Name: El análisis del transcriptoma de células individuales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprende a aislar células individuales de cultivos neuronales primarios de rata para análisis de transcriptoma mediante amplificación de aRNA. Este método permite estudiar la expresión génica a nivel de célula única.

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Gracias a Kevin Miyashiro para la siembra y mantenimiento de cultivos de células, a la Dra. Terri Schochet para proporcionar cultivos de células de las imágenes incluidas en este documento. Además, gracias a Kevin Miyashiro, el Dr. Peter Buckley, y Pertiz Tiina para la entrada en el procedimiento de ARNA. La financiación de este trabajo fue del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento, el Instituto Nacional de Salud Mental y los recursos humanos fondos Buscador de Hecho de la Comunidad de Pennsylvania.

<ol><li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li>
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<li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+analysis%3A+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neeurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MinElute+Handbook+For+MinElute+Reaction+Cleanup+Kit%22">MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit</a>. , Qiagen. 28-29 (2004).</li>
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<li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li>
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<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
<li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li>
<li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis%3A+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+%28PREXCEL-Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li>
<li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li>
<li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li>
</ol>

Dr. Eberwine es un inventor de la patente ARNA que se ha autorizado a las tecnologías de LBS en la cual el Dr. Eberwine es un accionista.

Notas y solución de problemas <ul><li> Es posible que desee tomar antes y después de las imágenes que muestran que la célula diana fue aislado y que la penumbra restante fue dejado intacto. </li><li> Si demasiada solución es entrar en la pipeta a medida que se cosecha, se puede utilizar de 3 vías Luer-Lock accesorios y el émbolo de la jeringa para mantener la presión positiva en la tubería. El volumen deseado varía con el tipo de procesamiento, sino hasta 5 l es suficiente para la mayoría de las aplicaciones. </li></ul> Consejos generales sobre técnicas de biología molecular <ul><li> Vortex los tubos de valores y el giro hacia abajo antes de añadir a una reacción. NUNCA enzimas vórtice. </li><li> Mezclar bien las reacciones antes de añadir la enzima para asegurar que el buffer está en la concentración adecuada. </li><li> Mantener las poblaciones de la enzima a -20 ° C, si es posible mediante el uso de un stratacooler. De lo contrario, eliminar el derecho antes de su uso, mantener en hielo, y regresar de inmediato a -20 ° C. </li><li> Siempre hacen mezclas maestras en la preparación de más de una reacción para reducir los errores de pipeteo. Calcular el volumen requerido en función del número de muestras y añadir un 10-20%. </li><li> Tienda de ARN a -80 ° C a la degradación de retraso. El ARN es más estable almacenada en el búfer de apurination retraso de ARN que se produce en condiciones ácidas. </li></ul> Esquema general del procedimiento de ARNA Figura 4 ilustra la primera ronda del procedimiento de ARNA. En la reacción de la primera cadena, la parte de poli-T de la T7-oligo (dT) primer selecciona para las especies de ARNm (rectángulo blanco de largo) al unirse a la cola de poliA. Algunos microARN también poliadenilado y serán capturadas por este procedimiento. Más importante, sin embargo, el ARN más abundante en la célula, ARN ribosomal, no lo hará. Este oligo actúa como un manual para la transcriptasa reversa para sintetizar una hebra complementaria de cDNA (rectángulo gris de largo) utilizando el ARNm como molde. La parte de la T7 T7-oligo (dT) primer incorpora el promotor T7 RNA polimerasa en el marco con la secuencia antisentido al ARNm de partida. Esto se utiliza posteriormente en la reacción de transcripción in vitro en. A continuación, el ARNm en el híbrido de mRNA / ADN creado en el paso anterior es parcialmente hidrolizada por la RNasa H crear ARN &quot;primers&quot; (pequeños rectángulos de color blanco) similares a los fragmentos de Okazaki creado en la síntesis quedando la cadena de ADN. ADN polimerasa I utiliza los fragmentos de ARN para la síntesis del ADN con el ADN complementario al ARNm como molde. Cuando se llega al siguiente fragmento de ARN, el 5 &#39;a 3&#39; nucleasa elimina los ribonucleótidos y las reemplaza con desoxirribonucleótidos. ADN ligasa se añade a ligar los hilos en la sustitución de la principal línea no está completa. T4 DNA polimerasa se añade a rellenar las áreas donde los fragmentos de ARN sirve como cebadores inicial de la ADN polimerasa I la creación de un extremo romo de doble hebra de ADNc que se purifica antes de realizar la reacción de IVT. En la reacción de IVT, T7 ARN polimerasa se une al promotor T7 incorporado en las moléculas de ADNc de doble cadena y sintetiza el ARN antisentido (largo rectángulos negro) con la cadena de sentido como una plantilla. Esto sirve como el paso de amplificación en la que miles de moléculas de ARN antisentido se producen por cada molécula de doble hebra de ADNc (Figura 4). La segunda ronda, como se muestra en la Figura 4B, se inicia con una reacción de transcripción inversa que es ligeramente diferente de la de la primera ronda ya que el ARN antisentido de partida es (rectángulo negro sólido) y carece de la cola poliadenilado que fue objeto de la T7-oligo (dT) primer en la primera ronda. Por lo tanto, esta reacción se ceba con cebadores aleatorios (pequeños rectángulos grises) y posteriormente la desnaturalización del ARN. La reacción del segundo elemento es entonces preparado por la T7-oligo (dT) primer, que se une a la secuencia de poli-A en el extremo 3 &#39;del ARN sentido creado en la reacción de transcripción inversa anterior. Otra reacción IVT se realiza en la misma forma que en la primera ronda. Esta segunda ronda se suele repetir al menos una vez para lograr tres rondas de amplificación de una sola célula. Aplicaciones Las técnicas que hemos presentado en este artículo se puede traducir en un gran número de aplicaciones. El protocolo de una sola celda de aislamiento puede ser modificado para su uso en rodajas aguda. 14 Aunque técnicamente más difícil, los mismos principios se aplican en esta preparación alternativa. Además, si el tamaño de la pipeta es un poco ajustado, las grabaciones de la fisiología de las células se pueden hacer antes de la cosecha teniendo en cuenta una investigación bien controlada de los mecanismos moleculares que subyacen a los productos fisiológicos. Otra pequeña modificación consiste en aislar los procesos, desde el soma celular. 15 Para esta aplicación, recoger los cuerpos de células con una pipeta y luego volver con una pipeta nueva y recoger 100-300 Dendrit identificadoes o axones por tubo de recolección. 16 Una vez que las células se han obtenido, la comparación de la abundancia de ARNm y las composiciones se pueden hacer entre diferentes e incluso dentro de las poblaciones de la misma célula. La incorporación de biotina-UTP en el ARNA tercera ronda permite el análisis de microarrays para determinar las abundancias relativas de ARNm. La composición de la población de ARNm original también se puede determinar después de la intervención ARNA utilizando secuenciación de próxima generación. El ARNA amplificada también se puede utilizar para confirmar la célula estudios de conversión fenotipo en el que se transfectaron un conjunto completo de los ARNm de un tipo de células en un tipo celular diferente con el fin de inducir la transición del fenotipo del tipo de célula en que esta última de la primera, un procedimiento desarrollado por el laboratorio y se conoce como TIPeR 17. Estos estudios son particularmente útiles para el estudio de los estados de enfermedad y de fenotipos de células y estos estudios están actualmente en curso en el laboratorio. RT-PCR o PCR cuantitativa se puede realizar en el material amplificado para confirmar la expresión de genes específicos de la célula. Además, las evaluaciones de la eficacia de transfección o transducción se pueden hacer en el nivel de células individuales. Ventajas y limitaciones Como se indica en el resumen, el aislamiento de células individuales para el análisis elimina los efectos observados con un promedio de análisis de poblaciones celulares heterogéneas. Estos efectos promedio de tergiversar la abundancia de ARNm en una sola célula por la sobre-representación de abundantes transcripciones y media de la prevención y la detección de muchos de baja abundancia transcripciones. La citometría de flujo se puede utilizar para clasificar las células individuales, pero este método requiere el conocimiento de marcadores de células específicas y equipos costosos. 18 microdisección de captura por láser o bien con UV o IR sistemas láser captura microdissection permiten célula e incluso capturar subcelular, pero requiere que las células de su interés se encuentra en la superficie de secciones muy finas. 19 Al igual que la citometría de flujo, microdisección láser de captura también se requiere un equipo caro. Una de las principales ventajas de la técnica de electrodos colección basada descrito anteriormente es que los valiosos datos electrofisiológicos se puede obtener de la célula de interés antes de la cosecha, lo que permite el análisis funcional y transcriptoma para llevar a cabo en la misma celda. 20 Un aspecto negativo de nuestra técnica es que requiere experiencia en el uso micromanipulador. Los investigadores familiarizados con micromanipulador se encuentra esta técnica muy intuitiva, sin embargo, las personas con ninguna experiencia tendrá que sentirse cómodo con los movimientos finos necesarios. Inherentes a cualquier técnica de amplificación es la amplificación preferencial de las transcripciones de algunas basadas en el tamaño y la composición de nucleótidos. 4,6,7 reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada, como la reacción de transcripción inversa en cadena de polimerasa (RT-PCR) y la rápida amplificación de cDNA extremos (RACE) resultado en la amplificación exponencial de las transcripciones, mientras que el ARNA los resultados del procedimiento de amplificación de amplificación lineal. Así, una de las principales ventajas del procedimiento de ARNA reside en su capacidad para conservar mejor la abundancia relativa de las transcripciones de ARNm por sólo linealmente amplificando los errores o sesgos que se producen en el proceso de amplificación en lugar de amplificar de manera exponencial, dijo errores y sesgos. El procedimiento ARNA junto con el análisis de microarrays permite la comparación de las abundancias de mRNA entre las células individuales de morfología similar o diferente, tratados o sin tratar. Además, el material amplificado puede ser presentado para la secuenciación de próxima generación. 5,8 Sin embargo, se debe tener cuidado en este tipo de análisis, ya que, en contraste con el uso de cebadores aleatorios para el procedimiento, el procedimiento de oligo-dT cebado descrito anteriormente amplificación de los sesgos de la 3 &#39;de los ARNm y por lo general resulta en un acortamiento leve de material posterior amplifica con cada ronda. Se debe tener cuidado en el análisis de los resultados de microarrays con los métodos estándar como algunas llamadas ausente falsos pueden surgir a partir de material acorta ligeramente amplificado. Además, los resultados, mientras que la secuenciación hecho, proporcionará la completa secuencia 5 &#39;de la mayoría de los ARNm original, las secuencias 5&#39; de algunos ARNm podría pasarse por alto. Por estas razones, el número de rondas de amplificación debe ser limitado.

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Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>Cubrebocillos Spiegelglas</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo Nunc de 35x10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Agua para cultivo celular</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>Para la preparación de soluciones utilizadas en el cultivo celular y el lavado de cubreobjetos</td></tr><tr><td>Polid-L-lisina PM70-150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, ultrapura</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>MEM con Earle&amp;rsquo;sales s y glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>Para la siembra de células</td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Citosina beta-D-arabinofuranósido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>MEM con Earle&amp;rsquo;sales s y L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>Para el cultivo de células</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>suplemento libre de suero B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidrio de borosilicato (1,5 mm de diámetro externo, 100 mm de longitud)</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td>Cualquier pipeta de vidrio borosilicatado funcionará siempre que se logre el tamaño adecuado de la luz. </td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>Cualquier solución funcionará siempre que los componentes no puedan&amp;rsquo;no interfiera con ningún procesamiento futuro (es decir, sin Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; o Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>jeringa de 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Aguja</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>La calibración depende del diámetro de las pipetas</td></tr><tr><td>mezcla de dNTP</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>dt-T7 oligo</td><td>Personalizado</td><td>Midland Certificado</td><td></td></tr><tr><td>Tampón para la segunda cadena (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>Suministrado con tampón de segunda cadena</td></tr><tr><td>Ligasa de ADN de E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerasa I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>Rnasa H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Primers aleatorios</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Transcriptasa Inversa</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>en el kit (18080-044) se incluye tampón de primera cadena (Y02321) y DTT</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>polimerasa del ADN del fago T4</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Amplificación de ARN Illumina TotalPrep</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeteador tipo Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Sutter tiene muchos otros modelos, muchos de los cuales se discuten en el libro de recetas</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Muchos otros micromanipuladores funcionarán, como los modelos más recientes de Eppendorf</td></tr><tr><td>Soporte para pipetas</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>Variará según el micromanipulador y el diámetro externo de la pipeta.</td></tr><tr><td>Kit Bioanalyzer RNA 6000 Nano</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis del transcriptoma de células individuales

Transcriptome Analysis of Single Cells

Muchas técnicas de análisis de expresión génica se basan en elementos aislados de poblaciones heterogéneas de células de tejido homogeneizado o células en cultivo. 1,2,3 En el caso del cerebro, en regiones como el hipocampo contienen una compleja disposición de los diferentes tipos de células, cada una con distintos perfiles de ARNm. La habilidad de cosechar las células individuales permite una investigación más profunda en las diferencias moleculares entre y dentro de las poblaciones de células. Se describe un método sencillo y rápido para la obtención de células para su posterior procesamiento. Pipetas de uso frecuente en electrofisiología se utilizan para aislar (con aspiración) una célula de interés y conveniente depositarlo en un tubo Eppendorf para su posterior procesamiento con cualquier número de técnicas de biología molecular. El protocolo puede ser modificada para la cosecha de las dendritas de cultivo de células o celdas individuales de rebanadas aguda. También describe el método de amplificación ARNA como una de las principales aplicaciones aguas abajo de los aislamientos de células individuales. Este método fue desarrollado previamente por nuestro laboratorio como una alternativa a otras técnicas de análisis de expresión génica como la transcripción inversa o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 4,5,6,7,8 Esta técnica permite la amplificación lineal de la poliadenilado ARN a partir de femtogramos sólo de materiales y que resulta en cantidades de microgramos de ARN antisentido. El material linealmente amplificado proporciona una estimación más precisa de la amplificación por PCR exponencial de la abundancia relativa de los componentes del transcriptoma de la celda de aislamiento. El procedimiento básico consiste en dos rondas de amplificación. En pocas palabras, un sitio de la RNA polimerasa T7 promotor se incorpora a doble varados cDNA creado a partir de las transcripciones de ARNm. Una noche a la mañana en la transcripción in vitro (FIV) la reacción se realiza a continuación en el que la RNA polimerasa T7 produce muchas transcripciones antisentido del cDNA de doble cadena. La segunda ronda se repite este proceso, pero con algunas diferencias técnicas, ya que el material de partida es el ARN antisentido. Es un estándar para repetir la segunda vuelta, resultando en tres rondas de amplificación. A menudo, la tercera ronda en la reacción de transcripción in vitro se realiza con los trifosfatos nucleósidos con biotina para que el ARN antisentido producido puede ser híbridas, y detectado en un microarray de 7,8.

En este artículo se describe un método simple para la recolección de las células individuales de rata cultivos primarios de neuronas y posterior análisis de transcriptoma utilizando la amplificación ARNA. Este enfoque es generalizable a cualquier tipo de célula.

El análisis del transcriptoma de células individuales

Muchas técnicas de análisis de la expresión génica se basan en material aislado de poblaciones heterogéneas de células procedentes de homogenados de tejido o células en...

El objetivo general de este procedimiento es preparar muestras a partir de células individuales para el análisis del transcriptoma. Esto se logra primero localizando una célula adecuada para su aislamiento. Luego, la micropipeta se posiciona junto a la célula que será aislada.A continuación, se aplica succión a la jeringa hasta que la célula es introducida en la punta de la micropipeta. El paso final del procedimiento consiste en romper la punta de la micropipeta dentro del tubo de recolección y expulsar el contenido restante de la micropipeta dentro del tubo. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren diferencias en las poblaciones de mRNA entre células mediante análisis de microarreglos del material amplificado utilizando el método de amplificación de arna, también descrito en el protocolo, o para otras aplicaciones como PCR o secuenciación de nueva generación.Aunque este método puede proporcionar información y revelar las diferencias entre células individuales, también puede aplicarse a compartimentos subcelulares, como dendritas o clases de dendritas, y aportar información importante sobre la función dendrítica. El procedimiento será demostrado por Jennifer Singh, una posdoctoranda en mi laboratorio. Antes del inicio de este protocolo, neuronas primarias procedentes del día embrionario 18 de hipocampo de rata fueron sembradas sobre cubreobjetos de 12 milímetros en una placa de 35 milímetros y mantenidas según se describe en el protocolo escrito. Para preparar las pipetas para la recolección, utilice un micropipeteador para tirar de pipetas de vidrio autoclavadas hasta obtener un diámetro adecuado para la electrofisiología.Usando el programa preestablecido del fabricante, el tamaño del orificio no es crítico, ya que la punta se romperá antes de la recolección celular. Almacene cuidadosamente las pipetas en un ambiente libre de polvo, como un frasco para almacenamiento de micropipetas, donde las puntas permanecerán intactas hasta que estén listas para cosechar las células. Prepare el número deseado de tubos einor de 1,7 mililitros añadiendo dos microlitros de PBS para el almacenamiento del material cosechado.Retire un plato de 35 milímetros con cubreobjetos del incubador en una cabina de cultivo celular. Transfiera rápidamente un cubreobjeto de este plato a la tapa de un nuevo plato de 35 milímetros que contenga HBSS. Es fundamental devolver los cubreobjetos que no se estén manipulando al incubador, ya que las células se deterioran rápidamente.Si se deja fuera durante períodos prolongados de tiempo. Se requiere un microscopio invertido con un objetivo de 40 x equipado con un micromanipulador para la recolección de células. Utilice un soporte para pipetas con un tubo flexible que se extienda desde el soporte y fije el tubo a una superficie estable para evitar movimientos no deseados de la pipeta durante la recolección.Al final del tubo, inserte una aguja de modo que se pueda sujetar y cambiar entre usuarios una jeringa de un mililitro con conexión de bloqueo de tipo lure lock. Prepare la micropipeta rompiendo la punta de forma controlada, sosteniendo una toalla de papel Kim tensa entre los dedos de una mano y deslizando suavemente la punta de la pipeta sobre el papel de una a dos veces. La abertura debe tener aproximadamente entre el 75 y el 100% del tamaño de la célula objetivo.Sujete la micropipeta en el soporte de micropipeta y fije el soporte de micropipeta al inserto en los micromanipuladores. Finalmente, coloque el objetivo de 40 x. Coloque el platillo sobre la platina del microscopio y localice una región de células adecuada para la recolección.En el caso de cultivos neuronales primarios, la célula debe estar relativamente aislada de sus vecinas. Para evitar la recolección de células circundantes o sus prolongaciones, coloque la célula que se va a recolectar en el centro del campo de visión. Utilice el micromanipulador para avanzar la micropipeta hacia la solución en la placa hasta introducirla en el trayecto del haz de luz.Introduzca la punta de la pipeta en la solución. Al mirar a través del ocular, la pipeta debe aparecer como una sombra en el campo de visión. A partir de este punto, aplique presión positiva soplando suavemente a través de la jeringa bien por encima del plano de las células.Ajuste la posición de la punta de la pipeta hasta que esté dentro del campo de visión y enfoque la punta de la pipeta utilizando los mandos de enfoque grueso. En este momento, evalúe si el tamaño del orificio de la pipeta es demasiado grande o demasiado pequeño. Si el tamaño del orificio es incorrecto, reemplace la micropipeta por otra hasta encontrar el tamaño de orificio adecuado para prevenir la rotura de la pipeta en la región de recolección.Utilice el enfoque grueso para avanzar el plano focal antes de acercar la punta de la pipeta hacia las células usando los micromanipuladores. A medida que las células estén más cerca, use el enfoque fino hasta que tanto las células como la punta de la pipeta estén enfocadas. Detenga la aplicación de presión positiva antes de alcanzar las células objetivo para evitar expulsarlas del cubreobjetos.Coloque la punta de la pipeta con los micromanipuladores de modo que toque el soma celular que se va a recolectar. Utilizando la jeringa, aplique succión suave mediante la boca hasta que la célula entre en la punta de la pipeta. Si la célula no entra en la pipeta, mueva suavemente la punta acercándola a la célula y hacia abajo hasta que se levante del cubreobjetos.Utilice el micromanipulador para mover inmediatamente la pipeta hacia arriba y fuera de la solución. Retire la pipeta del soporte. Sostenga el tubo einor de 1,7 mililitros preparado en una mano y rompa suavemente la punta de la pipeta contra la pared del tubo, cerca de la parte inferior.Apuntando al marcador de 0,1 mililitro con la punta rota centrada dentro del tubo, inserte una aguja conectada a una jeringa de un mililitro en la abertura superior de la pipeta. Presione rápidamente el émbolo, forzando a que la solución en la pipeta se pulverice dentro del tubo. Tenga cuidado de no tocar la punta con ningún líquido en las paredes del tubo.Dado que la acción capilar hará que el líquido regrese al interior de la pipeta, la célula debe permanecer en la punta misma de la pipeta, y esto debería ser suficiente para expulsar adecuadamente la célula. Centrifugar rápidamente el contenido del tubo utilizando una microcentrífuga de escritorio y congelar en hielo seco o colocar en hielo para su posterior procesamiento o para otras aplicaciones, como la PCR o la secuenciación de próxima generación. Aquí se muestra un ejemplo de una cosecha exitosa de una neurona aislada.Para comenzar, se seleccionó una región de células con densidad relativamente baja. A continuación, se avanzó la punta de la pipeta hacia la célula deseada. Aquí se muestra el campo de visión después de que la célula había sido recolectada.Téngase en cuenta que los procesos circundantes permanecen en la laminilla. Por el contrario, esta figura muestra dos imágenes de puntas de pipeta que tienen un tamaño inadecuado para una recolección eficaz. Esta punta provocará una recolección incompleta, mientras que la punta mostrada aquí dará como resultado la recolección del entorno circundante.Tras la recolección y un análisis de amplificación de ARN, se recomienda utilizar un bioanalizador para examinar la distribución y cantidad de ARN amplificado. Una amplificación exitosa a partir de material de una sola célula producirá cantidades totales en el rango de microgramos bajos y presentará una distribución suave y amplia. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en minutos si se realiza correctamente; durante este procedimiento, es importante utilizar técnicas libres de ARN.

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