos permiten la detección de proteínas que pueden formar parte de un complejo de proteínas, pero no pueden distinguir aquellos que están en una proximidad muy cercana interactuar físicamente con los demás. Además, co-inmunoprecipitaciones no puede proporcionar la cuantificación en la resolución de celda o de información sobre la localización de los complejos de proteínas en la célula. La detección de co-existencia de complejos de proteínas en una célula o un compartimento de células por inmunofluorescencia se basa en la superposición de las señales de difusión y por lo tanto, tiene una resolución espacial baja y no puede proporcionar información precisa sobre las interacciones de las proteínas. La cuantificación de la señal de inmunofluorescencia se puede hacer por estimación visual sólo si la diferencia es de varias veces, y no puede ser exacta o medibles como las manchas de PLA. FRET permite la visualización de los complejos de proteínas en células vivas y evita la necesidad de anticuerpos y la exposición del epítopo. Sin embargo, FRET lo general depende de la sobreexpresión de proteínas de fusión artificial, lo cual no refleja los complejos de proteínas endógenas como en el PLA. Condiciones de bloqueo en el protocolo de PLA son fundamentales como la agregación de anticuerpos puede ocurrir y aumentar el fondo. Distintas condiciones de bloqueo se puede encontrar en las fichas técnicas de anticuerpos. Los controles adecuados con omisión del anticuerpo primario y secundario proporcionan información sobre lo que pudo haber salido mal y que necesitan estar siempre incluido. Es importante a la pantalla de anticuerpos diferentes que le dará al menos de fondo cuando se emplean solos y la mejor señal cuando están juntos. La fijación de cells es crítico ya que más de la fijación puede causar complejos de proteínas para desnaturalizar completamente y se degradan, mientras que la fijación insuficiente puede conducir a la pérdida de complejos de proteínas durante las etapas del procedimiento. Esto puede ser controlado mediante la reducción de la concentración del fijador al 3% o al limitar el tiempo de fijación. Sin embargo, la fijación depende también de si los anticuerpos primarios reconocer proteínas desnaturalizadas o no. A medida que la técnica de PLA es muy sensible, requiere de cuidados especiales para mantener los tiempos de incubación y las condiciones micro iguales entre las diferentes muestras. Las muestras no deben dejarse secar, en cualquier caso antes de la etapa final. Secado de las muestras puede dar lugar a un aumento de fondo. La remoción completa de la solución de bloqueo también es fundamental para evitar el fondo. Los tampones de lavado debe estar siempre a temperatura ambiente antes de su uso, como la temperatura baja retarda las reacciones enzimáticas. Para la solución de problemas, consulte el manual del kit. Es útil el uso de las manchas para determinar la localización subcelular de la señal de PLA (por ejemplo, DAPI, la actina, etc.) Aquí hemos utilizado DAPI (en el medio de montaje) para teñir los núcleos. PLA es compatible con el uso de inmunofluorescencia con anticuerpos para determinar el tipo de células o compartimento celular (no mostrado aquí). Cuantificación exacta se puede hacer contando las señales y el uso de software específico (Herramienta Duolink imagen, Olink Biosience). En conclusión, hemos demostrado cómo utilizar in situ PLA, utilizando el kit de Duolink para detectar la señalización de BMP en células fijadas y presentó sus ventajas: fácil de usar, altamente sensible, no de fondo, y una capacidad única para cuantificar los activos de señalización de BMP en el lugar. La limitación de la aplicación de esta técnica para estudiar las interacciones de diferentes proteínas depende de la disponibilidad y la calidad de los anticuerpos primarios que reconocen las proteínas objeto de la investigación.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21710025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal (FBS)</td><td>AutogenBioclear</td><td>7.01</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Invitrogen</td><td>11149068</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-054</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,05 % (1X) con EDTA 4Na, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Placas con cámaras de 16 pocillos</td><td>Lab-Tek</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>Polysine</td><td>VWR international</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>VWR international</td><td>631-0138</td><td></td></tr><tr><td>a-pSmad1/5/8</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>a-Smad4 (B8)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-7966</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>171260-10MG</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4 recombinante de ratón</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega Corp.</td><td>H5151</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Reactivos de detección Duolink II (naranja)&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92007-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Sonda Duolink II PLA anti-ratón MENOS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92004-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Sonda Duolink II PLA anti-conejo MÁS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92002-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Medio de montaje Duolink II con DAPI&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82040-0005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Tampones de lavado Duolink II para fluorescencia&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82049</td><td></td></tr></tbody></table>

la detección de señalización de efectos complejos de aguas abajo de bmp4 uso in situ pla, un ensayo de la ligadura de proximidad

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs son responsables de una amplia gama de efectos sobre el desarrollo y biológicos. Activar los receptores BMP (fosforilar) la Smad1/5/8 efectores, que a su vez, forman un complejo con Smad4 y trasladar al núcleo donde funcionan como factores de transcripción para iniciar BMP efectos específicos intermedios 1. Tradicionales técnicas de inmunofluorescencia con anticuerpos contra péptidos Smad fosfo-presentan baja sensibilidad de fondo, de altura y ofrecen la cuantificación bruto ya que dependen de la intensidad de la señal de anticuerpos sobre todo si este es fotosensible fluorescentes. Además, fosfo-Smads pueden no estar todos en el complejo con Smad4 y participó en la transcripción activa. In situ PLA es una tecnología capaz de detectar las interacciones de proteínas con alta especificidad y sensibilidad 2-4. Esta nueva tecnología de reconocimiento parejas de anticuerpos con la amplificación de ADN de un sustituto de la proteína. Se genera una señal localizada, discreta en forma de manchas de revelar la posición exacta del evento de reconocimiento. El número de señales se pueden contar y en comparación proporciona una medición. Hemos aplicado in situ PLA, utilizando el kit de Duolink, con una combinación de anticuerpos que permite la detección de los efectores de señalización BMP phospho-Smad1/5/8 Smad4 y sólo cuando estos se encuentran en la proximidad, es decir en un complejo, que ocurre sólo con la señalización activación. Esto permitió que por primera vez, la visualización y medición de los endógenos de señalización de BMP con una alta especificidad y sensibilidad en un tiempo experimento en la estimulación BMP4.

Aquí se muestra cómo utilizar la ligadura de ensayo de proximidad (PLA), con una combinación de anticuerpos para visualizar la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización en células fijadas. Esta técnica nos permitió seguir la acumulación nuclear de endógeno BMP activa de efectos complejos y cuantificar sus niveles en el tiempo en BMP4 estimulación.

La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad

Las BMP son responsables de una amplia gama de efectos biológicos y del desarrollo. Los receptores de BMP activan (fosforilan) los efectores Smad1/5/8, los cuales, posteriormente, ...

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar y cuantificar la señalización BMP en células de cultivo tisular. Las BMP se unen a receptores en la superficie celular y FOSFORILAN a tres efectores Smad: Smad1, Smad5 y SMAD8. Estos forman complejos con Smad4 y translocan al núcleo, donde coordinan la transcripción.Aquí utilizamos el ensayo de amplificación por ligación (PLA) para visualizar los complejos que se forman entre los efectores endógenos de SMA y Smad4 en células de cultivo tisular con o sin estimulación por BMP. Este procedimiento comienza con el uso paralelo de dos anticuerpos primarios, uno de los cuales reconoce a los tres efectores de SMA fosforilados y el otro reconoce a Smad4. Los anticuerpos secundarios, denominados sondas PLA, cada uno con una cadena corta de ADN unida, se unen a los anticuerpos primarios cuando las sondas PLA se encuentran en proximidad cercana. Las cadenas de ADN interactúan mediante la adición posterior de dos oligonucleótidos de ADN que forman un círculo.Estos se unen mediante ligación enzimática y forman un círculo que se amplifica a través de la replicación en círculo rodante tras la reacción de amplificación. La hibridación de sondas de oligonucleótidos complementarios marcados resalta los puntos fluorescentes del producto asociados con la amplificación de cada producto circularizado. Los productos de ADN son fácilmente visibles.Cuando se observan bajo un microscopio de fluorescencia, los puntos corresponden a complejos entre el efector, seds y smad cuatro, que indican una señalización BMP activa en la célula. Las principales ventajas de la PLA frente a los métodos existentes son su facilidad de uso, alta sensibilidad, ausencia de fondo y la posibilidad de cuantificar la señalización BMP activa in situ. La vía BMP es esencial para el desarrollo de varios órganos y tejidos, así como para procesos como la proliferación y diferenciación de células madre.El PLA puede utilizarse para abordar preguntas clave sobre la dinámica, los niveles y la localización subcelular de la señalización BMP, pero también puede emplearse para diagnóstico. Dado que esta vía está implicada en varias enfermedades, el BLA puede utilizarse para estudiar otros componentes de transducción de señales de la vía BMP u otras vías, y puede adaptarse para trabajar en secciones de tejido o embriones completos. Para comenzar el ensayo de ligación in situ por proximidad, prepare cultivos celulares: las células Neuro 2A se cultivan en GMEM suplementado con 10 % de FBS, ácidos aminoácidos no esenciales al 1×, piruvato al 1× y L-glutamina al 1×.Divida las células utilizando tripsina y siembre entre 15 000 y 20 000 células por pocillo. Incube las células en un portaobjetos con cámara de 16 pocillos a 37 grados Celsius en un incubador con atmósfera humedecida al 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de 24 horas.Sustituya el medio de cultivo por GMEM libre de suero suplementado e incube durante dos o tres horas más para los controles. Mantenga tres pocillos con células en cultivo y condiciones normales después de la segunda incubación. Inhiba la vía BMP tratando las células con dos micromoles de dorsa morfina o induzca la señalización tratando las células con BMP4 durante 10 a 60 minutos.Después de la estimulación celular, aspire el medio de los pocillos y lave suavemente las células con PBS para evitar la desprendimiento celular. No pipete el PBS directamente sobre las células. Luego, aspire el PBS y retire las cámaras, pero deje el silicio alrededor de los pocillos.Añada 50 microlitros de paraformaldehído al 4% recién preparado y filtrado a los pocillos e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Después de la fijación, lave las células con PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación en un frasco Coplin. Repita el lavado dos veces para un total de tres lavados.A continuación, permeabilice las células con Triton X-100 al 0,5 % en PBS en un frasco Coplin e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Luego, lave las células con tween 20 al 0,05 % y TBS tres veces durante cinco minutos por cada lavado con agitación en un frasco de acoplamiento. Inicie el procedimiento de bloqueo golpeando suavemente la portaobjetos para eliminar la última solución de lavado.Teniendo cuidado de no permitir que las células se sequen. Añada una gota de DUO link a la solución de bloqueo en cada pozo. Incube las células en la solución de bloqueo durante 30 minutos a 37 grados Celsius en una cámara humedecida precalentada, compuesta por una caja vacía de puntas de pipeta con agua destilada.Para preparar las soluciones de anticuerpos primarios, diluya el anticuerpo anti-fosfo-SMAD 1 5 8 y el anticuerpo anti-SMAD 4 uno a 100 en el diluyente de anticuerpos Duo Link 2. Utilice cada anticuerpo por separado y en combinación. Ahora, golpee suavemente la lámina para eliminar la solución bloqueante y agregue 40 microlitros de las soluciones de anticuerpos en los pozos correspondientes; como control negativo, puede incluirse solo el diluyente.Realice este paso rápidamente para que las células no se sequen. Incube ahora las laminillas a 37 grados Celsius en una cámara humedecida y precalentada durante una hora. Durante la incubación, diluya las dos sondas PLA en el diluyente.Para cada mezcla de reacción, mezcle ocho microlitros de cada sonda y 24 microlitros de diluyente, de modo que las sondas queden diluidas uno a cinco en la solución. Después de la incubación de una hora, elimine la solución del anticuerpo primario golpeando suavemente y lave los portaobjetos dos veces con Duo link a tampón de lavado A durante cinco minutos cada vez a temperatura ambiente con agitación en un frasco de acoplamiento. Cuando finalicen los lavados, elimine golpeando suavemente el tampón de lavado A restante de los portaobjetos y añada 40 microlitros de la solución de sondas PLA a cada uno.Ahora incube las laminillas a 37 grados Celsius en una cámara humedecida previamente calentada. Durante una hora, agregue el dúo enlazador al stock de ligación y prepare un volumen para la mezcla de ligación. Primero, vortexee el dúo enlazador al stock de ligación y dilúyalo a una concentración de una vez en agua de alta pureza.Tenga en cuenta que la enzima ligasa se añade en una dilución de uno a 40 en esta solución y se necesitan 40 microlitros de la mezcla por pocillo. Tras la incubación, retire la solución del marcador PLA de los portaobjetos y lávelos dos veces con tampón de lavado. Durante el último lavado, agite durante cinco minutos a temperatura ambiente en un frasco de acoplamiento; al mismo tiempo, saque el Ligasa Duo link de un bloque congelador y añádalo a la solución de ligación hasta una dilución final de uno a 40 y vortexee.Ahora, retire el volumen final del tampón de lavado A de las laminillas y agregue 40 microlitros de la ligación. Mezcle con la enzima en cada una mientras l. Incube las laminillas en una cámara de humedad precalentada durante 30 minutos.Descongele el stock de amplificación DUO link a 37 grados Celsius y prepárelo para el paso de amplificación durante la incubación diluyendo el stock de amplificación DUO Link en agua de alta pureza hasta una concentración de uno por. Mantenga los reactivos protegidos de la luz porque son sensibles a la luz. Cuando se complete el paso de ligación, elimine la solución golpeando suavemente y lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado A durante dos minutos cada vez a temperatura ambiente con agitación en un frasco de acoplamiento; durante el último lavado, añada la polimerasa duo link a la solución de amplificación hasta una dilución final de 1:280 y vortexee. Después de eliminar el tampón de lavado golpeando suavemente, añada 40 microlitros de la mezcla de amplificación a cada pocillo e incube los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada y oscura durante 100 minutos a 37 grados Celsius.Una vez completada la incubación de amplificación, elimine por golpecitos la solución de polimerasa de los portaobjetos y lávelos dos veces en tampón de lavado B, durante 10 minutos por lavado, con agitación en un frasco de acoplamiento; mantenga los portaobjetos protegidos de la luz durante este paso porque los reactivos son sensibles a la luz. Después de los dos lavados, sumerja brevemente en tampón de lavado B al 0,1 veces. Ahora retire completamente el silicio del portaobjetos de 16 pocillos y añada aproximadamente 40 microlitros del dúo.Coloque un medio de montaje con dappy sobre un cubreobjetos y colóquelo suavemente sobre las muestras, presionando ligeramente para que no queden burbujas de aire debajo del cubreobjetos. Fije y selle el cubreobjetos sobre el portaobjetos utilizando esmalte de uñas, dejando que transcurran al menos 15 minutos antes de la adquisición de imágenes. Estas son imágenes confocales de células tratadas con dos micromoles de dorsa morfina, un inhibidor de la vía BMP, o tratadas con 25 nanogramos por mililitro de BMP cuatro durante 60 minutos.Se utilizaron anticuerpos contra Phospho Smad 1 58 y Smad cuatro para detectar los complejos Smad activos, visibles como puntos rojos. Los núcleos celulares se tiñeron de azul con DAPI. Las señales de PLA se contaron mediante el software de herramienta de imagen DUO link y el número promedio de puntos en el núcleo por célula se presenta en la gráfica.No se observa tinción cuando se utiliza cada uno de los anticuerpos primarios por separado, lo que indica que no hay señal de fondo de las sondas PLA ni posterior ligación de los oligonucleótidos. Asimismo, no se detectan puntos en otro control negativo que incluye ambos anticuerpos primarios. En las células neuro dos A, el inmunoblot en gel de SDS revela SMAD 1 5 8 fosforilado en células no tratadas y en células tratadas con BMP.Sin embargo, los niveles de smad fosforilada se reducen notablemente en las células tratadas con morfina dorsal. El anticuerpo contra PCNA proporciona un control de carga. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo seguir los pasos y la configuración que sugerimos para obtener resultados en menos de seis horas tras la fijación de las células.En resumen, los pasos son bloqueo, incubación con el anticuerpo primario, incubación con las sondas PLA, ligación y amplificación, y montaje para la obtención de imágenes.

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Investigación

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Biología

Este video describe el ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína en células de nematodos. La proximidad de las proteínas de interés genera la plantilla circular de ADN con la ayuda de una sonda de PLA unida a un anticuerpo secundario. La sonda se amplifica aún más utilizando la solución de amplificación, que produce un ADN monocatenario largo seguido de la hibridación de la sonda detectora, lo que permite la localización de las interacciones...

Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína

Este video demuestra la visualización de las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular (NMJ) de Drosophila utilizando el Ensayo de Ligadura de Proximidad (PLA). Después de aislar las paredes del cuerpo, las proteínas que interactúan se prueban con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios conjugados con PLA. La proximidad de las proteínas que interactúan facilita la ligadura de las sondas con oligonucleótidos conectores, formando ADN circular, que luego se amplifica...

Detección de interacciones proteína-proteína en larvas de Drosophila mediante un ensayo de ligadura de proximidad

Este artículo ilustra el uso del etiquetado de radio de persecución de pulsos en combinación con la fotoreticulación específica del sitio para monitorear las interacciones entre una proteína de interés y otros factores en E. coli. A diferencia de los métodos tradicionales de reticulación química, este enfoque genera "instantáneas" de alta resolución de una vía de ensamblaje ordenada en una célula viva.

Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

Este protocolo demuestra cómo la proximidad Ligadura ensayo se puede usar para detectar in situ en las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular Drosophila larval. Con esta técnica, los discos grandes y Hu-li shao tai se muestra para formar un complejo en la región postsináptica, una asociación identificado previamente a través de co-inmunoprecipitación.

Detección de In Situ Complejos proteína-proteína en la Drosophila Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

A continuación, describimos un procedimiento para visualizar y cuantificar con alta sensibilidad las interacciones endógenas entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias en las células fijadas. El protocolo cuenta con una optimizada en el ensayo de ligamiento por proximidad situ la orientación del inositol receptor / proteína 1,4,5-trifosfato regulada por glucosa 75 / D compleja canal de aniones / ciclofilina dependiente de la tensión en la interfase membrana de la mitocondria asociada.

Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Aquí, mostramos cómo hacer un análisis de proximidad de la ligadura (PLA) visualizar heterodimerization MST1/MST2 en células fijas con alta sensibilidad.

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

Las proteínas de dominio J de Cognate cooperan con el acompañante Hsp70 para ayudar en una miríada de procesos biológicos que van desde el plegado de proteínas hasta la degradación. Aquí, describimos un ensayo de ligadura de proximidad in situ, que permite el seguimiento de estas máquinas de chaperone formadas transitoriamente en células bacterianas, levaduras y humanas.

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

Aquí, establecemos un protocolo para visualizar y analizar simultáneamente múltiples complejos SMAD utilizando el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) en células endoteliales expuestas a condiciones patológicas y fisiológicas de estrés por cizallamiento de fluidos.

Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad

Cuando las proteínas precursoras de la familia ß del factor de crecimiento transformador se expresan ectópicamente en embriones de Xenopus laevis, se dimerizan, se escindin y se secretan en el blastocele, que comienza en la etapa de blástula tardía a la gastrula temprana. Describimos un método para aspirar productos de escisión de la cavidad del blastocoele para el análisis de inmunoblot.

Análisis de los productos de escisión familiar del factor de crecimiento transformador ß secretados en el blastocoele de los embriones de Xenopus laevis

Aprende a visualizar y cuantificar la señalización BMP en células en cultivo mediante el ensayo de ligadura de proximidad in situ. Este método permite detectar complejos efectores activados por BMP4 con alta sensibilidad.

La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad (Video) | JoVE Journal

La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad

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