La medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación

El objetivo general de este procedimiento es medir las citocinas proinflamatorias producidas en un ensayo de estimulación de sangre completa. Primero, los componentes celulares de la sangre completa se aíslan del plasma mediante centrifugación, y los glóbulos blancos se cuentan utilizando tinción con naranja de acridina. A continuación, las células se siembran y estimulan con LPS seguido de un TP para inducir la producción de citocinas por las células que expresan receptores de reconocimiento de patrones microbianos. Luego, los sobrenadantes de cultivo se recogen en puntos temporales específicos tras el inicio de la estimulación.

Finalmente, las concentraciones de citocinas en los sobrenadantes se miden mediante un ensayo multiplex en placa de 96 pocillos. Mediante este método sencillo, se puede evaluar rápidamente la variación en las concentraciones de citocinas proinflamatorias producidas por células estimuladas de diferentes donantes. Este método es especialmente útil para identificar enfermedades inflamatorias mediadas por I en pacientes con manifestaciones patológicamente antiinflamatorias, particularmente en circunstancias donde el volumen de sangre obtenible es limitado.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes al medir concentraciones de citoquinas es que la tecnología basada en Luminex permite la medición simultánea de varias citoquinas utilizando únicamente un pequeño volumen de muestra. Obtenga muestras que contengan 10 mililitros o más de sangre venosa de individuos afectados, así como de controles sanos apareados por edad y sexo, asegurándose de que las muestras se recojan en tubos para extracción de sangre tipo vacutainer con heparina sódica, y de que no se añada EDTA ni otros anticoagulantes, ya que interferirían con el ensayo; procese las muestras lo antes posible tras su recolección. Si es necesario, las muestras pueden almacenarse hasta 24 horas a temperatura ambiente y en condiciones de luz tenue.

Centrifugue las muestras de sangre a 3000 RPM durante 10 minutos a temperatura ambiente con el freno desactivado. Una vez centrifugadas las muestras, retire el plasma de la parte superior de los tubos teniendo cuidado de no perturbar la capa de coágulo blanco que contiene las células mononucleares. A continuación, resuspenda el coágulo blanco y el sedimento subyacente de glóbulos rojos en medio RPMI libre de suero a temperatura ambiente para lavar las células, pipeteando suavemente la mezcla.

Luego, transfiera las células desde el tubo de recolección a un tubo cónico de 50 mililitros. Complete el volumen hasta 50 mililitros con RPMI e invierta suavemente cada tubo para mezclar. Centrifugue las células una vez más a 3000 RPM durante 10 minutos.

Luego aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el botón celular. Repita este paso de lavado de dos a cuatro veces para eliminar contaminantes y eliminar citocinas unidas a las células. Una vez que las células hayan sido lavadas, resuspenda en RPMI libre de suero hasta un volumen total de 20 mililitros. Para contar las células, cargue 20 microlitros de una mezcla uno a uno de la muestra y anaranjado de acridina en una cámara de conteo desechable. La anaranjado de acridina utilizada a una concentración final de un microgramo por mililitro tiñirá únicamente los glóbulos blancos con núcleo, permitiendo diferenciarlos de los glóbulos rojos.

Contar únicamente las células D positivas una vez obtenido el recuento celular. Suspender nuevamente las muestras en RPMI sin suero para alcanzar una concentración final de 2 millones de células por mililitro. Para cada muestra, etiquetar pozos duplicados de una placa de 24 pozos con las condiciones experimentales que se probarán.

En este caso, las condiciones son sin estimular, LPS solo, un TP solo, y LPS más un TP. Añada un mililitro de células diluidas a cada pocillo y agregue LPS a los pocillos correspondientes a una concentración final de un microgramo por mililitro. Incube las muestras a 37 grados Celsius en un incubador con 5 % de dióxido de carbono durante dos horas y 40 minutos. Tras este período inicial de incubación, añada el TP a una concentración final de dos milimolares en los pocillos de TP solo y LPS más TP. A continuación, incube las placas durante 20 minutos adicionales a 37 grados Celsius.

Una vez finalizada la segunda incubación, transfiera las células de cada pocillo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros previamente etiquetado, centrifugue las muestras a 10 000 RRM durante dos minutos a temperatura ambiente y luego transfiera el sobrenadante de cada tubo a un nuevo tubo EOR previamente etiquetado. El sobrenadante puede ensayarse inmediatamente para citocinas o almacenarse congelado para evaluar las concentraciones de IL-1β u otras citocinas. En las muestras, utilizamos el Bio-Plex Pro citocina humana X-plex con el sistema Bio-Plex 200.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante. En esta figura, el análisis de la producción de IL-1β tras la estimulación de células de sangre periférica normal con LPS, ATP o ambos estímulos juntos muestra una respuesta a LPS más ATP, cuya magnitud depende del número de células estimuladas. En contraste con los controles sanos, los ensayos de sangre total provenientes de pacientes con patologías autoinflamatorias revelan una producción aumentada de IL-1β tras la estimulación con LPS, en ausencia de ATP añadido exógenamente. No olvide que trabajar con fluidos corporales humanos, como la sangre, puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones universales al realizar este procedimiento.