El análisis del transcriptoma de células individuales

El objetivo general de este procedimiento es preparar muestras a partir de células individuales para el análisis del transcriptoma. Esto se logra primero localizando una célula adecuada para su aislamiento. Luego, la micropipeta se posiciona junto a la célula que será aislada.

A continuación, se aplica succión a la jeringa hasta que la célula es introducida en la punta de la micropipeta. El paso final del procedimiento consiste en romper la punta de la micropipeta dentro del tubo de recolección y expulsar el contenido restante de la micropipeta dentro del tubo. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren diferencias en las poblaciones de mRNA entre células mediante análisis de microarreglos del material amplificado utilizando el método de amplificación de arna, también descrito en el protocolo, o para otras aplicaciones como PCR o secuenciación de nueva generación.

Aunque este método puede proporcionar información y revelar las diferencias entre células individuales, también puede aplicarse a compartimentos subcelulares, como dendritas o clases de dendritas, y aportar información importante sobre la función dendrítica. El procedimiento será demostrado por Jennifer Singh, una posdoctoranda en mi laboratorio. Antes del inicio de este protocolo, neuronas primarias procedentes del día embrionario 18 de hipocampo de rata fueron sembradas sobre cubreobjetos de 12 milímetros en una placa de 35 milímetros y mantenidas según se describe en el protocolo escrito. Para preparar las pipetas para la recolección, utilice un micropipeteador para tirar de pipetas de vidrio autoclavadas hasta un diámetro adecuado para la electrofisiología.

Usando el programa preestablecido del fabricante, el tamaño del orificio no es crítico, ya que la punta se romperá antes de la recolección de células. Almacene cuidadosamente las pipetas en un ambiente libre de polvo, como un frasco para almacenamiento de micropipetas, donde las puntas permanecerán intactas hasta que estén listas para cosechar las células. Prepare el número deseado de tubos eppendorf de 1,7 mililitros añadiendo dos microlitros de PBS para el almacenamiento del material cosechado.

Retire un plato de 35 milímetros con cubreobjetos del incubador en una cabina de cultivo celular. Transfiera rápidamente un cubreobjeto de este plato a la tapa de un nuevo plato de 35 milímetros que contenga HBSS. Es fundamental devolver al incubador los cubreobjetos que no se estén manipulando, ya que las células se deterioran rápidamente.

Si se deja fuera durante períodos prolongados de tiempo. Se requiere un microscopio invertido con un objetivo de 40 x equipado con un micromanipulador para la recolección de células. Utilice un porta-pipetas con tubo flexible que conduzca desde el porta-pipetas y sujete el tubo a una superficie estable para evitar movimientos no deseados de la pipeta durante la recolección.

Al final del tubo, inserte una aguja para que se pueda sujetar y cambiar entre usuarios una jeringa de un mililitro con conexión de bloqueo de acoplamiento. Prepare la micropipeta rompiendo la punta de forma controlada, sosteniendo una toallita Kim tensa entre los dedos de una mano y deslizando suavemente la punta de la pipeta sobre el papel de una a dos veces. La abertura debe tener aproximadamente entre el 75 y el 100 % del tamaño de la célula objetivo.

Sujete la micropipeta en el soporte de micropipeta y fije el soporte de micropipeta al inserto de los micromanipuladores. Finalmente, coloque el objetivo de 40 x. Coloque la placa en la platina del microscopio y localice una región de células adecuada para la recolección.

En el caso de cultivos neuronales primarios, la célula debe estar relativamente aislada de sus vecinas. Para evitar la recolección de células circundantes o sus prolongaciones, coloque la célula que se va a recolectar en el centro del campo de visión. Utilice el micromanipulador para avanzar la micropipeta hacia la solución en la placa hasta introducirla en el trayecto del haz de luz.

Baje la punta de la pipeta hasta introducirla en la solución. Al mirar a través del ocular, la pipeta debe aparecer como una sombra en el campo de visión. A partir de este momento, aplique presión positiva soplando suavemente a través de la jeringa bien por encima del plano de las células.

Ajuste la posición de la punta de la pipeta hasta que esté dentro del campo de visión y enfoque la punta de la pipeta utilizando los mandos de enfoque grueso. En este momento, evalúe si el tamaño del orificio de la pipeta es demasiado grande o demasiado pequeño. Si el tamaño del orificio es incorrecto, reemplace la micropipeta por otra hasta encontrar el tamaño de orificio adecuado para prevenir la rotura de la pipeta en la región de recolección.

Utilice el enfoque grueso para avanzar el plano focal antes de acercar la punta de la pipeta hacia las células utilizando los micromanipuladores. A medida que las células estén más cerca, use el enfoque fino hasta que tanto las células como la punta de la pipeta estén enfocadas. Detenga la aplicación de presión positiva antes de alcanzar las células objetivo para evitar expulsarlas del cubreobjetos.

Coloque la punta de la pipeta con los micromanipuladores de manera que toque el soma celular que se va a recolectar. Utilizando la jeringa, aplique succión suave mediante la boca hasta que la célula entre en la punta de la pipeta. Si la célula no entra en la pipeta, mueva suavemente la punta acercándola a la célula y hacia abajo hasta que se levante del cubreobjetos.

Utilice el micromanipulador para mover inmediatamente la pipeta hacia arriba y fuera de la solución. Retire la pipeta del soporte. Sostenga el tubo einor de 1,7 mililitros preparado en una mano y rompa suavemente la punta de la pipeta contra la pared del tubo, cerca de la parte inferior.

Apuntando al marcador de 0,1 mililitro con la punta rota centrada dentro del tubo, inserte una aguja conectada a una jeringa de un mililitro en la abertura superior de la pipeta. Presione rápidamente el émbolo, forzando a que la solución en la pipeta se pulverice dentro del tubo. Tenga cuidado de no tocar la punta con ningún líquido en las paredes del tubo.

Dado que la acción capilar hará que el líquido regrese al interior de la pipeta, la célula debe permanecer en la punta misma de la pipeta, y esto debería ser suficiente para expulsar adecuadamente la célula. Centrifugar rápidamente el contenido del tubo utilizando una microcentrífuga de escritorio y congelar en hielo seco o colocar en hielo para su posterior procesamiento o para otras aplicaciones como PCR o secuenciación de nueva generación. Aquí se muestra un ejemplo de una cosecha exitosa de una neurona aislada.

Para comenzar, se seleccionó una región de células con densidad relativamente baja. A continuación, se avanzó la punta de la pipeta hacia la célula deseada. Aquí se muestra el campo de visión después de que la célula había sido recolectada.

Téngase en cuenta que los procesos circundantes permanecen en la laminilla. Por el contrario, esta figura muestra dos imágenes de puntas de pipeta que tienen un tamaño inadecuado para una recolección eficaz. Esta punta provocará una recolección incompleta, mientras que la punta mostrada aquí dará como resultado la recolección del entorno circundante.

Tras la recolección y un análisis de amplificación de ARN, se recomienda utilizar un bioanalizador para examinar la distribución y cantidad de ARN amplificado. Una amplificación exitosa a partir de material de una sola célula producirá cantidades totales en el rango de microgramos bajos y presentará una distribución suave y amplia. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en minutos si se realiza adecuadamente; durante este procedimiento, es importante emplear técnicas libres de ARN.