Name: La medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T18:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprende a medir citoquinas pro-inflamatorias como IL-1β mediante un ensayo de estimulación de sangre completa con LPS. Este método permite evaluar rápidamente variaciones entre donantes y diagnosticar enfermedades autoinflamatorias.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la piel de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Recolección de sangre entera <ol><li> Obtener un mínimo de 10 ml de sangre periférica de los individuos afectados, así como la edad y el sexo controles sanos. La sangre venosa se deberían recoger en tubos vacutainer con heparina sódica de recolección de sangre, en lugar de utilizar otros anticoagulantes como EDTA, y se invierte varias veces para asegurar una mezcla adecuada con la heparina sódica. Tenga en cuenta que 10 ml es el volumen mínimo de sangre requerido para la siembra en las muestras por duplicado para este ensayo en particular. </li><li> Las muestras deben ser procesadas tan pronto como sea posible después de la recolección para obtener mejores resultados. Sin embargo, la sangre heparinizada se pueden almacenar a temperatura ambiente bajo condiciones de poca iluminación para un máximo de 24 horas hasta que esté listo para ser procesado (2). </li></ol> 2. Preparación de sangre entera <ol><li> Centrifugar todas las muestras de sangre a 3.000 rpm (con freno desactivado) durante diez minutos a temperatura ambiente. Sin alterar la capa leucocitaria, el plasma se pueden obtener de la parte superior y se almacena para otros fines experimentales. Las muestras de plasma se puede almacenar temporalmente a -20 ° C o -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo </li><li> Una vez que el plasma se recoge, lavado de las muestras por resuspensión de los glóbulos rojos (GR) de pellets y la capa leucocitaria con suero libre (incompleta) RPMI 1640 los medios de comunicación (a temperatura ambiente). Pipeta suavemente la mezcla en los tubos de recogida y traslado a un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Volumen hasta 50 ml con los medios de comunicación incompleta de cultivo RPMI 1640 y suavemente invierta los tubos para crear una mezcla homogénea. Centrifugar las muestras a 3000 rpm (con freno desactivado) durante diez minutos. Asegurarse de que exista una separación clara, aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar la capa leucocitaria. Repita este procedimiento 2-4 veces para asegurarse de que todos los contaminantes y las citocinas obligado se retiran antes de la estimulación. </li><li> Después del último lavado, resuspender el precipitado de glóbulos rojos y la capa leucocitaria de modo que el volumen total es de 20 ml (para 10 ml de sangre total extraída inicialmente) con incompleta RPMI 1640 los medios de comunicación. El volumen total se puede ajustar en función del volumen de sangre extraída inicialmente. </li><li> Uso de la Visión Cellometer, sangre diluida se puede contar sin glóbulos rojos lisis por la elección de la opción de glóbulos blancos cuentan con naranja de acridina (AO). Añadir una parte de la sangre diluida con AO una parte, y carga de 20 l de la mezcla de 1:1 en una cámara de recuento desechables. La concentración final de AO después de la dilución debe ser 1μg/mL. </li><li> Los ajustes necesarios con incompleta RPMI 1640 los medios de comunicación a una concentración celular final de 2.0 x 10 6 células / ml. </li></ol> 3. La estimulación de la sangre entera <ol><li> El ensayo requiere un mínimo de cuatro condiciones (cada uno hizo por duplicado): estimular, además de LPS solo, la adición de ATP sola, y finalmente LPS más ATP se suman. Añadir 1 ml del preparado 2.0 x 10 6 células / ml de sangre total diluida en el pozo apropiado de una placa de tejido de 24 pocillos. </li><li> Los estimulantes debe ser reconstituido y que alcance la temperatura ambiente antes de comenzar el ensayo de estimulación. Liofilizado LPS y el ATP debe ser reconstituido de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Tras la reconstitución, LPS y el ATP puede ser diluida a una concentración de existencias adecuada utilizando incompleta RPMI 1640 los medios de comunicación. </li><li> Añadir a la LPS LPS sólo, así como a la LPS más ATP y por lo que la concentración final de trabajo de LPS es 1 mg / ml. La duración de la estimulación total es de 3 horas. Sin embargo, la sangre es estimuladas con LPS durante 2 horas y 40 minutos. Las muestras se colocarán en una incubadora a 37 ° C y 5% CO 2. </li><li> ATP se agrega durante los restantes 20 minutos del período de estimulación 3 horas. Añadir a la ATP ATP y solo el LPS y así ATP y las muestras de lugar en la incubadora. La concentración final de trabajo de ATP es de 2 mm. </li><li> Después del período de incubación de 3 horas, recoger los sobrenadantes por alícuotas de cada muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y posteriormente centrifugar las muestras a 10.000 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente. Transferir el sobrenadante a otro conjunto de tubos de 1,5 microcentrífuga. </li><li> Las muestras pueden analizarse inmediatamente o almacenada temporalmente a -20 ° C o -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 4. Citoquinas ensayo <ol><li> Las muestras que se congelan necesidad de equilibrar a temperatura ambiente antes del análisis. Las concentraciones de citocinas para IL-1βcan se evaluó a través de una variedad de métodos. Utilizamos el Bio-Plex citoquina pro humanos x compleja ensayo con el Bio-Plex 200 del sistema, las instrucciones del fabricante. En este protocolo están específicamente la medición de IL-1β, sin embargo, nosotros utilizamos este ensayo multiplex de citoquinas con el fin de medir simultáneamente múltiples citocinas en un ensayo con la ventaja de utilizar un pequeño volumen de muestra. </li></ol> 5. Resultados representante El análisis de la IL-1β de producción a la estimulación con LPS éxito y el ATP se muestra unasí la respuesta depende del número de células se estimularon. Hemos encontrado que x 2.0 10 6 células / ml es una concentración suficiente para producir una concentración óptima y medibles de IL-1β, así como otras citoquinas (Figura 2). Los ensayos de toda la sangre son útiles en el estudio de los pacientes que presentan manifestaciones autoinflamatoria. Estos pacientes pueden presentar un defecto en el sistema inmune innato, que se caracteriza por la sobreproducción de IL-1β (en comparación con los controles) a la estimulación con LPS solo (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2662/2662fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Imagen representativa de la tinción de AO de células nucleadas blancas de la sangre utilizada para determinar la concentración de células en muestras de sangre diluida. <img src="/files/ftp_upload/2662/2662fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. IL-1β producción medida en el sobrenadante de sangre de un donante sano a la estimulación con LPS en las concentraciones de células cada vez mayor. Las muestras fueron analizadas por triplicado. <img src="/files/ftp_upload/2662/2662fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Los resultados representativos de la secreción de IL-1β medidos en los sobrenadantes de sangre total de dos controles normal y saludable, así como dos pacientes con IL-1β, de manifestaciones de autoinflamatoria.

<ol><li>Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasomes%3A+guardians+of+the+body%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammasomes: guardians of the body.</a> Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).</li>
<li>Thurm, C. W., Halsey, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytokine+production+using+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytokine production using whole blood.</a> Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.</li>
<li>Mariathasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopyrin+activates+the+inflammasome+in+response+to+toxins+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP.</a> Nature. 440, 228-232 (2006).</li>
<li>Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1+pathways+in+inflammation+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">IL-1 pathways in inflammation and human diseases.</a> Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).</li>
<li>Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).</li>
<li>Sims, J. E., Smith, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-1+family%3A+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The IL-1 family: regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).</li>
<li>Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+production+and+pattern+recognition+receptor+%28PRR%29+expression+in+whole+blood+stimulated+with+pathogen-associated+molecular+patterns+%28PAMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs.</a> Cytokine. 32, 304-315 (2005).</li>
<li>Netea, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+the+activation+of+the+inflammasome+for+processing+and+release+of+IL-1bin+monocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages.</a> Blood. 113, 2324-2335 (2009).</li>
<li>Latz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasomes%3A+mechanisms+of+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immnol%22%5BJournal%5D)">The inflammasomes: mechanisms of activation and function.</a> Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).</li>
<li>Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horror+autoinflammaticus%3A+the+molecular+pathophysiology+of+autoinflammtory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease.</a> Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).</li>
</ol>

La prueba de sangre entera se describe un método simple que reproduce mejor las condiciones fisiológicas en comparación con otras técnicas que requieren aislamiento de células y procesamiento de muestras extensas y la manipulación. Este método utiliza la visión Cellometer con AO para contar los glóbulos blancos en la sangre y por lo tanto, proporciona una manera de estandarizar la precisión muestras basadas en el número de células. Hay que tener en cuenta que para este ensayo, la sangre ente...

<table><tbody><tr><td>Tubos de recolección de sangre con heparina sódica</td><td>BD Biosciences</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Medio RPMI 1640</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>21870-100</td><td></td></tr><tr><td>Acridina naranja</td><td>Invitrogen</td><td>A3568</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td>Comuníquese con la empresa para obtener información sobre el instrumento</td></tr><tr><td>Cámaras de recuento de células Cellometer</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>LPS de &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; K12 ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&amp;#180;-trifosfato, sal disódica hidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Bio-plex 200</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Comuníquese con la empresa para obtener información sobre el instrumento</td></tr><tr><td>Ensayo x-plex Bio-Plex Pro para citocinas humanas</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Los ensayos x-plex se fabrican a medida según las citocinas de interés especificadas</td></tr></tbody></table>

la medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria il-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Los procesos inflamatorios como resultado de la secreción de mediadores solubles de las células inmunes, conducen a diversas manifestaciones en la piel, articulaciones y otros tejidos, así como la homeostasis alterada de citoquinas. El sistema inmune innato desempeña un papel crucial en el reconocimiento de patógenos y otros estímulos endógenos peligro. Una de las principales citoquinas liberadas por células del sistema inmune innato es interleuquina (IL) -1. Por lo tanto, utilizamos un análisis de sangre toda la estimulación con el fin de medir la secreción de citoquinas inflamatorias y, específicamente, de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β 1, 2, 3. Los pacientes con trastornos genéticos del sistema inmune innato que causan síndromes de autoinflamatoria muestran una versión exagerada de IL-1β madura a la estimulación con LPS solo. Con el fin de evaluar el componente inmune innato de los pacientes que presentan patologías inflamatorias asociadas, se utiliza un inmunoensayo específico para detectar la respuesta inmune celular a patógenos patrones moleculares asociados (PAMP), tales como las endotoxinas bacterianas gram-negativas, el lipopolisacárido (LPS ). Estos PAMPs son reconocidos por receptores de reconocimiento de patógenos (RRP), que se encuentran en las células del sistema inmune innato 4, 5, 6, 7. Una señal de primaria, LPS, junto con una señal secundaria, ATP, es necesaria para la activación de la inflamasoma, un complejo multiproteico que los procesos de pro-IL-1β a su forma madura, bioactivos 4, 5, 6, 8, 9, 10. La prueba de sangre entera requiere una manipulación mínima de la muestra para evaluar la producción de citoquinas en comparación con otros métodos que requieren mucha mano de obra de aislamiento y cultivo de poblaciones celulares específicas. Este método se diferencia de otras pruebas de sangre entera estimulación, en lugar de diluir las muestras con una proporción de RPMI medios de comunicación, se realiza un recuento de glóbulos blancos directamente de la sangre entera diluida y, por tanto, estimular un número conocido de células blancas de la sangre en la cultura 2. Los resultados de este ensayo en sangre entera en particular demostrar una nueva técnica útil en el esclarecimiento de cohortes de pacientes que presentan fisiopatologías autoinflamatoria.

Se describe un inmunoensayo simple para medir la producción de citoquinas pro-inflamatorias, como IL-1 beta, en pacientes con fenotipos autoinflamatoria. Mediante la activación de las células en cultivos de sangre total con el patógeno patrones moleculares asociados, específicamente con lipopolisacárido, la secreción de citoquinas puede ser convenientemente evaluada en los sobrenadantes de sangre total.

La medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación

Los procesos inflamatorios derivados de la secreción de mediadores solubles por parte de las células inmunitarias provocan diversas manifestaciones en la piel, las articulaciones y otros tejidos...

El objetivo general de este procedimiento es medir las citocinas proinflamatorias producidas en un ensayo de estimulación de sangre completa. Primero, los componentes celulares de la sangre completa se aíslan del plasma mediante centrifugación, y los glóbulos blancos se cuentan utilizando tinción con naranja de acridina. A continuación, las células se siembran y estimulan con LPS seguido de un TP para inducir la producción de citocinas por las células que expresan receptores de reconocimiento de patrones microbianos. Luego, los sobrenadantes de cultivo se recogen en puntos temporales específicos tras el inicio de la estimulación.Finalmente, las concentraciones de citocinas en los sobrenadantes se miden mediante un ensayo multiplex en placa de 96 pocillos. Mediante este método sencillo, se puede evaluar rápidamente la variación en las concentraciones de citocinas proinflamatorias producidas por células estimuladas de diferentes donantes. Este método es especialmente útil para identificar enfermedades inflamatorias mediadas por I en pacientes con manifestaciones patológicamente antiinflamatorias, particularmente en circunstancias donde el volumen de sangre obtenible es limitado.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes al medir concentraciones de citoquinas es que la tecnología basada en Luminex permite la medición simultánea de varias citoquinas utilizando únicamente un pequeño volumen de muestra. Obtenga muestras que contengan 10 mililitros o más de sangre venosa de individuos afectados, así como de controles sanos apareados por edad y sexo, asegurándose de que las muestras se recojan en tubos para extracción de sangre tipo vacutainer con heparina sódica, y de que no se añada EDTA ni otros anticoagulantes, ya que interferirían con el ensayo; procese las muestras lo antes posible tras su recolección. Si es necesario, las muestras pueden almacenarse hasta 24 horas a temperatura ambiente y en condiciones de luz tenue.Centrifugue las muestras de sangre a 3000 RPM durante 10 minutos a temperatura ambiente con el freno desactivado. Una vez centrifugadas las muestras, retire el plasma de la parte superior de los tubos teniendo cuidado de no perturbar la capa de coágulo blanco que contiene las células mononucleares. A continuación, resuspenda el coágulo blanco y el sedimento subyacente de glóbulos rojos en medio RPMI libre de suero a temperatura ambiente para lavar las células, pipeteando suavemente la mezcla.Luego, transfiera las células desde el tubo de recolección a un tubo cónico de 50 mililitros. Complete el volumen hasta 50 mililitros con RPMI e invierta suavemente cada tubo para mezclar. Centrifugue las células una vez más a 3000 RPM durante 10 minutos.Luego aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el botón celular. Repita este paso de lavado de dos a cuatro veces para eliminar contaminantes y eliminar citocinas unidas a las células. Una vez que las células hayan sido lavadas, resuspenda en RPMI libre de suero hasta un volumen total de 20 mililitros. Para contar las células, cargue 20 microlitros de una mezcla uno a uno de la muestra y anaranjado de acridina en una cámara de conteo desechable. La anaranjado de acridina utilizada a una concentración final de un microgramo por mililitro tiñirá únicamente los glóbulos blancos con núcleo, permitiendo diferenciarlos de los glóbulos rojos.Contar únicamente las células D positivas una vez obtenido el recuento celular. Suspender nuevamente las muestras en RPMI sin suero para alcanzar una concentración final de 2 millones de células por mililitro. Para cada muestra, etiquetar pozos duplicados de una placa de 24 pozos con las condiciones experimentales que se probarán.En este caso, las condiciones son sin estimular, LPS solo, un TP solo, y LPS más un TP. Añada un mililitro de células diluidas a cada pocillo y agregue LPS a los pocillos correspondientes a una concentración final de un microgramo por mililitro. Incube las muestras a 37 grados Celsius en un incubador con 5 % de dióxido de carbono durante dos horas y 40 minutos. Tras este período inicial de incubación, añada el TP a una concentración final de dos milimolares en los pocillos de TP solo y LPS más TP. A continuación, incube las placas durante 20 minutos adicionales a 37 grados Celsius.Una vez finalizada la segunda incubación, transfiera las células de cada pocillo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros previamente etiquetado, centrifugue las muestras a 10 000 RRM durante dos minutos a temperatura ambiente y luego transfiera el sobrenadante de cada tubo a un nuevo tubo EOR previamente etiquetado. El sobrenadante puede ensayarse inmediatamente para citocinas o almacenarse congelado para evaluar las concentraciones de IL-1β u otras citocinas. En las muestras, utilizamos el Bio-Plex Pro citocina humana X-plex con el sistema Bio-Plex 200.De acuerdo con las instrucciones del fabricante. En esta figura, el análisis de la producción de IL-1β tras la estimulación de células de sangre periférica normal con LPS, ATP o ambos estímulos juntos muestra una respuesta a LPS más ATP, cuya magnitud depende del número de células estimuladas. En contraste con los controles sanos, los ensayos de sangre total provenientes de pacientes con patologías autoinflamatorias revelan una producción aumentada de IL-1β tras la estimulación con LPS, en ausencia de ATP añadido exógenamente. No olvide que trabajar con fluidos corporales humanos, como la sangre, puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones universales al realizar este procedimiento.

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