Generación de plantas compuestas en Medicago truncatula Utilizado para los ensayos nodulación
27 de marzo de 2011
Se demuestra cómo las plantas peludas raíces compuesto puede ser utilizado para estudiar las interacciones planta-rizobio y la nodulación en las difíciles de transformar las especies Medicago truncatula.
Hola, mi nombre es Oliver Yu en el Centro de Ciencias Vegetales Dan. Hoy les mostraremos cómo generar plantas de Ute Compote mediante Agrobacterium Ogn. Esta técnica fue introducida en el Centro Dan por el Dr. Chris Taylor, actualmente en la Universidad Estatal de Ohio.
Varios de mis antiguos miembros del grupo han mejorado estas técnicas a lo largo de los años y, actualmente, mi miembro actual del grupo, el Dr. Stone y Mao, han elaborado este video para mostrar cómo se producen los planes compuestos de Harry Root. Las Agrobacterium ZOS son muy similares a la Agrobacterium tumefaciens en que introducen ADN foráneo en las plantas, pero las ZOS pueden inducir una mayor formación de raíces en tejidos de tipo silvestre, formando plantas compuestas como esta. Así pues, en estas plantas compuestas, algunas de las raíces son transgénicas, mientras que los brotes siguen siendo de tipo silvestre.
Por lo tanto, esta tecnología no producirá semillas transgénicas. Sin embargo, existen tres ventajas principales de las plantas con altas concentraciones de raíz de campilo que hacen que esta tecnología sea muy útil. En primer lugar, muchas especies vegetales, especialmente las especies dicotiledóneas, pueden ser transformadas mediante bacterias agrobacterianas.
Segundo, no necesitamos establecer un cultivo de tejidos previamente a la transformación. Podemos tomar muchas partes de las plantas, como plántulas, brotes y co, para generar plantas campilóctonas directamente. Y finalmente, podemos obtener tejido radicular transgénico en cuestión de semanas.
Para la transformación de cargas de soja y medic, podemos obtener raíces transgénicas en tan solo tres semanas, más rápido que una transformación OPIS. En general, la tecnología de plantas con raíces citoplásmicas elevadas es una herramienta muy útil para estudiar funciones génicas y fenotipos relacionados con las raíces. No. Hola, mi nombre es Ong.
Hola, mi nombre es, ahí está mi camarógrafo Bill. Hoy presentaremos el protocolo de la planta compuesta de Harry Root. Sí, utilizamos este protocolo en varios de nuestros proyectos.
Ya, comenzamos, sí. Sí. Para nuestra demostración, usaremos meta cargo Tula como ejemplo. Estas son vainas meta cargo maduras.
Coloque las vainas sobre una caja de molienda y luego muela las vainas con un movimiento largo y firme. Separe las semillas de las vainas agitando suavemente y coloque las semillas en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, agregue cinco mililitros de ácido sulfúrico concentrado.
Escarificación muy cuidadosa. Toma aproximadamente 10 minutos. Agite el tubo en vórtice ácido dos o tres veces.
Durante el tratamiento ácido, la cubierta de la semilla cambiará a un color amarillo. Retire el ácido sulfúrico del tubo y enjuague las semillas al menos cinco veces con agua estéril. Remoje las semillas en agua desionizada a temperatura ambiente durante seis horas, y luego guárdelas a cuatro grados centígrados durante dos días.
Para sincronizar la germinación, distribuya de 20 a 30 semillas sobre papel de filtro húmedo en la placa de Petri. Después de cinco a seis días, transfiera las plántulas a suelo y cultívelas en el invernadero durante cuatro semanas.
Para la transformación de plantas compuestas, normalmente utilizamos la cepa de agrobacterium Zony K 5 99. El vector acarreador o vector binario puede introducirse en la cepa K 5 99 siguiendo el protocolo estándar de transformación de agrobacterium tumefaciens. Inocule el agrobacterium, incúbelo a 30 grados centígrados durante 16 a 24 horas; tras el período de crecimiento, recolecte las células colocando la solución de cultivo en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Colóquelo en la centrífuga a 5,000 G durante 30 minutos. Reuspenda el sedimento con solución nutritiva libre de nitrógeno. Asegúrese de diluir las células de agrobacterium a 0,3 en OD 600.
Esta concentración es importante para lograr una transformación máxima. Utilizamos roca triturada como matriz de soporte. El uso de este material es importante para una transformación de alta frecuencia.
Corte la pared de roca al tamaño adecuado. Enchufe. Haga un orificio en la parte superior de aproximadamente uno y medio a dos centímetros de diámetro. Utilizando una punta de pipeta, agregue cinco mililitros de solución de Agrobacterium Zony resuspendida en cada enchufe.
Seleccione una sección del tallo con dos o tres yemas axilares y realice un corte oblicuo. Introduzca las secciones de la planta en el orificio de la pared rocosa. Coloque las plantas cortadas en una cámara de crecimiento o en el banco de laboratorio durante tres semanas.
Agregue cinco mililitros de solución nutritiva en cada bloque cada 10 días. Después de tres semanas, las raíces se regeneran desde el lado cortado. Sumerja la planta en agua.
Retire cuidadosamente la pared de roca ablandada y no dañe las raíces. Asegúrese de eliminar toda la pared de roca. Puede transferir las plantas compuestas de raíces peludas a arena o perlita. Para experimentos de simbiosis, cultive el rizobio en un medio de extracto de levadura y manitol durante siete días a 30 grados Celsius.
Recoger las células de zoia resuspendidas. Suspender el precipitado con la solución nutriente libre de nitrógeno. Diluir la solución hasta 0,08 en OD 600.
Añada 10 mililitros de solución ZOA a cada cultivo de planta compuesta, y cultive la planta durante dos o tres semanas adicionales para permitir la formación de nódulos. Retire la arena de las plantas compuestas desenterrándolas y lavándolas. Utilice la expresión de la proteína verde fluorescente para verificar la raíz transgénica.
Utilizará un microscopio fluorescente para realizar esto. Todos nuestros constructos de raíces peludas tienen un casete GFP constitutivo para la selección de líneas transgénicas. Esta imagen muestra las plantas compuestas de raíces peludas transgénicas GFP observadas en el microscopio fluorescente.
Las raíces transgénicas con fluorescencia verde más intensa son fáciles de distinguir de las raíces no transgénicas. Se forman nódulos en la raíz peluda de las plantas compuestas. A continuación se presenta el protocolo completo.
Una vez más, la generación de plantas compuestas de raíces peludas es un método rápido y sencillo para obtener grandes cantidades de tejido transgénico, especialmente para especies de diploides. Aunque este método no permite obtener semillas transgénicas, puede producir material transgénico en unas pocas semanas. Es especialmente adecuado para plantas que tienen dificultades para establecer cultivo de tejidos y transformación.
A lo largo de los años, hemos utilizado esta tecnología para estudiar funciones génicas, funciones de promotores, microARNs, desarrollo de raíces y raíces laterales, respuesta al estrés por defensa y antibióticos, nodulación y otros procesos simbióticos. Hemos estudiado la respuesta hormonal, el perfilado metabólico, el perfilado génico y el análisis proteómico utilizando plantas compuestas de raíces superiores. Esperamos que este video le ayude a adaptar este sistema a su especie preferida.
Quedamos a su disposición para cualquier pregunta relacionada con esta tecnología y le deseamos mucha suerte.
Descripción general
Este artículo demuestra la generación de plantas compuestas de raíces peludas para estudiar las interacciones planta-rizobio y la nodulación en Medicago truncatula. La técnica permite la producción rápida de tejido radicular transgénico sin necesidad de métodos tradicionales de cultivo de tejidos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología vegetal
- Ingeniería genética
- Relaciones simbióticas
Antecedentes
- Las plantas compuestas de raíces pilosas se producen mediante transformación mediada por Agrobacterium.
- Este método es particularmente útil para especies que son difíciles de transformar.
- Las raíces transgénicas pueden generarse en cuestión de semanas.
- Las plantas compuestas consisten en raíces transgénicas y brotes de tipo silvestre.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para generar plantas compuestas con raíces pilosas.
- Facilitar el estudio de las funciones genéticas y los procesos de nodulación.
- Proporcionar un método rápido para obtener material transgénico.
Métodos Utilizados
- Transformación de Agrobacterium en semillas de Medicago truncatula.
- Uso de soluciones nutritivas libres de nitrógeno para el crecimiento de plantas.
- Microscopía fluorescente para identificar raíces transgénicas.
- Inducción de nodulación mediante la aplicación de cultivos de rizobios.
Resultados Principales
- Generación exitosa de plantas compuestas transgénicas de raíces peludas.
- Se observó la formación de nódulos en raíces transgénicas.
- Se logró la producción rápida de raíces transgénicas en cuestión de semanas.
- El método es aplicable a diversas especies vegetales de difícil transformación.
Conclusiones
- Las plantas compuestas de raíces peludas son una herramienta valiosa para el estudio de la genética vegetal.
- Esta técnica permite una exploración eficiente de fenotipos relacionados con las raíces.
- Ofrece una alternativa rápida a los métodos tradicionales de transformación vegetal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La generación rápida de plantas compuestas en Medicago truncatula utilizando Agrobacterium rhizogenes permite acelerar los estudios de genómica funcional y fenotipos radiculares en especies recalcitrantes a la transformación tradicional. Este enfoque facilita la validación temprana de objetivos y la reducción del riesgo mecanicista para características asociadas a la raíz, incluyendo la nodulación y las interacciones simbióticas. La rapidez y versatilidad del método mejoran la toma de decisiones en carteras de investigación y desarrollo en biotecnología vegetal.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la función génica en tejidos radiculares relevantes para la nodulación y la simbiosis.
- Facilita la reducción de riesgos biológicos al evitar los cuellos de botella del cultivo de tejidos en especies de difícil transformación.
- Apoya la confianza predictiva en la manipulación de caracteres radiculares para los procesos de validación de caracteres.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona una producción rápida de raíces transgénicas validadas para ensayos fenotípicos posteriores.
- Permite la selección reproducible de constructos génicos mediante la selección basada en GFP en raíces compuestas.
- Facilita el desarrollo de ensayos escalables para estudios de interacción entre raíces y microorganismos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con el descubrimiento de biomarcadores traslacionales para fenotipos asociados a raíces en modelos de leguminosas.
- Mantiene la continuidad desde el descubrimiento de la función génica hasta la validación preclínica de caracteres radiculares.
- Reduce el riesgo al avanzar candidatos en programas de mejora de caracteres agronómicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de planta compuesta se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica para la investigación y desarrollo de características vegetales, particularmente para estudios de biología radicular e interacciones simbióticas.
- Biología del Descubrimiento: Acelera la verificación de hipótesis sobre la función génica en tejidos radiculares sin necesidad de generar semillas transgénicas.
- Selección: Proporciona raíces transgénicas listas para ensayos y validadas mediante GFP para el análisis cuantitativo de nodulación y fenotipos.
- Análisis: Permite medir la nodulación, el desarrollo radicular y la expresión de transgenes mediante microscopía de fluorescencia.
- Investigación Traducional: Facilita la evaluación preclínica de caracteres radiculares en un sistema modelo de leguminosas relevante para la mejora de cultivos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para la genómica funcional rápida en diversas especies de dicotiledóneas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de rasgos radiculares y reduce la ambigüedad mecanicista en estudios simbióticos.
- Valor operativo: Optimiza los flujos de trabajo al eliminar el cultivo de tejidos y permitir la transformación radicular de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o descarte para el desarrollo de rasgos y potencia la eficiencia del capital en I+D vegetal.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas génicas y candidatos de rasgos para su posterior desarrollo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en transformación vegetal y cribado basado en fluorescencia.
- Necesita acceso a cámaras de crecimiento, técnica estéril e infraestructura de microscopía de fluorescencia.
- Exige estandarización entre equipos para lograr reproducibilidad en la transformación y el fenotipado.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes especies vegetales o fenotipos radiculares.
- No produce semillas transgénicas, lo que limita los estudios de heredabilidad a los tejidos radiculares.
