Name: Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprende a establecer tumores de retinoblastoma ortotópicos en ratones inmunodeficientes mediante inyección intraocular de esferas tumorales cultivadas. Este modelo permite estudiar la biología tumoral y probar intervenciones terapéuticas.

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La financiación de este proyecto está a cargo de la Fundación Clayton para la Investigación y la Fundación Retina investigación.

1. Preparación de tumorspheres retinoblastoma <ol><li> Obtener una muestra del tumor retinoblastoma en un protocolo aprobado por el IRB. </li><li> Prepare frescos define los medios de comunicación de células madre (Neurobasal-A los medios de comunicación, 1X suplemento de B-27 menos de vitamina A, 1X no esenciales solución de aminoácidos, 1X L-glutamina, 20 ng / mL FEAG, 10 ng / mL bFGF). </li><li> Mecánicamente desglosar el tejido del tumor con un bisturí con una técnica transversal de un tejido estéril, la cultura tratados con 6-así placa. Inmediatamente añadir 100 ml de definir los medios de comunicación de las células madre en el tejido suave y difusión del tejido picado con el bisturí. Añadir 5 ml de definir los medios de comunicación de las células madre para el bienestar. </li><li> Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 en un incubador humidificado e inspeccionar todos los días. Algunos tumorspheres debe surgir a partir del tejido del tumor interrumpe casi de inmediato, con un número creciente en el transcurso de 2-4 días. </li><li> Semanales, tumorspheres centrifugar a 300xg durante 5 minutos, volver a suspender en recién preparada define los medios de comunicación de las células madre, y la pipeta hacia arriba y abajo 10 veces para interrumpir el más grande, las esferas central necrótica y permitir que nuevos ámbitos, sana a la forma. </li></ol> 2. Preparación de las células tumorales para la inyección <ol><li> Si se inyectan tumorspheres cultivadas, con cuidado las esferas de la pipeta en un tubo cónico de 15 ml. Pipeta suavemente hacia arriba y abajo con una pipeta serológica 10-15 veces para interrumpir las esferas. </li><li> Contar las células que se inyecta con una hemocitómetro, y alícuota al menos 50.000 células por inyección en un nuevo tubo. Prepárese para las inyecciones como sea posible en función del número de células disponibles. </li><li> Centrifugar a 300xg durante 5 minutos. Con cuidado, aspirar el sobrenadante y resuspender en 5 ml de PBS. Repetir la centrifugación y la aspiración, y resuspender en 10 l de PBS por inyección. </li></ol> 3. Preparación de los animales <ol><li> Utilizando una jeringa de insulina, administrar una inyección intraperitoneal de cóctel roedores anestesia (ketamina 37,6 mg / ml, la xilazina 1,92 mg / mL, acepromacina 0,38 mg / ml) a un l por gramo de peso corporal (GBW). Espere 5 minutos para que el animal se sedado. Comprobar el latido del corazón y el lugar del animal en un cojín de calefacción. Mantener los animales en un cojín de calefacción en todo momento hasta su recuperación. </li><li> Después de la sedación, administrar una gota de HCl proparacaína en el ojo derecho. Vuelva a colocar los animales en el teclado se calienta y esperar 1 minuto. </li><li> Administrar una gota de fenilefrina HCl en el ojo derecho. Vuelva a colocar el animal en el teclado se calienta y espere 5 minutos. Si la dilatación de la pupila no ha ocurrido, volver a administrar una gota y esperar otros 5 minutos. </li><li> Observar a los animales para detectar signos de movimiento o contracción muscular, que puede ocurrir en&gt; 30 minutos después de la sedación. Ante los primeros síntomas de movimiento, administrar 1 l / gbw de ketamina HCl (diluida a 10 mg / ml en PBS) y espere 5 minutos. </li></ol> 4. La inyección de células tumorales <ol><li> Coloque el animal anestesiado bajo el microscopio de su lado, con el ojo derecho hacia arriba y con la cabeza apoyada sobre una gasa y se centra en obtener un reflejo rojo en el ojo derecho del fondo de ojo (pupila debe ser dilatada en este momento) cuando se observa a través del microscopio . </li><li> Sostener el globo ocular derecho presionando suavemente al mismo tiempo con dos dedos sobre los párpados y mantener esta posición de manera constante durante el resto del procedimiento. </li><li> Utilizando una aguja estéril de calibre 30 aguja conectada a una jeringa Luer-lock, perforar el globo lateralmente a través de la conjuntiva y la esclera adyacente al limbo corneal en el área de la pars plana (Figura 1) y sólo a través de la coroides en la cavidad vítrea. Retire la aguja de la apertura. </li><li> Esterilizar la aguja Hamilton con un algodón con alcohol. Dibuja la suspensión de células en la jeringa Hamilton e inserte la aguja en el orificio hasta que la aguja se visualiza a través del microscopio detrás de la cámara en el vítreo, cerca de la retina. Con la ayuda de una segunda persona mientras se mantiene la aguja de manera constante en esta posición, presione el émbolo lenta. Retire la aguja. Si es necesario, use un hisopo de algodón para absorber cualquier líquido de la apertura. </li><li> Suavemente liberar la presión de los párpados para cerrar los párpados del ratón. </li><li> Administrar una gota de hipromelosa para cada ojo y devolver los animales al cojín calentado para la recuperación. </li></ol> 5. Seguimiento de los ratones inyectados y la cosecha de los tumores <ol><li> Todos los días, examinará los ojos inyectados de leucocoria (reflejo blanco papilar) y / o distensión periocular que por lo general se manifiesta 2-4 semanas después de la inyección. </li><li> Una vez que el crecimiento del tumor se detecta, la eutanasia de animales de acuerdo con las directrices institucionales. </li><li> Si el ojo y el tumor está cubierto por los párpados, el uso del bisturí para realizar dos incisiones ortogonal a la hendidura palpebral y levantar los colgajos de piel. </li><li> Bajo visualización con el microscopio estereoscópico, hacer una incisión circunferencial en el limbo, la eliminación de la córnea y el cristalino, y con mucho cuidado diseccionar la mayor parte de la masa del tumor de los tejidos con otros tweezers. Lugar del tumor en estéril RPMI-1640. </li><li> Utilizar pinzas para extraer lentamente el mundo abierto de la toma. Para asegurar un nervio óptico adjunto para la invasión del tumor se pueden visualizar, tire del mundo hasta que el nervio está expuesto y el uso de tijeras para cortar el nervio mayor tiempo posible. Lugar en formol al 10% para el procesamiento normal para el examen histológico. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Tumorspheres retinoblastoma comenzarán a aparecer a partir del tejido desglosados ​​casi de inmediato, ya que se liberan de la masa tumoral. Dentro de 2-4 días, más tumorspheres se empiezan a formar y aumentar de tamaño. Las esferas tienden a ser regulares y presentan una estrategia bien definida, la membrana que rodea el conjunto secundario (Figura 2). El animal se presenta típicamente con leucocoria en las 4 semanas después de la inyección (Figura 3b), seguido por la ampliación de la tierra y la distensión de los tejidos circundantes 5-8 semanas después de la inyección al crecer el tumor (Figura 3c). <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Transversal diagrama del ojo del ratón destacando características mencionadas en el protocolo. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cultivo de células humanas in vitro retinoblastoma imágenes en un 4x), y b) aumento del objetivo de 10x. Células de retinoblastoma tumor primario producir tumorspheres con una forma regular esferoide y una membrana externa crujiente. Las barras de escala representan a) 500 m, y b) micras 200. <img src="/files/ftp_upload/2644/2644fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Ojo de Rag2 -. / - Ratón que muestra una serie de características) normal, b) indicativo de una masa tumoral en la cavidad vítrea leucocoria, y c) una gran masa tumoral de llenar el mundo con distensión periocular asociada, hemorragia intraocular.

<ol><li>Chèvez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+and+Nonmetastatic+Models+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma.</a> Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).</li>
<li>Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+consequences+of+intraocular+administration+of+modified+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).</li>
<li>Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Transfer+into+Retinal+Cells+Using+Adenoviral+Vectors%3A+Dependence+on+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Colegio Baylor de Medicina IACUC Comité.

La técnica descrita en este documento facilita la propagación de los tumores de retinoblastoma intraocular en su entorno, intravítrea. La técnica de inyección intraocular se ha utilizado en el pasado para crear tumores de líneas celulares derivadas retinoblastoma-1, así como para entregar los vectores virales para la terapia génica 2,3 intraocular. Esta técnica ha sido utilizada con éxito para producir tumores humanos retinoblastoma mediante la inyección de las células del tumor primario y la inyección de tumorspheres así como la propagación de serie de los tumores de xenoinjerto. Evidencia visible de la formación de tumores (por lo general leucocoria) se nota por primera vez en 4 semanas, después de que la hemorragia intraocular y la distensión del globo y / o tejidos que rodean la órbita se desarrollan dentro de 5-8 semanas. Una minoría de los ratones inyectados dañar el ojo inyectado, provocando el cierre permanente de los párpados. En estos casos, la distensión es la única señal de la formación de tumores. Establecimiento de tumores murinos xenoinjertos no ha tenido éxito con todos los tumores de retinoblastoma humanos, a pesar de la propagación de los tumores de xenoinjerto establecido es de gran éxito. Esta observación sugiere que ciertas características del tumor primario, como la agresividad y el nivel de diferenciación o de algún otro factor desconocido, pueden estar influyendo en la capacidad de estos tumores a persistir en el ambiente ocular murino. La cantidad de tejido que pueden ser adquiridos a partir de un tumor retinoblastoma humanos es bastante pequeña, y hay importantes limitaciones en la capacidad de las células de cultivo retinoblastoma humanos in vitro, tales como tiempo de vida limitado, la pérdida de la histología del tumor sólido y cambios en el fenotipo celular. Este protocolo proporciona una forma relativamente sencilla de propagar el tumor humano y establecer un modelo murino de la enfermedad humana. Esto permite que más in vitro y la experimentación in vivo de la biología de retinoblastoma y ya el mantenimiento de la parte exterior del tumor del paciente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Catálogo # </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Clorhidrato de fenilefrina al 2,5% </td><td> Bausch &amp; Lomb </td><td> 053-11 </td><td> Oftálmica solución </td></tr><tr><td> 30 ga la aguja </td><td> BD </td><td> 305128 </td><td> Bisel regular </td></tr><tr><td> 10 ml Luer-Lock Jeringa </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 3/10-cc jeringa de insulina </td><td> BD </td><td> 328431 </td><td></td></tr><tr><td> Torundas con alcohol </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Bueno Plate, el cultivo de tejidos tratados </td><td> BD </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Proparacaína HCl 0,5% </td><td> Mayordomo de la peste equina </td><td> 017239 </td><td> Oftálmica solución </td></tr><tr><td> La ketamina HCl 100mg/ml </td><td> Fort Dodge </td><td> 4402A </td><td></td></tr><tr><td> 10-l Hamilton jeringa </td><td> Hamilton Company </td><td> 7648-01 </td><td></td></tr><tr><td> 32 ga Hamilton Aguja </td><td> Hamilton Company </td><td> 7803-04 </td><td> Costumbre longitud - 0.5 &quot; </td></tr><tr><td> Neurobasal-A los medios de comunicación </td><td> Invitrogen </td><td> 10888-022 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Suplemento Menos vitamina A, 50 veces </td><td> Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10 a 040 CV </td><td></td></tr><tr><td> No esenciales solución de aminoácidos, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25 a 025-CI </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina, 100X </td><td> Mediatech </td><td> 25 a 005-CI </td><td></td></tr><tr><td> Desechables bisturí # 11 </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td><td></td></tr><tr><td> Roedores Combo anestesia </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> En casa de farmacia formulación (ketamina 37,6 mg / ml, la xilazina 1,92 mg / mL, acepromacina 0,38 mg / mL) </td></tr><tr><td> Recombinante factor de crecimiento epidérmico (EGF) </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02633 </td><td> Reconstituir a 10 mg / ml de solución de archivo </td></tr><tr><td> Recombinante humano del factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02634 </td><td> Reconstituir a 10 mg / ml de solución de archivo </td></tr><tr><td> OMS-75 Microscopio operaciones </td><td> Topcon Medical Systems </td><td> OMS-75 </td><td> Este modelo ha sido descontinuado </td></tr><tr><td> Formalina al 10% </td><td> VWR </td><td> 95042-908 </td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

El cultivo de las células del tumor retinoblastoma en los medios de comunicación definidos de células madre da lugar a tumorspheres primaria que pueden ser cultivadas y se mantiene durante un tiempo limitado. Estos tumorspheres cultivadas pueden presentar fenotipos celulares muy diferentes en comparación con los tumores originales. Demostración de que las células cultivadas tienen la capacidad de formar nuevos tumores es importante asegurarse de que el modelo de las células cultivadas en la biología del tumor original. Aquí se presenta un protocolo para la propagación de los tumores humanos in vivo con retinoblastoma Rag2 - / - ratones deficientes inmunes. Cultivadas tumorspheres retinoblastoma humanos de paso bajo o de células obtenidas de recién cosechado tumores retinoblastoma humano se inyecta directamente en la cavidad vítrea de los ojos de formar tumores murinos en 2-4 semanas. Estos tumores pueden ser cosechadas y sea más pasajes en los ojos de murino in vivo o que han crecido como tumorspheres in vitro. Propagación se ha realizado con éxito durante al menos tres pasajes, estableciendo así una fuente continua de tejidos humanos para la experimentación retinoblastoma más. Wesley S. Bond y Wadhwa Lalita son co-autores de primera.

Se describe un método para propagar los tumores humanos en ratones retinoblastoma. Las células tumorales se inyectan directamente en los ojos de ratones inmunes deficientes. Los tumores secundarios se han establecido con éxito utilizando las células cosechadas directamente de tumores humanos y tumorspheres cultivadas.

Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

El cultivo de células tumorales de retinoblastoma en medios definidos para células madre da lugar a tumoresferas primarias que solo pueden crecer y mantenerse durante un tiempo limitado...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un tumor ortotópico de retinoblastoma en un ratón inmunodeficiente, proporcionando un modelo conveniente para experimentación adicional y permitiendo la propagación del tumor. Esto se logra primero mediante la obtención de células a partir de un tumor primario o xenoinjertado y el cultivo in vitro de esferas tumorales. El segundo paso del procedimiento consiste en inyectar las células tumorales cultivadas en la cavidad vítrea o en el espacio subretiniano del ojo de un ratón inmunodeficiente rag two null.El tercer paso del procedimiento consiste en monitorear a los ratones inyectados en busca de signos de formación tumoral, incluyendo leucocoria, agrandamiento del globo ocular y distensión periorbitaria. El paso final del procedimiento es extraer el tumor del xenoinjerto. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la formación de tumores ortotópicos en el ojo de ratón mediante examen histopatológico.La demostración visual de esta técnica es fundamental debido a la naturaleza delicada de la inyección intraocular. Las estructuras circundantes pueden dañarse fácilmente si no se identifican correctamente. Por lo general, las personas nuevas en este método tienen dificultades porque la colocación de la inyección en la cavidad vítrea requiere precisión para administrar las células tumorales en la ubicación correcta.Ahora, este método puede proporcionar información sobre la biología de los tumores de retinoblastoma. También puede aplicarse a otros sistemas, como la administración interocular de vectores para la transferencia de genes. Primero, prepare medios frescos definidos para células madre en una placa estéril de cultivo de tejidos de 10 centímetros de diámetro.Coloque el tejido tumoral de retinoblastoma y aspire el medio de transporte en exceso, dejando suficiente para evitar que se seque. Desagregue mecánicamente el tejido con un escalpelo utilizando una técnica de corte cruzado. Inmediatamente, agregue 100 microlitros de medio definido para células madre al tejido y extienda suavemente el tejido picado usando el escalpelo. A continuación, agregue 10 mililitros de medio definido para células madre a la placa. Incube la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono en un incubador humedecido e inspeccione diariamente cambios en la turbidez y el pH.Algunas esferas tumorales deben surgir del tejido tumoral disgregado casi inmediatamente, con un aumento en el número durante el transcurso de siete a 10 días, cuando se observe un crecimiento nuevo suficiente. A partir de entonces, semanalmente, centrifugue las esferas tumorales a 300 veces G durante cinco minutos. Resuspenda, suspenda en medio definido para células madre recién preparado y pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces para disgregar las esferas más grandes con necrosis central y permitir que se formen esferas nuevas y sanas.Para preparar esferas tumorales cultivadas para la inyección, transfiera suavemente las esferas a un tubo cónico de 15 mililitros. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces para romper las esferas. Cuente las células que se inyectarán utilizando un hemocitómetro con tripan azul para excluir las células no viables.Preparar tantas inyecciones como sean necesarias según el número de células disponibles y los requisitos experimentales. A continuación, centrifugar los tubos a 300 veces G durante cinco minutos. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender las células en cinco mililitros.PBS repita los pasos de centrifugación y aspiración una vez más. Por último, re suspenda las células en 10 microlitros de PBS estéril por inyección. Para preparar a los animales para el procedimiento, comience colocando un ratón anestesiado sobre una almohadilla calentada.Para mantener la temperatura corporal, administre una gota de clorhidrato de propano en el ojo derecho y espere un minuto. A continuación, administre una gota de clorhidrato de fenilefrina en el ojo derecho y espere cinco minutos. Si no se ha producido la dilatación de la pupila, administre otra gota y espere otros cinco minutos.Coloque el animal anestesiado de lado bajo el microscopio y apoye la cabeza sobre gasa. Oriente el lado derecho hacia arriba y centre el ojo para obtener un reflejo rojo del ojo derecho. Cuando se observe el fondo del ojo a través del microscopio, sostenga el globo ocular derecho empujando suavemente hacia abajo simultáneamente con dos dedos sobre los párpados.Mantenga esta posición fija durante el resto del procedimiento. Utilizando una aguja estéril de calibre 30 unida a una jeringa con bloqueo de cebo, atraviese el globo ocular lateralmente a través de la conjuntiva y la esclerótica adyacentes al limbo corneal en la zona del pars plana, y justo a través de la coroides hasta la cavidad vítrea.Retire la aguja de la abertura. Esterilice una aguja Hamilton con una torunda de alcohol. Aspire la suspensión celular hacia la jeringa Hamilton e inserte la aguja en la abertura hasta que la aguja sea visible a través del microscopio detrás del cristalino en el vítreo, cerca de la retina.Con la ayuda de una segunda persona, mantenga la aguja fija en esta posición mientras presiona el émbolo; retire lentamente la aguja. Si es necesario, use un hisopo de algodón para absorber cualquier sangre o líquido del orificio. Libere suavemente la presión para cerrar los párpados del ratón.Devuelva el animal a una placa calefactora para su recuperación. Cada día después de la inyección, examine el ojo en busca de leucocoria. Esto generalmente se vuelve evidente entre dos y cuatro semanas después de la inyección.Una vez detectado el crecimiento tumoral, sacrifique al animal según las directrices institucionales. Bajo un microscopio estereoscópico, realice una incisión circunferencial en el limbo, retire la córnea y el cristalino, y separe cuidadosamente la mayor parte de la masa tumoral de los demás tejidos utilizando pinzas. Coloque el tumor en RPMI 1640 estéril.Con pinzas, extraiga lentamente el globo ocular abierto del hueso hasta exponer el nervio óptico. Mientras levanta suavemente el globo del hueso, use tijeras para cortar el nervio óptico, dejando la mayor parte del nervio adherida al globo posible, con el fin de evaluar la invasión del nervio óptico por el tumor. Coloque en formalina tamponada al 10% neutra para histología, como se observa.Aquí se muestra un ejemplo de esferas tumorales cultivadas. Después de tres días, solo unas pocas esferas tumorales son evidentes entre el tejido tumoral desagregado. Sin embargo, a los 10 días, el número de esferas tumorales ha aumentado.Las esferas presentan una membrana externa bien definida, como se muestra en el inserto en la esquina superior derecha varias semanas después de la inyección. El ratón inyectado presenta leucocoria, el reflejo pupilar blanco se debe a un tumor ubicado en la parte posterior del ojo. En estos ejemplos de secciones oculares teñidas con h y d, obsérvese el tumor de retinoblastoma xenoinjertado que llena la cavidad vítrea a la izquierda, y la ausencia de este crecimiento en el ojo inyectado con control (mock) a la derecha.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar células tumorales cultivadas, realizar adecuadamente una inyección intraocular en el ojo de un ratón y cómo buscar la progresión tumoral. Una vez dominada, la técnica de inyección puede completarse en aproximadamente 30 minutos por animal. Si se realiza correctamente, no olvide que las células tumorales pueden ser peligrosas y que siempre se deben tomar precauciones, como usar equipo de protección personal adecuado, incluyendo bata de laboratorio y mascarillas, durante la realización de este procedimiento. Las células de cáncer humano siempre deben manipularse bajo condiciones BSL-2.

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