Name: Generación de plantas compuestas en Medicago truncatula Utilizado para los ensayos nodulación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Aprende a generar plantas compuestas con raíces transgénicas en Medicago truncatula mediante transformación con Agrobacterium. Este método rápido permite estudiar interacciones planta-rizobio y nodulación sin cultivo de tejidos tradicional.

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Los autores desean agradecer al Dr. Chris Taylor (Universidad Estatal de Ohio) para la introducción de la tecnología de raíces peludas a nuestro laboratorio y los Dres. Senthil Subramanian (South Dakota State University), Juan Zhang (Ludong la Universidad de Shandong de China) para mejorar el protocolo. También agradecemos al Dr. Cheng Hao (Nanjing Universidad de Agricultura) para la ayuda en la toma de este video. Este trabajo es apoyado en parte por subvenciones del Departamento de Energía (DE-SC0001295), NSF (MCB-0923779) y el USDA (2010-65116-20514) a OY

El siguiente protocolo se ha utilizado para generar plantas peludas raíces compuesto en un modelo de leguminosas M. especies truncatula. Protocolos similares han sido adaptadas por lo menos ocho especies de plantas 1-4. Se utilizó M. plantas truncatula peludas raíces compuesto para estudiar las funciones de genes en las raíces y el desarrollo de nódulos. El protocolo se divide en cuatro secciones: 1) la preparación de materiales vegetales, 2) la generación de las plantas peludas raíz compuesta, 3) la infección simbiótica Rhizobium, y 4) la identificación transgénicos raíz. Se utilizó el vector binario que contiene la proteína verde fluorescente (GFP) de genes como reportero para la detección de la raíz transgénica en las plantas de compuestos 3. En comparación con los antibióticos basados ​​en la selección, las buenas prácticas agrarias basadas en detección es rápido, fácil y barata. En nuestra construcción, la ER-expresión optimizado gen gfp está impulsado por el promotor de la ubiquitina súper, que tiene fuertes señales de las buenas prácticas agrarias constitutiva en las raíces de transgénicos, que permite distinguir fácilmente entre las raíces de transgénicos y no transgénicos. 1. Preparación de materiales para plantas <ol><li> M. truncautla semillas se obtienen de las plantas cultivadas en un invernadero (50% de humedad relativa, 16 / 8 h luz / oscuridad, 22/18 ° C día / noche la temperatura). Las semillas maduras se pueden almacenar a 4 ° C. </li><li> Aproximadamente 100 semillas son escarificadas en 10 ml de ácido sulfúrico concentrado (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) durante 10 minutos con agitación periódica. </li><li> Las semillas se lavan 5-7 veces con agua estéril con una suave agitación. </li><li> Las semillas se remojan en agua a temperatura ambiente durante 6 horas y se mantiene a 4 ° C durante 36-48 horas para sincronizar la germinación. </li><li> Aproximadamente el 20-30 semillas se extienden sobre papel de filtro húmedo, colocado en una placa de Petri. Se mantienen a 22 ° C, con 16 / 8 h luz / oscuridad ciclo, y 40 μmol.m -2. S -1 intensidad de la luz, durante 5-6 días. </li><li> Plántulas germinadas se transfieren en el suelo y se coloca en el invernadero durante un mes. </li></ol> 2. La generación de plantas peludas raíz Composite <ol><li> Construcciones binarias portadores de genes de interés se convirtieron en A. rhizogenes utilizando protocolos estándar. Hemos diseñado un conjunto de vectores binarios que contienen el gen de la GFP como un marcador que facilitar la detección de los tejidos transgénicos. Estos vectores contienen varios promotores y todos tienen sitios de puerta de enlace de la clonación (Invitrogen, Carlsbad, CA) por la sobre-expresión o el silenciamiento de determinados genes 3,5. </li><li> A. rhizogenes se cultivaron en medio LB 50 ml con la selección adecuada de antibióticos a 28 ° C durante 16-24 horas. </li><li> Las bacterias se recogen y se volvió a suspender a una concentración final de 600 OD = 0,3 en una solución de la planta libre de nitrógeno nutriente (Tabla 1 y 6). </li><li> Para apoyar la regeneración de las raíces peludas, una matriz de esterilización de apoyo ("lana de roca", Hummert Internacional, Earth City, MO) se corta en tacos de unos 3 cm 3. Ponemos 4 se conecta a una placa de Petri. </li><li> Un agujero se metió en la parte superior de cada tapón usando una pipeta de punta para facilitar la inserción de los explantes. A. rhizogenes (5 ml) se añade a cada enchufe. </li><li> Una sección de disparar con 2-3 yemas axilares se extirpa con un corte oblicuo. El explante se inserta en el enchufe, y ha crecido a 22 ° C durante unas tres semanas. Nos reservamos el explantes Medicago sin riego durante los primeros 10 días, entonces, el agua con 5 ml de nitrógeno libre de solución cuando sea necesario. Descubrieron que al eliminar el meristemo apical podría disminuir la formación de raíces adventicias. </li></ol> 3. Simbiótica Rhizobium (Sinorhizobium meliloti) Infección <ol><li> Después de tres semanas, algunas raíces adventicias saldrá de la lana de roca. Las plantas de raíz compuesta peluda se transfieren a la arena o vermiculita (esterilizada), con o sin la lana de roca. Que se cultivan en el invernadero a 22 ° C, 16 / 8 h luz / oscuridad ciclo, y 300 μmol.m -2. S -1 intensidad de la luz durante una semana más. </li><li> Antes de rizobios infección, S. meliloti 1201 se cultivaron en 50 extracto de levadura-manitol ml de medio por 7 días a 30 ° C (Tabla 2 y 6,7). </li><li> Resuspendidas las células rizobios se diluyen a una concentración final de 600 OD = 0,08 con solución de nitrógeno libre de nutrición. Una suspensión fresca 10 ml de S. meliloti se aplicó a cada planta de compuestos para inducir la formación de nódulos. </li></ol> 4. Identificación de la raíz transgénica <ol><li> Dos semanas después de la inoculación de rizobios, las plantas están compuestas arrancadas por el lavado en agua. Las raíces se pueden separar fácilmente de arena o perlita en el agua. </li><li> Ponemos las raíces peludos bajo un microscopio UV (Nikon SMZ1500, excitación 460-500nm, 505nm dicroicas, la barrera más 510 Nm). Las raíces transgénicas GFP positivos y las raíces adventicias son las buenas prácticas agrarias negativo. A continuación, recoger las raíces according la señal de las buenas prácticas agrarias, y contar el número de nódulos, medir la longitud de la raíz, y calcular la densidad de las raíces laterales. Las raíces de las buenas prácticas agrarias negativos son utilizados como control. </li></ol> 5. Representante de Resultados En nuestro experimento, las raíces del pelo nuevo regeneradas a partir de los explantes en 2-3 semanas después de A. rhizogenes inoculación. Bajo el microscopio de rayos UV, las raíces transgénicas portadoras del gen GFP muestran una fuerte fluorescencia verde (Fig. 1). La cantidad de raíces regeneradas y la porción de las raíces de las buenas prácticas agrarias positivo dependerá de las condiciones de los explantes y el medio ambiente de crecimiento compuesta promedio plants.On, el 25% de las raíces se producen transgénicos raíces peludas 3. Para aumentar la eficiencia de transformación, 1) la condena cubierta de plástico, como se muestra en el video, es suficiente para mantener la humedad en la bandeja de crecimiento para los primeros días, y las plantas sólo requieren poca agua en los primeros días. El riego excesivo es perjudicial para la formación de raíces peludas, 2) la concentración de inoculante Agrobacterium es importante para la transformación. Cantidad excesiva de las células no son útiles para la formación de raíces peludas o formación de nódulos. Para la formación de nódulos, la solución de las necesidades de riego que se libre de nitrógeno, de lo contrario, los nódulos de pocos formulario. Las plantas de raíz compuesta peludos se pueden generar con los cotiledones o plántulas Entact como material de partida. Sólo modificaciones menores del protocolo anterior se ncessary para generar raíces peludas de otros tejidos 8. Es importante destacar que cada raíz peluda es un evento de transformación independientes. Por lo tanto, los fenotipos observados en una planta de compuestos son la suma de eventos transforamtion varios que necesitan ser confirmados por las repeticiones en varias plantas compuestas <img src="/files/ftp_upload/2633/2633fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A. raíces transgénicas pueden ser resueltos a partir de raíces peludas. B. Los nódulos se formaron en las plantas de raíz compuesta peludo. Colocamos cuatro semanas de edad M. plantas truncatula peludas raíces en la UV-microscopio y las raíces GFP positivos pueden ser fácilmente identificados. (Flecha roja: La raíz de las buenas prácticas agrarias; Flecha amarilla: no GFP raíz) <table border="1"><tbody><tr><td> Valores </td><td> g/200ml </td><td> ml de caldo / litro </td></tr><tr><td> MgSO 4 .7 H 2 O </td><td> 12.3 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> CaCl2 .2 H 2 O </td><td> 14.7 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 .3 H 2 O </td><td> 6.8 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> K 2 SO 4 </td><td> 11 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Fe Cl 3 .6 H 2 O </td><td> 0.49 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Micronutrientes </td><td> Ver más abajo </td><td> 1 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Micronutrientes </td><td> g por litro </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> 0.142 </td></tr><tr><td> MnSO 4. H 2 O </td><td> 0.077 </td></tr><tr><td> ZnSO 4 .7 H 2 O </td><td> 0,1725 </td></tr><tr><td> CuSO 4 .5 H 2 O </td><td> 0.037 </td></tr><tr><td> NaMoO 4. H 2 O </td><td> 0.024 </td></tr><tr><td> CoCl 2. H 2 O </td><td> 0,0025 </td></tr><tr><td> NiSO4 </td><td> 0.001 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Nitogen sin solución de la nutrición <table border="1"><tbody><tr><td> K 2 HPO4 </td><td> 0,5 g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> 0,2 g </td></tr><tr><td> Extracto de levadura </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> Manitol </td><td> 10g </td></tr><tr><td> pH = 6,8 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2. Medio de extracto de levadura manitol (por litro)

<ol><li>Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).</li>
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<li>Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavones+and+flavonols+play+distinct+critical+roles+during+nodulation+of+Medicago+truncatula+by+Sinorhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti.</a> Plant J. 57, 171-183 (2009).</li>
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</ol>

La generación de raíces de las plantas compuestas peluda es un método rápido y fácil de obtener grandes cantidades de material transgénico para muchas especies de dicotiledóneas. Aunque este método no puede producir semillas transgénicas, se puede producir materiales transgénicos en unas pocas semanas. El método es especialmente adecuado para las plantas que tienen dificultades para establecer cultivos de tejidos o la generación de transformantes estables. Con los años, hemos utilizado esta tecnología para estudiar las funciones de genes, las funciones de promotor, los microARNs, las raíces y el desarrollo de las raíces laterales, la defensa y las respuestas de estrés abiótico, la nodulación y otros procesos simbióticos, las respuestas hormonales, perfil metabólico, el perfil de genes, el análisis proteómico, y otros procesos biológicos. El protocolo es robusto y replicable.

generación de plantas compuestas en medicago truncatula utilizado para los ensayos nodulación

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Al igual que en tumerfaciens Agrobacterium, rhizogenes puede transferir ADN extraño en células de las plantas sobre la base de las comunidades autónomas de raíz la inducción (Ri) del plásmido. A. rhizogenes puede causar la formación de raíces peludas en los tejidos vegetales y forma de las plantas compuestas después de la transformación. En estas plantas compuestas, algunas de las raíces regeneradas son transgénicos, llevando el tipo salvaje del T-ADN y el vector binario de ingeniería, mientras que los brotes siguen siendo los no transgénicos, que sirve para proporcionar energía y apoyar el crecimiento. Estas plantas de raíz compuesta peludo no productoras de semillas transgénicas, pero hay una serie de características importantes que hacen que estas plantas compuestos muy útiles en la investigación de las plantas. En primer lugar, con una amplia gama de huéspedes, A. rhizogenes puede transformar muchas especies de plantas, especialmente en las dicotiledóneas, lo que permite la ingeniería genética en una variedad de especies. En segundo lugar, A. rhizogenes infectar los tejidos y los explantes directamente, sin cultivos de tejidos antes de la transformación es necesaria para la obtención de plantas compuestas, lo que es ideal para la transformación de las especies recalcitrantes de la planta. Por otra parte, los tejidos transgénicos raíz se pueden generar en cuestión de semanas. De Medicago truncatula, podemos obtener las raíces de transgénicos en tan corto como tres semanas, más rápido de lo normal floral dip transformación de Arabidopsis. En general, la tecnología de raíces peludas planta compuesta es una herramienta versátil y útil para estudiar las funciones de genes y fenotipos relacionados con la raíz. Aquí se demuestra cómo las plantas peludas raíces compuesto puede ser utilizado para estudiar las interacciones planta-rizobio y la nodulación en el M. difíciles de transformar las especies truncatula.

Se demuestra cómo las plantas peludas raíces compuesto puede ser utilizado para estudiar las interacciones planta-rizobio y la nodulación en las difíciles de transformar las especies<em&gt; Medicago truncatula</em&gt;.

Generación de plantas compuestas en Medicago truncatula Utilizado para los ensayos nodulación

De manera similar a Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes puede transferir ADN foráneo a células vegetales basándose en el plásmido Ri (inductor de raíces) autónomo...

Hola, mi nombre es Oliver Yu en el Centro de Ciencias Vegetales Dan. Hoy les mostraremos cómo generar plantas de Ute Compote mediante Agrobacterium Ogn. Esta técnica fue introducida en el Centro Dan por el Dr. Chris Taylor, actualmente en la Universidad Estatal de Ohio.Varios de mis antiguos miembros del grupo han mejorado estas técnicas a lo largo de los años y, actualmente, mi miembro actual del grupo, el Dr. Stone y Mao, han elaborado este video para mostrar cómo se producen los planes compuestos de Harry Root. Las Agrobacterium ZOS son muy similares a la Agrobacterium tumefaciens en que introducen ADN foráneo en las plantas, pero las ZOS pueden inducir una mayor formación de raíces en tejidos de tipo silvestre, formando plantas compuestas como esta. Así pues, en estas plantas compuestas, algunas de las raíces son transgénicas, mientras que los brotes siguen siendo de tipo silvestre.Por lo tanto, esta tecnología no producirá semillas transgénicas. Sin embargo, existen tres ventajas principales de las plantas con altas concentraciones de raíz de campilo que hacen que esta tecnología sea muy útil. En primer lugar, muchas especies vegetales, especialmente las especies dicotiledóneas, pueden ser transformadas mediante bacterias agrobacterianas.Segundo, no necesitamos establecer un cultivo de tejidos previamente a la transformación. Podemos tomar muchas partes de las plantas, como plántulas, brotes y co, para generar plantas campilóctonas directamente. Y finalmente, podemos obtener tejido radicular transgénico en cuestión de semanas.Para la transformación de cargas de soja y medic, podemos obtener raíces transgénicas en tan solo tres semanas, más rápido que una transformación OPIS. En general, la tecnología de plantas con raíces citoplásmicas elevadas es una herramienta muy útil para estudiar funciones génicas y fenotipos relacionados con las raíces. No. Hola, mi nombre es Ong.Hola, mi nombre es, ahí está mi camarógrafo Bill. Hoy presentaremos el protocolo de la planta compuesta de Harry Root. Sí, utilizamos este protocolo en varios de nuestros proyectos.Ya, comenzamos, sí. Sí. Para nuestra demostración, usaremos meta cargo Tula como ejemplo. Estas son vainas meta cargo maduras.Coloque las vainas sobre una caja de molienda y luego muela las vainas con un movimiento largo y firme. Separe las semillas de las vainas agitando suavemente y coloque las semillas en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, agregue cinco mililitros de ácido sulfúrico concentrado.Escarificación muy cuidadosa. Toma aproximadamente 10 minutos. Agite el tubo en vórtice ácido dos o tres veces.Durante el tratamiento ácido, la cubierta de la semilla cambiará a un color amarillo. Retire el ácido sulfúrico del tubo y enjuague las semillas al menos cinco veces con agua estéril. Remoje las semillas en agua desionizada a temperatura ambiente durante seis horas, y luego guárdelas a cuatro grados centígrados durante dos días.Para sincronizar la germinación, distribuya de 20 a 30 semillas sobre papel de filtro húmedo en la placa de Petri. Después de cinco a seis días, transfiera las plántulas a suelo y cultívelas en el invernadero durante cuatro semanas.Para la transformación de plantas compuestas, normalmente utilizamos la cepa de agrobacterium Zony K 5 99. El vector acarreador o vector binario puede introducirse en la cepa K 5 99 siguiendo el protocolo estándar de transformación de agrobacterium tumefaciens. Inocule el agrobacterium, incúbelo a 30 grados centígrados durante 16 a 24 horas; tras el período de crecimiento, recolecte las células colocando la solución de cultivo en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.Colóquelo en la centrífuga a 5,000 G durante 30 minutos. Reuspenda el sedimento con solución nutritiva libre de nitrógeno. Asegúrese de diluir las células de agrobacterium a 0,3 en OD 600.Esta concentración es importante para lograr una transformación máxima. Utilizamos roca triturada como matriz de soporte. El uso de este material es importante para una transformación de alta frecuencia.Corte la pared de roca al tamaño adecuado. Enchufe. Haga un orificio en la parte superior de aproximadamente uno y medio a dos centímetros de diámetro. Utilizando una punta de pipeta, agregue cinco mililitros de solución de Agrobacterium Zony resuspendida en cada enchufe.Seleccione una sección del tallo con dos o tres yemas axilares y realice un corte oblicuo. Introduzca las secciones de la planta en el orificio de la pared rocosa. Coloque las plantas cortadas en una cámara de crecimiento o en el banco de laboratorio durante tres semanas.Agregue cinco mililitros de solución nutritiva en cada bloque cada 10 días. Después de tres semanas, las raíces se regeneran desde el lado cortado. Sumerja la planta en agua.Retire cuidadosamente la pared de roca ablandada y no dañe las raíces. Asegúrese de eliminar toda la pared de roca. Puede transferir las plantas compuestas de raíces peludas a arena o perlita. Para experimentos de simbiosis, cultive el rizobio en un medio de extracto de levadura y manitol durante siete días a 30 grados Celsius.Recoger las células de zoia resuspendidas. Suspender el precipitado con la solución nutriente libre de nitrógeno. Diluir la solución hasta 0,08 en OD 600.Añada 10 mililitros de solución ZOA a cada cultivo de planta compuesta, y cultive la planta durante dos o tres semanas adicionales para permitir la formación de nódulos. Retire la arena de las plantas compuestas desenterrándolas y lavándolas. Utilice la expresión de la proteína verde fluorescente para verificar la raíz transgénica.Utilizará un microscopio fluorescente para realizar esto. Todos nuestros constructos de raíces peludas tienen un casete GFP constitutivo para la selección de líneas transgénicas. Esta imagen muestra las plantas compuestas de raíces peludas transgénicas GFP observadas en el microscopio fluorescente.Las raíces transgénicas con fluorescencia verde más intensa son fáciles de distinguir de las raíces no transgénicas. Se forman nódulos en la raíz peluda de las plantas compuestas. A continuación se presenta el protocolo completo.Una vez más, la generación de plantas compuestas de raíces peludas es un método rápido y sencillo para obtener grandes cantidades de tejido transgénico, especialmente para especies de diploides. Aunque este método no permite obtener semillas transgénicas, puede producir material transgénico en unas pocas semanas. Es especialmente adecuado para plantas que tienen dificultades para establecer cultivo de tejidos y transformación.A lo largo de los años, hemos utilizado esta tecnología para estudiar funciones génicas, funciones de promotores, microARNs, desarrollo de raíces y raíces laterales, respuesta al estrés por defensa y antibióticos, nodulación y otros procesos simbióticos. Hemos estudiado la respuesta hormonal, el perfilado metabólico, el perfilado génico y el análisis proteómico utilizando plantas compuestas de raíces superiores. Esperamos que este video le ayude a adaptar este sistema a su especie preferida.Quedamos a su disposición para cualquier pregunta relacionada con esta tecnología y le deseamos mucha suerte.

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Investigación

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Biology

Biología

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