El análisis del transcriptoma de células individuales

El objetivo general de este procedimiento es preparar muestras de células individuales para el análisis del transcriptoma. Esto se logra encontrando primero una celda adecuada para el aislamiento. A continuación, la micropipeta se coloca junto a la célula que se va a aislar.

A continuación, se aplica la succión a la jeringa hasta que la célula se introduce en la punta de la micropipeta. El paso final del procedimiento es romper la punta de la micropipeta en el tubo de recolección y expulsar el contenido restante de la micropipeta en el tubo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren diferencias en las poblaciones de ARNm entre células mediante el análisis de microarrays de material amplificado mediante el método de amplificación de arna, también descrito en el protocolo o para otras aplicaciones como la PCR o la secuenciación de próxima generación.

Aunque este método puede proporcionar información y las diferencias entre las células individuales, también se puede aplicar a compartimentos subcelulares como dendritas o clases de dendritas, y proporcionar información importante sobre la función de las dendritas. La demostración del procedimiento estará a cargo de Jennifer Singh, una postdoc en mi laboratorio Antes del inicio de este protocolo, las neuronas primarias del día embrionario 18, Hippo Campi de rata, se colocaron en cubreobjetos de 12 milímetros en un plato de 35 milímetros y se mantuvieron como se describe en el protocolo escrito. Para preparar las pipetas para la cosecha, utilice un microextractor de pipetas para tirar de las pipetas de vidrio de autoclave hasta un diámetro adecuado para la electrofisiología.

Usando el programa preestablecido del fabricante, el tamaño del orificio no es crítico, ya que la punta se romperá antes de la recolección de la celda. Guarde cuidadosamente las pipetas en un entorno libre de polvo, como un frasco de almacenamiento de micropipetas, donde las puntas permanecerán intactas cuando estén listas para recolectar células. Prepare el número deseado de tubos de einor de 1,7 mililitros añadiendo dos microlitros de PBS para el almacenamiento del material cosechado.

Retire 1 plato de 35 milímetros de cubreobjetos de la incubadora en una campana de cultivo de tejidos. Transfiera rápidamente un cubreplatos de este plato a la tapa de un nuevo plato de 35 milímetros que contenga HBSS. Es fundamental devolver a la incubadora los cubreobjetos que no estén siendo manipulados, ya que las células se vuelven poco saludables.

Si se deja fuera por períodos prolongados de tiempo. Para la recolección de células es necesario un microscopio de luz invertida con un objetivo de 40 x equipado con un micromanipulador. Utilice un soporte de pipeta con un tubo flexible que se aleje del soporte, fije el tubo a una superficie estable para evitar movimientos no deseados de la pipeta durante la recolección.

Al final del tubo, inserte una aguja de modo que se pueda conectar y cambiar una jeringa de un mililitro con una conexión de bloqueo de señuelo entre usuarios. Prepare la micropipeta rompiendo la punta de forma controlada sosteniendo una toallita Kim tensa entre los dedos de una mano y rozando muy suavemente la punta de la pipeta por el papel una o dos veces. La apertura debe ser aproximadamente del 75 al 100% del tamaño de la célula objetivo.

Fije la micropipeta en el soporte de micropipetas y fije el soporte de micropipetas al inserto de los micromanipuladores. Por último, establece el objetivo 40 x. Coloque el plato en la etapa del microscopio y encuentre una región de células adecuada para la cosecha.

En el caso de los cultivos neuronales primarios, la célula debe estar relativamente aislada de sus vecinas. Para evitar la recolección de células y/o procesos circundantes, coloque la célula que se va a recolectar en el centro del campo de visión. Utilice el micromanipulador para hacer avanzar la micropipeta hacia la solución en el plato hacia la trayectoria de la luz.

Baje la punta de la pipeta en la solución. Mirando a través del ocular, la pipeta debe aparecer como una sombra en el campo de visión. Aplique presión positiva a partir de este punto soplando ligeramente a través de la jeringa muy por encima del plano de las células.

Ajuste la posición de la punta de pipeta hasta que esté dentro del campo de visión y enfoque la punta de pipeta con los mandos de enfoque de curso. En este punto, evalúe si el tamaño del orificio de la pipeta es demasiado grande o demasiado pequeño. Si el tamaño del orificio es incorrecto, reemplácela por otra micropipeta hasta encontrar el tamaño correcto del orificio Para evitar la rotura de la pipeta en la región de recolección.

Utilice el enfoque de curso para avanzar el plano focal antes de avanzar la punta de la pipeta hacia las células utilizando los manipuladores de micrómetros. A medida que las células se acerquen, utilice el enfoque fino hasta que tanto las células como la punta de la pipeta estén enfocadas. Deje de aplicar presión positiva antes de llegar a las celdas del demandante para evitar que se desprendan del cubreobjetos.

Coloque la punta de la pipeta con los micromanipuladores de modo que toque el soma celular que se va a recolectar. Con la jeringa, aplique una succión suave por la boca hasta que la célula entre en la punta de la pipeta. Si la célula no entra en la pipeta, acerque suavemente la punta a la célula y la descienda hasta que se levante del cubreobjetos.

Utilice el micromanipulador para mover inmediatamente la pipeta hacia arriba y fuera de la solución. Retire la pipeta del soporte. Sostenga el tubo einor de 1,7 mililitros preparado con una mano y rompa suavemente la punta de la pipeta en el lado del tubo hacia la parte inferior.

Con el objetivo de llegar a la marca de 0,1 mililitros con la punta rota centrada dentro del tubo, inserte una aguja conectada a una jeringa de un mililitro en la abertura superior de la pipeta. Presione rápidamente el émbolo, forzando la solución de la pipeta a rociarse en el tubo. Tenga cuidado de no tocar la punta con ningún líquido en los lados del tubo.

Dado que la acción capilar devolverá el líquido a la pipeta, la célula debe permanecer en la punta de la pipeta, y esto debe ser adecuado para expulsar correctamente la célula. Gire rápidamente el contenido del tubo con un microfuge de escritorio y congélelo en hielo seco o colóquelo en hielo para su posterior procesamiento o para otras aplicaciones como PCR o secuenciación de próxima generación. Aquí se muestra un ejemplo de una cosecha exitosa de una neurona aislada.

Para empezar, se seleccionó una región de células de densidad relativamente baja. A continuación, la punta de la pipeta se avanzó hacia la célula deseada. Aquí se muestra el campo de visión después de que se haya recolectado la célula.

Tenga en cuenta que los procesos circundantes permanecen en el comprobante. Por el contrario, esta figura muestra dos imágenes de puntas de pipeta, que tienen un tamaño inadecuado para una cosecha eficaz. Esta punta conducirá a una cosecha incompleta, mientras que la punta que se muestra aquí dará como resultado la cosecha del entorno circundante.

Después de la recolección y un análisis de amplificación de ARN, se recomienda el uso de un bioanalizador para examinar la distribución y la cantidad de ARN amplificado. Una amplificación exitosa a partir de material unicelular producirá cantidades totales en microgramos bajos y tendrá una distribución suave y amplia Una vez dominada, esta técnica se puede completar en minutos si se realiza correctamente mientras se realiza este procedimiento, es importante utilizar la técnica libre de ARN.