La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

El objetivo general de este procedimiento es realizar una tinción inmunofluorescente para las proteínas de la zona activa en las larvas tercera y estrella de Drosophila. Esto se logra seleccionando y fijando primero las larvas en la placa de disección. El segundo paso del procedimiento es diseccionar las larvas, eliminando el exceso de tejido para exponer los músculos y las uniones neuromusculares.

El tercer paso del procedimiento es inmunoteñir las pieles de las larvas disecadas directamente en la placa de disección. El paso final del procedimiento es montar las pieles de las larvas en un portaobjetos de microscopio. Finalmente, se pueden obtener resultados de la morfología de la zona activa de la unión neuromuscular CHO mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurología, como la regulación de las proteínas de la unión neuromuscular como una vez involucradas en la morfología de la zona activa Para crear una superficie de disección, vierta cigarro, base de elastómero de silicona 180 4 en una pequeña placa de cultivo de tejidos. Asegúrese de no llenar la placa por completo, de modo que el área de disección sea más baja que el borde Recorte los pasadores de disección a una longitud de aproximadamente tres a cinco milímetros para una mayor facilidad de manipulación, y asegúrese de tener al menos seis alfileres por larva de cepas de tipo salvaje y mutantes. Identifique y seleccione las larvas errantes del tercer estadio que se arrastran activamente alrededor de la pared del vial y que no han comenzado a pupar.

Retire dos larvas de cada genotipo de los viales y colóquelas en un plato de lavado lleno de PBS para eliminar los desechos bajo un microscopio estereoscópico. Elimine el exceso de humedad en la superficie de disección con una toallita kim. Coloque las larvas de manera que el lado dorsal esté hacia arriba y las dos tráqueas blancas sean visibles a lo largo del lado dorsal del centro de las larvas.

Las tráqueas en el centro de las larvas mientras marcan su lugar en la línea media dorsal. El alfiler número uno justo encima de los ganchos de la boca, y luego coloque el alfiler número dos en la posición de la cola justo encima de los esféricos y entre las tráqueas. Agregue una pequeña cantidad de PBS a las larvas para evitar que la cutícula se seque.

Asegúrese de mantener los diferentes genotipos separados colocando un alfiler entre cada grupo. Una vez que las larvas hayan sido inmovilizadas, haga un corte transversal a través de las tráqueas justo por encima del pin número dos. Inserta las tijeras en este corte y corta a lo largo de la línea media dorsal entre las tráqueas hasta más allá del alfiler número uno si es necesario.

Haz cuatro cortes pequeños adicionales en la parte superior e inferior de cada lado de la cutícula para que los lados izquierdo y derecho se abran, lo que te permitirá sujetarlos sin tirar de la cutícula. Una vez que cada esquina de la cutícula esté sujeta contra la almohadilla de disección, fije las larvas de filete con 4% de formaldehído durante 20 a 25 minutos a temperatura ambiente. Después de unos 25 minutos de tiempo de fijación, decantar el aldehído paraformado y enjuagar con PB S3 veces decantando cada vez con las larvas en una gota de PBS bajo el microscopio estereoscópico, agarrar el extremo posterior de una de las tráqueas con pinzas de disección y sacarlo.

Repita para la segunda tráquea. Toma un poco del cuerpo graso posterior o del tejido intestinal y sácalo del área de disección. Una vez que se haya extirpado la mayor parte del tejido posterior, concéntrese en eliminar los tejidos pequeños que rodean el cerebro.

Una vez que la piel de la larva está libre de exceso de tejido, se puede teñir directamente en la almohadilla de disección utilizando un anticuerpo primario para reconocer la zona activa, seguido de un anticuerpo secundario fluorescente Después de la tinción inmunofluorescente de la zona activa, el siguiente paso es montar las pieles de las larvas con inmunotinción. Comience por decantar y absorber el lavado final después de la incubación secundaria de anticuerpos y pipetear aproximadamente un mililitro de glicerol al 80%. Para cubrir las pieles de las larvas, retire todas las larvas menos una y luego coloque dos gotas de medio de montaje en un portaobjetos de microscopio.

Retire el último alfiler y agarre las larvas por la cola con pinzas romas. Arrastre las larvas en el glicerol y luego coloque las larvas en la primera gota de medio de montaje y haga lo mismo con las larvas restantes del mismo genotipo. Una vez que todas las larvas estén en la primera caída del medio de montaje, agarre las larvas una por una y arrástrelas a través de la gota y luego a lo largo de los bordes secos del portaobjetos para eliminar la mayor parte del medio.

A continuación, coloque las larvas en la segunda gota de medio de montaje. Prepare la diapositiva final etiquetándola y colocando una pequeña forma de T de medio de montaje en la diapositiva. Repita el procedimiento de arrastre y secado con las larvas en la segunda caída del medio de montaje y, a continuación, coloque las larvas con la cutícula hacia abajo en el medio de montaje.

En el portaobjetos final, coloque un cubreobjetos en el portaobjetos para cubrir las larvas disecadas con el borde inicial En la línea superior de la tee, coloque un pequeño peso sobre el portaobjetos durante unos cinco minutos para asegurarse de que el medio de montaje se extienda por completo, y luego déjelo reposar en la oscuridad hasta que el medio de montaje se haya curado. Para preparar el portaobjetos para la microscopía, limpie cualquier medio de montaje residual y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Aquí se muestra la orientación correcta de las pieles de las larvas montadas.

Observe que las pieles son planas, con la cutícula hacia abajo, y que hay al menos un ancho corporal de larva entre las pieles. Una vez finalizadas las disecciones larvarias, la tinción y el montaje. La microscopía se puede utilizar para identificar el músculo larvario de interés ubicado en segmentos de dos a seis.

Usando un objetivo de alta potencia, uno puede enfocarse en una sola sinapsis y tomar una imagen de la pila ZS con un microscopio. Aquí se muestra una imagen representativa de proyección máxima de una porción de sinapsis con tinción NC 82 en verde y tinción presináptica HRP en rojo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inmunotinción para proteínas importantes de la unión neuromuscular, como las involucradas en la morfología de la zona activa.