Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

El objetivo general de este procedimiento es aislar embriones de ratón E 8.5 para su uso en ensayos de cromatina, inmunoprecipitación o chip. Esto se logra primero aislando los embriones de ratón y preparando suspensiones de células individuales. El segundo paso del procedimiento consiste en realizar un entrecruzamiento químico de las proteínas unidas al ADN con el ADN genómico, seguido de sonicación para fragmentar el ADN.

El tercer paso del procedimiento consiste en inmunoprecipitar complejos de proteína y cromatina y aislar el ADN purificado. El paso final del procedimiento es analizar el ADN inmunoprecipitado y purificado mediante PCR convencional o mediante PCR cuantitativa en tiempo real. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren interacciones de proteínas con secuencias reguladoras de genes específicos de diferenciación durante la iniciación del programa de diferenciación en tejidos y órganos en desarrollo.

Este semestre puede ayudar a responder una buena pregunta sobre el inicio del programa de diferenciación durante la embriogénesis mediante la identificación de factores reguladores que interactúan con las secuencias reguladoras de genes específicos de diferenciación cuando adquieren competencia transcripcional. Para comenzar este procedimiento, se extraen los cuernos uterinos de un ratón sacrificado al día embrionario 8.5. De acuerdo con un protocolo aprobado, el tejido se coloca en una placa de Petri que contiene medio de corte fresco utilizando tijeras.

Corte cada sitio de implantación individualmente y colóquelos en una placa de Petri que contenga medio de disección fresco para evitar exceso de sangre. Con la pinza número ocho, retire la capa uterina de cada sitio de implantación para exponer el deciduo y aislar los embriones individuales usando pinzas. En esta etapa del desarrollo, los embriones están rodeados por el saco vitelino parietal, que contacta con el tejido deciduar, el saco vitelino visceral y el amnios.

El amnios es una membrana transparente que está en contacto directo con el embrión. El saco vitelino visceral se encuentra entre el amnios y el saco vitelino parietal, y se distingue fácilmente en embriones de 8,5 a 9,5 días por la presencia de vasos sanguíneos prominentes que nutren al embrión. Retire cada embrión de sus membranas circundantes y transfiéralo individualmente a una nueva placa que contenga medio de disección para eliminar el exceso de sangre.

Luego, transfiera cada embrión a un tubo einor de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de medio de disección. La homogenización del embrión aislado comienza con la adición de 200 microlitros de colagenasa. Tipo dos solución a cada tubo einor que contenga los embriones.

Agite suavemente las muestras en un agitador a 37 grados Celsius a 100 RPM durante 20 minutos. Luego, resuspenda las muestras golpeando suavemente para deshacer los agregados de células. Aplique la suspensión celular sobre la parte superior de un filtro celular estéril de malla de 40 micrones colocado sobre un tubo eppendorf de 1,5 mililitros.

Aplique inmediatamente 600 microlitros de D-P-B-S 1X a temperatura ambiente sobre la parte superior del filtro celular para completar la separación. Una vez que la suspensión haya sido filtrada, deseche el filtro celular y centrifugue las muestras a 4.000 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, deseche los sobrenadantes reus.

Suspenda cada pellet en un mililitro de D-P-B-S 1X a temperatura ambiente. Luego, centrifugue las muestras a 4.000 ×g durante un minuto a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante por segunda vez, resuspenda cada pellet en 200 microlitros de medio de disección a temperatura ambiente. Entrecruce la cromatina añadiendo 5,6 microlitros de formaldehído al 37% a las muestras de 200 microlitros para obtener una concentración final de formaldehído al 1%.

Incube las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente; tras la incubación, centrifugue las muestras a 4.000 G durante tres minutos a cuatro grados Celsius y deseche el sobrenadante. Reuspenda las células con D-P-B-S frío al uno X que contenga 80 microlitros por mililitro de cóctel de inhibidores de proteasas o PIC. Luego, centrifugue las muestras a 4.000 G durante tres minutos a cuatro grados Celsius.

Tras descartar el sobrenadante, las muestras pueden congelarse a menos 80 grados Celsius y son estables durante varios meses antes de la sonicación. Descongele el pellet celular congelado en hielo o coloque el pellet del paso anterior en hielo. Re suspenda el pellet celular en 100 microlitros de tampón de lisis SDS a temperatura ambiente tras la re suspensión. Se añaden adicionales 100 microlitros de tampón de lisis SDS a temperatura ambiente y la muestra se resuspende por pipeteo e inversión.

Incube la suspensión celular en hielo durante 10 minutos. Tras la incubación, prepare el ator para romper el ADN entrecruzado en fragmentos de entre 200 y 500 pares de bases. En esta demostración, se utiliza un DIO geno bio rupture UCD 200.

Sonicar la muestra rodeada por una mezcla de hielo. No permitir que se caliente por encima de cuatro grados Celsius ni que se congele en la centrífuga. Centrifugar la muestra sonicada a 14.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Transfiera el sobrenadante a un tubo eend DPH nuevo preciado en hielo. Divida la muestra sonicada en un máximo de cinco alícuotas. Almacene una alícuota a menos 20 grados Celsius para reservar su muestra de entrada para la reversión del entrecruzamiento.

Diluir por etapas los otros alícuotas diez veces en tampón de dilución para chip que contenga PIC recién añadido a una concentración de un microlitro por cada 800 microlitros de tampón. Primero, determinar qué velocidades de centrifugación se utilizarán para la precorrección según el anticuerpo que se vaya a usar para la proteína del ensayo de chip. Aquí se usan perlas A porque el anticuerpo que se usará para el chip es de origen murino.

Pre-limpiar el sobrenadante diluido añadiendo 75 microlitros de una solución al 50% de esperma de salmón, ADN y proteína. Incubar a velocidad de agitación a cuatro grados Celsius con rotación durante una hora; tras la incubación, centrifugar las muestras a 2.500 G durante un minuto a cuatro grados Celsius. Transferir los sobrenadantes a un nuevo tubo Eppendorf preenfriado.

Añada cuatro microgramos de anticuerpo por muestra al Eloqua previamente clarificado e incube toda la noche a cuatro grados Celsius con rotación. Comience añadiendo 60 microlitros de la suspensión de perlas de salmón esperma, ADN proteína, a aeros en cada muestra e incube a cuatro grados Celsius con rotación durante una hora. Centrifugue las muestras a 1000 G durante un minuto a cuatro grados Celsius.

Tras la centrifugación, retire cuidadosamente los sobrenadantes y deséchelos, manteniendo el complejo de ADN, proteína y perlas en hielo. Resuspenda y lave los pellet según se describe en el protocolo escrito, utilizando los tampones del uno al cuatro.

Cada lavado consiste en un período de incubación de cinco minutos con rotación, seguido de centrifugación a 1000 G durante un minuto y eliminación del sobrenadante tras el lavado. Eluir el complejo de cromatina y anticuerpo resuspendiendo vigorosamente el complejo de perlas de proteína de cromatina lavado en 250 microlitros de tampón de elución recién preparado. Vortex cada muestra durante cinco segundos y luego incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos con rotación, tras centrifugación a 2.500 G durante un minuto. A temperatura ambiente, transferir cada eluido a un nuevo tubo eppendorf.

Repita el proceso de elución y combine el eluato de cada muestra en el mismo tubo eppendorf. Para revertir los enlaces cruzados, agregue 20 microlitros de cloruro de sodio al cinco por ciento a cada eluato de 500 microlitros. Para el control de entrada previamente reservado, agregue 40 microlitros de cloruro de sodio al cinco por ciento por mililitro.

Caliente los EIT en un baño de agua a 65 grados Celsius durante cuatro horas. Para la noche, cargue 10 microlitros de cada muestra en el control de entrada en un gel de agarosa al 2 % junto a un marcador de tamaño que abarque de 0,1 a un par de kilobases para verificar el tamaño del fragmento de ADN. El ADN aparecerá como una mancha difusa y no como una banda nítida.

Recupere el ADN de cada muestra de 500 microlitros utilizando un kit de extracción en gel rápido kaya. Comience añadiendo 600 microlitros de tampón qg para optimizar la absorción del ADN con la membrana de sílice en una columna de centrifugación rápida kaya y luego añada 200 microlitros de isopropanol antes de cargar la columna. Revise la mezcla para determinar si hay algún precipitado de SDS presente.

Si se ha producido precipitación de SDS, las muestras deben calentarse en un baño de agua a 42 grados Celsius hasta que el precipitado desaparezca. Luego, aplique las muestras a las columnas y eluya el ADN según las instrucciones del fabricante. El SDS puede interferir con la actividad de la polimerasa PCRT y, por lo tanto, debe eliminarse completamente antes de realizar la PCR.

Incube cada muestra de ADN en hielo para precipitar cualquier resto de SDS y centrifugue a 14.000 G durante un minuto a cuatro grados Celsius. Transfiera el SANE a nuevos tubos einor. Los EIT de ADN se pueden detectar mediante PCR convencional o mediante PCR cuantitativa en tiempo real o QPCR con cebadores específicos. Para cada secuencia que se analice, utilice de cinco a 10 microlitros del ADN total IIT para una reacción de PCR o QPCR. Las condiciones de PCR y QPCR variarán.

Sin embargo, la cantidad limitada de material inicial requiere ciclos adicionales de PCR para la detección mediante PCR convencional; comience con 40 ciclos y ajuste según sea necesario. Mediante este protocolo, se han realizado experimentos de ChIP a partir de embriones de E 8.5 y E 9.5. Los ADN purificados por ChIP se analizaron mediante PCR convencional y mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

Los resultados demuestran que el factor miogénico y regulador está presente en el promotor miogénico de embriones E 8.5 y E 9.5. En contraste, no hubo indicación de unión miogénica al promotor miogénico en el saco vitelino, donde no se expresa la miogénesis. El promotor del interferón gamma, que contiene secuencias coincidentes con el sitio de unión miogénico, se utilizó como control negativo de secuencia, tal como se esperaba; miogénico no se unió al promotor del interferón gamma en ninguna de las muestras de tejido analizadas.

Los resultados indican que Myogenic se une al promotor Myogenic en los somitas de embriones de E 8.5 y E 9.5, ya que myo Genin se expresa específicamente en los somitas en estas etapas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y preparar embriones de ratón de EA 0.5 para la precipitación de cromatina, un ensayo que permitirá identificar factores reguladores asociados a genes específicos de tejidos en tejidos en desarrollo.