Name: El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 13 s
Description: Aprende a aislar testículos de Drosophila melanogaster machos de 0 a 3 días usando agujas de disección y PBS frío bajo microscopio. Este protocolo rápido permite obtener tejido viable para análisis de ARN y proteínas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen a Vasia Vagin para la introducción de esta técnica en nuestro laboratorio.

<ol><li> Hacer un portaobjetos de vidrio con un fondo negro: Corte papel de 20 # blanco del mismo tamaño que el portaobjetos del microscopio. Color de un lado del papel negro de diapositivas de tamaño usando un marcador permanente (por ejemplo, Sharpie). Aplique pegamento blanco (Elmer) para el lado negro y adherir el papel a la diapositiva. La diapositiva puede ser reutilizado. El uso de ¾ "cinta de etiquetas (Fisherbrand), asegure el portaobjetos de microscopio, laterales de vidrio arriba, a la plataforma de CO 2 a volar fijarlo en su lugar. </li><li> Recoger 0-3 días de edad moscas macho. </li><li> Preparar un cubo de hielo, tampón fosfato salino (PBS), agujas de disección. </li><li> Anestesiar a las moscas de 50-100 con una corriente de CO 2 y transferirlos de la botella o frasco a la plataforma de vuelo cerca del portaobjetos de microscopio. </li><li> Pipeta ~ 50 l helado de PBS en una gota en el centro de la diapositiva del microscopio. </li><li> Suavemente recoger una mosca macho con la disección de la aguja por inmersión en la aguja de disección en PBS, suave toque la cara ventral (es decir, cerca de las alas) de la mosca con la aguja es el lugar dentro de la gota de PBS. </li><li> Coloque una aguja en el centro de la marcha, entre el tórax y el abdomen, empujando hacia abajo con firmeza. Coloque la otra aguja entre la sexta (A6) y séptima (A7) segmentos abdominales (las rayas de la segunda y tercera de la parte inferior), tirar del abdomen fuera del tórax. </li><li> Se burlan de los testículos, aparte de otros órganos, especialmente el intestino. Especialmente en los mutantes de blanco, los testículos y el intestino son similares. Principales diferencias son que los testículos siempre vienen en pares, cada testículo tiene forma de espiral y es más blanco que el color de intestino. </li><li> Tienda de los testículos en el helado de PBS en un tubo de microcentrífuga de polipropileno. </li></ol> Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2641/2641fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Vista dorsal del sistema reproductor masculino, de flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase atribución:... "Después de la Figura 38 A en la página 508 de Miller (1950) A. Miller La anatomía interna y la histología de la imago de Drosophila melanogaster En Demerec M., editor, Biología de la Drosophila, el capítulo 6, páginas 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, edición facsímil, 1994. Copyright 1994 por Cold Spring Harbor Laboratory Press. Usado con permiso de Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Press. Ver <a href="http://www.cshlpress.com">http://www.cshlpress.com</a> ".

<ol><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+Techniques+for+Studying+the+Drosophila+Male+Germline+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell.</a> Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
</ol>

Ofrecemos un protocolo para aislar a los testículos de hombres adultos Drosophila melanogaster. Debido a que la técnica requiere la coordinación de una de las dos manos, la habilidad sólo se logra con la práctica.

<table><tbody><tr><td>Aguja de disección</td><td>Herramienta</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17346</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos microscópicos, lisos</td><td>Herramienta</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553</td><td></td></tr><tr><td>Luz para microscopio</td><td>Herramienta</td><td>Schott AG</td><td>KO-1500</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla de CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Herramienta</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Sistema completo Benchtop Flowbuddy</td><td>Herramienta</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td></tr><tr><td>Humedecedor con burbujas</td><td>Herramienta</td><td>Salter Labs</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>Aguja para llenado con bola</td><td>Herramienta</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Cinta etiquetadora &amp;#190;&amp;#8221;</td><td>Suministro</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento de drosophila melanogaster testículos

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Los testículos de Drosophila melanogaster proporcionar un importante modelo para el estudio de mantenimiento de las células madre y la diferenciación, la meiosis, y las interacciones soma-la línea germinal. Los testículos están generalmente aisladas de los machos adultos 0-3 días después de la eclosión de la envoltura pupal. Los testículos de moscas de tipo silvestre se distinguen fácilmente de otros tejidos, ya que son de color amarillo, pero los testículos de los blancos moscas mutantes, un fondo genético común para los experimentos de laboratorio son similares en forma y color a la tripa volar. Realizar la disección en un portaobjetos de vidrio con un fondo negro hace que la identificación de los testículos mucho más fácil. Los testículos son removidos de las moscas usando agujas de disección. En comparación con los protocolos que utilizan pinzas de disección de los testículos, nuestro método es mucho más rápido, permitiendo que una persona bien practicado para diseccionar testículos 200 a 300 de tipo salvaje moscas por hora, produciendo 400-600 testículos. Los testículos de la mosca blanca o de mutantes que reducir el tamaño de los testículos son más difíciles de diseccionar y generalmente producen los testículos 200-400 por hora.

Drosophila melanogaster testículos puede ser rápida y eficazmente aisladas de los machos adultos el uso de agujas de disección. Con la práctica, uno puede fácilmente aislado en uno o dos días una cantidad de testículos suficiente para el análisis de ADN o ARN mediante la secuenciación de alto rendimiento o los métodos moleculares más tradicionales de biología o de la proteína para los ensayos de anticuerpos o enzimas base.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

Los testículos de Drosophila melanogaster constituyen un modelo importante para el estudio del mantenimiento y la diferenciación de las células madre, la meiosis y la interacción soma-línea germinal...

El objetivo general de este procedimiento es aislar los testículos de drosophila melanogaster machos de cero a tres días de edad. Para lograrlo, se anestesian los machos y se les extraen los testículos en una gota de PBS frío sobre hielo, bajo un microscopio, utilizando dos agujas de disección; con ellas se separa el abdomen del tórax del insecto.Finalmente, separen los testículos del resto del tejido y reúnanlos para su uso en diversas técnicas analíticas, como inmunofluorescencia, tinción o aislamiento de ARN total y proteínas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la identificación de los testículos diseccionados puede ser difícil de aprender porque son difíciles de distinguir del intestino. La persona que demostrará el procedimiento será Shemei Ma, una técnica de mi laboratorio.Primero, reúna un recipiente con hielo, agujas de disección y aproximadamente 100 mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Coloque el PBS en el recipiente con hielo para enfriarlo. Prepare un portaobjetos con fondo negro cortando papel blanco de 20 libras para que se ajuste al portaobjetos.Luego, colorea un lado de negro. Utilizando un marcador permanente, pega el papel en su lugar sobre el portaobjetos y sujeta el portaobjetos al cojín de CO2. Bajo un microscopio estereoscópico, anestesia una botella de moscas de cero a tres días de edad con una corriente de CO2 y viértelas sobre el cojín.Cerca del portaobjetos fijado, identifique las moscas macho por sus ganchos de apareamiento característicamente de color oscuro y separe entre 50 y 100. Pipetee aproximadamente 50 microlitros de PBS frío con hielo sobre el centro del portaobjetos, formando una gota. Tome una mosca macho introduciendo una aguja de disección en la gota de PBS y tocando suavemente el lado ventral de la mosca, lo que hará que se adhiera a la aguja.Coloque la mosca en la gota de PBS y presione firmemente una aguja entre el tórax y el abdomen de la mosca. Presione la otra aguja entre los segmentos abdominales sexto y séptimo, y luego separe el abdomen del tórax. Separe los testículos del resto de los órganos, especialmente del intestino, que puede parecerse a los testículos, lo cual ayuda a diferenciarlos del intestino.Recuerde que los testículos siempre vienen en pares, tienen una forma espiral característica y son más blancos que el tejido intestinal. Recolecte los testículos en un tubo de microcentrífuga que contenga PBS frío con hielo y guárdelos sobre hielo, donde pueden almacenarse durante varias horas. Una vez dominado, un solo mosquito puede diseccionarse en menos de un minuto siguiendo este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación profunda de ARN pequeños de silenciamiento o microARNs, para responder preguntas adicionales, como por ejemplo cómo cambia el repertorio de ARN en una mosca mutante particular.

isolation-of-drosophila-melanogaster-testes

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video describe la disección de las glándulas accesorias de las moscas macho y muestra un ejemplo en el que la glándula aislada se disociará en una suspensión de una sola célula.

Drosophila Disección de glándulas accesorias masculinas: un método para aislar células secundarias

Este video describe la anatomía general del ovario de Drosophila y presenta un método de disección de ovarios para obtener imágenes vivas o fijas.

Drosophila melanogaster Disección de ovarios: una técnica para la preparación de tejidos ex vivo

Este video describe la glándula anular de Drosophila, una compleja estructura endocrina importante para la biosíntesis y secreción de ecdisteroides y otras hormonas. El protocolo presentado demuestra su disección, fijación e inmunotinción.

Disección de glándulas anulares larvariales: aislamiento de órganos endocrinos en desarrollo de Drosophila

-Fase específica aislamiento de mediados y finales de los folículos de Drosophila es útil para una variedad de propósitos. Estos folículos se desarrollan en la cultura, lo que permite la manipulación genética y / o farmacológicos a acoplar con los ensayos in vitro de desarrollo en y de imagen en vivo. Además, los folículos se pueden utilizar para los estudios moleculares, tales como el aislamiento de ARNm y proteína.

La utilidad de la etapa específica-Mediados o finales<em&gt; Drosophila</em&gt; Aislamiento folículo

Los métodos para aislar y preparar muestras de Drosophila testículos (en directo y fijo) para obtener imágenes de contraste de fase y microscopía de fluorescencia se describen en este documento.

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testículos

Este protocolo describe la disección y el cultivo de testículos intactos y quistes de la línea germinal de las pupas de Drosophila melanogaster. Este método permite la observación microscópica de la espermatogénesis ex vivo. Además, describimos un ensayo farmacológico del efecto de los inhibidores en etapas específicas del desarrollo de las células germinales en los testículos de pupa.

Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testis y individuales masculinos quistes línea germinal: Disección, Imaging y Tratamiento farmacológico

Aquí, presentamos un protocolo para disociar y ordenar una población celular específica de las glándulas accesorias masculinas Drosophila (células secundarias) para la secuenciación de ARN y RT-qPCR. El aislamiento celular se logra a través de la purificación FACS de células secundarias que expresan GFP después de un proceso de disociación de múltiples pasos que requiere disección, digestión de proteasas y dispersión mecánica.

Un protocolo basado en FACS para aislar el ARN de las células secundarias de Drosophila Male Accessory Glands

La integridad de la barrera hematoencefálica es fundamental para la función del sistema nervioso. En Drosophila melanogaster, la barrera hematoencefálica se forma por células gliales durante la embriogénesis tardía. Este protocolo describe los métodos para el ensayo para la formación y el mantenimiento de barreras hematoencefálicas en embriones D. melanogaster y larvas de tercera estrella.

Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster

El objetivo de este protocolo es analizar la división celular en tejido intacto mediante microscopía celular viva y fija utilizando esperamorcitos meióticos Drosophila. El protocolo demuestra cómo aislar testículos enteros e intactos de larvas de Drosophila y pusias tempranas, y cómo procesarlos y montarlos para microscopía.

Preparación de pruebas de larvas y pupales de Drosophila para el análisis de la división celular en vivo, tejido intacto

Presentamos aquí un protocolo mejorado para la preparación de montaje completo y la inmunotensión de los testículos de Drosophila, adecuado para la microscopía confocal y también permitiendo el etiquetado reproducible y confiable. Ilustramos este protocolo por la representación y la cuantificación 3D de los experimentos del colocalization en los spermatocytes grandes S4-S5.

Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes

El protocolo describe el método de hibridación in situ de fluorescencia sensible a polimorfismos de un solo nucleótido (SNP-FISH) para distinguir las transcripciones de ARN ribosómico derivadas del locus de ADN ribosómico del cromosoma X o Y en Drosophila melanogaster.

Detección de FISH sensible al polimorfismo de un solo nucleótido de la transcripción de ARN ribosómico específico del locus en Drosophila melanogaster

Aprende a aislar testículos de Drosophila melanogaster machos de 0 a 3 días usando agujas de disección y PBS frío bajo microscopio. Este protocolo rápido permite obtener tejido viable para análisis de ARN y proteínas.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

Explorar más videos