Generación de las células troncales nerviosas de desechados Humanos tejido cortical fetal

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre neurales humanas a partir de tejido cortical frontal descartado. Esto se logra primero preparando de antemano las soluciones y materiales antes de diseccionar cerebros fetales humanos. A continuación, se lleva a cabo el mantenimiento de las células madre neurales aisladas, incluyendo su posterior expansión, caracterización y experimentación.

El almacenamiento a largo plazo es factible, al igual que el establecimiento de subcultivos para la diferenciación de progenitores en tipos celulares neuronales y gliales. En última instancia, se puede caracterizar la diferenciación de células del SNC normal y compararla con la de células derivadas del SNC con trastornos neurológicos conocidos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento o diagnóstico de cualquier trastorno del SNC humano.

La técnica proporciona una plataforma sencilla y confiable para evaluar el S patológico y evaluar la eficacia farmacológica de nuevos fármacos para un trastorno determinado. Debido al valor excepcional de las células pluripotentes, todos los materiales deben estar preparados con anticipación antes de comenzar el protocolo. Para minimizar el riesgo de comprometer las muestras, se han preparado el medio de disección refrigerado, el baño de medio calentado a 37 grados Celsius para el cultivo, el medio y las células refrigeradas, y el medio de congelación para almacenamiento a largo plazo.

Crioconservación para la disección: tenga listas pinzas estériles autoclavadas y hojas de bisturí con mangos para la disociación celular. Tenga listo un pipeteador, pipetas de transferencia de 10 mililitros y un filtro celular de 40 micrómetros. Prepare y aparte varios platos de cultivo de 10 centímetros para la disección.

Tubos centrífugos de 50 mililitros para la disociación. Tubos centrífugos de 1,5 mililitros para almacenamiento de tejido y viales congelados para congelar células para garantizar el éxito. Es necesario obtener tejido viable de 18 a 22 semanas de edad dentro de las dos horas siguientes a su disponibilidad.

Idealmente, se puede obtener tejido fetal en cuestión de minutos tras su disponibilidad, realizando arreglos para recolectarlo tras procedimientos electivos. Los tejidos a menudo están fragmentados; sin embargo, una porción significativa del cerebro permanece intacta. Recolecte el cerebro en una placa de Petri de 10 mililitros llena con medio de disección frío con hielo.

Identifique las diferentes partes de la corteza mediante referencias anatómicas. Los límites de las cortezas frontal y occipital parietal se orientan según la intersección extrapolada del surco central y la fisura de Silvio. Diseque el tejido de la corteza frontal anterior al surco central y a lo largo del borde de la fisura silviana con hojas quirúrgicas.

Asegúrese de mantener el ventrículo intacto y sin daños. Ahora, elimine cualquier resto de sangre y meninges del bloque separado de corteza frontal. Si la muestra no está demasiado fragmentada y es suficientemente grande, seccione el bloque en varias muestras más pequeñas para guardar algo para histología y ensayos de proteínas o de ARNm.

Ahora transfiera un bloque de cerebro a un tubo cónico de 50 mililitros y añada un volumen tres veces mayor de medio de disección frío con hielo. Utilizando una pipeta, disocie suavemente el tejido hasta que todos los tejidos se fragmenten. Para suspender completamente las células, filtre a través de un filtro celular de 40 micrómetros.

Ahora, centrifugue la suspensión celular y resuspenda el sedimento celular en 10 mililitros de medio de cultivo fresco y tibio. Utilizando un hemocitómetro, cuente el número de células y calcule el volumen correspondiente a 2 millones de células. A continuación, transfiera cada volumen de 2 millones de células a un frasco de cultivo de 25 centímetros cuadrados.

Preparado con cinco mililitros de medio de cultivo tibio. Mantenga las células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante una semana. Cambie la mitad del medio una vez por semana para cultivos más prolongados. Después de una a dos semanas en cultivo, generalmente se forman neuroesferas con un diámetro de CNE entre 200 y 400 micrones.

Para disociar las neuroesferas en células individuales, incube las células con EDTA en medio de Hank durante 15 minutos. Para preparar las células en suspensión para el subcultivo, centrifúgelas, lávese con Hank y resuspenda las células en medio de cultivo tibio.

Para iniciar la diferenciación, siembre las células disociadas sobre cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina y laminina a una densidad de 100.000 células por cubreobjeto y incube durante 30 minutos. Las células pueden diferenciarse fácilmente en oligodendrocitos, neuronas o astrocitos.

Para la diferenciación neuronal, mantenga las células en medio con B 27 durante siete días. Para la diferenciación de astrocitos, cultive las células en medio con suero bovino fetal (FBS) durante siete días. Para la diferenciación de oligodendrocitos, mantenga las células en medio modificado con factores de crecimiento durante dos días y, después de dos días, utilice el mismo medio modificado sin los factores de crecimiento durante otros cinco días para almacenar las células madre.

Después de centrifugar las suspensiones de células disociadas, resuspenda las células en medio de congelación a una concentración de 10 millones de células por vial. Por mililitro, congele lentamente las células a menos 20 grados Celsius antes de almacenarlas a menos 80 grados Celsius para conservación a largo plazo. Transfiera las muestras a nitrógeno líquido.

Luego, las células se descongelan rápidamente en un baño de agua a 37 grados Celsius y se resuspenden. En D-M-E-M-F 12 calentado más suero al 10 % para un lavado. Las células calentadas se centrifugan luego, se aspiran y se resuspenden en el medio de cultivo calentado.

Células madre neurales medianas de un feto normal. A las 18 semanas de edad gestacional, se cultivaron para formar neuroesferas, las cuales fueron transfectadas con GFP. Las neuroesferas se diferenciaron para generar varios tipos celulares que luego se fijaron y tiñeron con marcadores celulares y rumina.

Se observa pluripotencialidad con la expresión de marcadores indicativos de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar, expandir y manipular células madre neurales humanas a partir de tejido cortical frontal descartado. Esta región ofrece una oportunidad única para estudiar las enfermedades del entorno cortical humano y probar la eficacia potencial de agentes farmacoterapéuticos.