ampliPHOX colorimétrico de detección de un microarray de ADN para la influenza

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar un nuevo y rápido método de amplificación de señal para detectar y caracterizar los subtipos virales de influenza en la plataforma de microarrays de baja densidad con chip de gripe. Esto se logra mediante la incorporación de DTP biotiniladas y el uso de cebadores con un extremo de fosfol de cinco primos para amplificar el segmento del gen de la matriz y un segmento de gen no estructural de los extractos de ARN de la influenza. A la PCR le sigue la digestión enzimática y la fragmentación para generar un producto viral biotinilado y amplificado de cadena simple corta, que luego se hibrida en la matriz después de la hibridación.

La detección de zorros utiliza la fotopolimerización para desarrollar grandes manchas de polímeros donde se produce la hibridación, y los patrones de hibridación diferencial se utilizan para detectar subtipos virales de influenza. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la detección de fluorescencia estándar, es que es bastante económica y proporciona un resultado rápido visible a simple vista con una sensibilidad analítica similar a la fluorescencia. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la caracterización de los virus de la influenza utilizando el chip de la gripe, ya que es un método de detección universal.

Ampl Fox también se puede aplicar a una amplia variedad de otros sistemas, como otros microarrays de baja densidad basados en ADN y proteínas. En teoría, cualquier producto biotinilado debería poder ser detectado con amox. Amber Taylor, científica asociada, y Kevin Moulton, asistente de investigación aquí en Endeavor, quienes han sido fundamentales en el desarrollo del instrumento Fox y la química de detección en los últimos años, demostrarán el procedimiento.

Extraiga el ARN viral de 200 microlitros de aislado viral utilizando un kit de extracción de ARN viral y el protocolo del fabricante. Eluir 60 microlitros de volumen final y almacenar los extractos a menos 70 grados Celsius o menos para su uso posterior. A continuación, prepare la mezcla maestra R-T-P-C-R en ICE según el protocolo del fabricante.

Usando una mezcla de DNTP BIOTINILADA, agregue la mezcla de cebador para chips de gripe, que contiene las concentraciones que se muestran en la mezcla maestra. Un cebador de cada juego debe contener un grupo fosfol de cinco aceites principales para facilitar la digestión enzimática. El juego de cebadores para la gripe A produce un producto de par de bases 1032, y el juego de cebadores para la gripe B produce un producto de par de bases 811.

Realice un vórtice breve y distribuya 18 microlitros de mezcla maestra en tubos de PCR de pared delgada. A continuación, añada dos microlitros de molde de ARN a cada tubo de reacción. Transfiera los tubos de PCR a un termociclador y utilice un perfil de ciclo con una temperatura de arrodillamiento adecuada.

Aquí se muestra el perfil de ciclo utilizado en este ensayo. Prepare la mezcla de digestión enzimática combinando 2,2 microlitros del tampón de reacción enzimática, 0,8 microlitros de agua libre de nucleasas y 1,0 microlitros de enzima lambda exonucleasa por reacción de PCR. Retire las muestras del termociclador y agregue cuatro microlitros a cada tubo de PCR.

Regrese las muestras al termociclador y programe el termociclador como se muestra a 37 grados Celsius durante 15 minutos, seguido de 95 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, aplique pozos de hibridación de un solo uso alrededor de los microarrays a hibridar. A continuación, lave los portaobjetos en 110 mililitros de agua purificada en un agitador orbital durante cinco minutos.

Seque los portaobjetos tocando suavemente el borde del pocillo con una toallita de papel. Combine 22 microlitros de dos tampones de hibridación con cada uno de los productos de ADN monocatenario fragmentados mezclados brevemente y pipetee 40 microlitros en los pocillos de microarray. Deje que los portaobjetos se hibriden durante una hora en una cámara de humedad después de la hibridación, retire los portaobjetos de la cámara de humedad y enjuague brevemente cada portaobjetos con dos mililitros de tampón de lavado D. Coloque los portaobjetos en una rejilla de portaobjetos.

A continuación, añada 110 mililitros de tampones de lavado A y B para separar los recipientes con un agitador orbital. Lave la rejilla deslizante en el tampón A a 60 a 90 RPM, la velocidad utilizada para todos los lavados posteriores durante un minuto. A continuación, retire la rejilla de portaobjetos del tampón de lavado A y enjuague brevemente con el tampón de lavado D.Transfiera la rejilla de portaobjetos al tampón de lavado B y lave en el agitador orbital durante cinco minutos.

Después del lavado, seque suavemente las matrices de cada portaobjetos con una toallita de papel y coloque los portaobjetos secos en la cámara de humedad. En preparación para los pasos de detección métrica de color zorro, combine 10 microlitros de amplitud, 20 microlitros de dos tampones de amplitud y 10 microlitros de agua purificada para cada matriz que se procese, transfiera 40 microlitros de mezcla de etiquetas a cada matriz y permita que la reacción de etiquetado continúe en una cámara de humedad cerrada Durante cinco minutos Durante la hibridación, prepare 110 mililitros de tampón de lavado C en un recipiente. Después del etiquetado, enjuague inmediatamente cada matriz con tampón de lavado D. Coloque cada portaobjetos en la rejilla de portaobjetos y lave y lave el tampón C en el agitador orbital durante cinco minutos después del lavado de mar con tampón, sumerja brevemente la rejilla de portaobjetos tres veces en un recipiente con agua purificada.

Para eliminar los residuos de sal, seque las matrices como se muestra anteriormente. Guarde las matrices en una caja de diapositivas oscura hasta la activación de la foto y la toma de imágenes, que deben completarse en 24 horas. A continuación, encienda el lector Amli Fox y asegúrese de que el software Amli view esté listo para la activación de fotos antes de la detección de muestras de matriz.

En primer lugar, determine el tiempo óptimo de fotoactivación para todas las muestras siguiendo un breve procedimiento de calibración. Una vez por uso diario, luego caliente la solución Amplify a temperatura ambiente y vórtice brevemente para mezclar pipetea tres microlitros de amplify enhancer en el vial de amplify y el vórtice completamente. Durante 10 segundos, aplique uniformemente 40 microlitros de solución Amplify en un solo portaobjetos a la vez, asegurándose de que no haya burbujas.

Inserte el portaobjetos de microarray en la bahía de fotoactivación del Amplify Reader. Inicie la activación de la foto seleccionando, inicie en el software PL view utilizando el tiempo de activación de la foto determinado en el proceso de calibración. Una vez completado, enjuague el microarray con dos mililitros de agua purificada para eliminar el exceso de amplificación de la formación de polímeros claros que ahora se han producido en los puntos que contienen ADN objetivo, pero se visualiza mejor.

Después de teñir, deje que las manchas de polímero se sequen durante dos minutos. A continuación, distribuya dos gotas de abundante rojo sobre la matriz y deje que la tinción continúe durante dos minutos. Después de teñir, enjuague rápidamente el portaobjetos con agua purificada y séquelo como se muestra anteriormente, inserte el portaobjetos en la bahía de imágenes del lector Amli Fox para recopilar una imagen utilizando el software amli para procesar los resultados. La imagen de la izquierda muestra la detección de un espécimen de la novela H one N one de 2009 de Amli Fox.

Si bien la imagen de la derecha utiliza fluorescencia tradicional generada por un escáner de microarrays de fluorescencia confocal, el mismo patrón de detección general se puede ver fácilmente para ambos métodos. Sin embargo, el resultado del zorro Amli es visible a simple vista. Estas imágenes muestran los resultados de un chip de influenza de origen humano, H tres N dos de origen humano, H uno N uno, origen porcino, H uno N uno y una matriz de zorros negativa que carece de influenza detectable.

Las secuencias dos y tres delineadas en azul producen una señal para toda la gripe. Se muestran subtipos A, pero las secuencias delineadas en rojo en la parte inferior derecha solo producen señal para el origen porcino, H uno N un espécimen. La muestra negativa muestra una señal en una secuencia de control interno delineada en verde, lo que indica que no hay inhibición o falla de la reacción R-T-P-C-R.

Una vez dominado, todo el proceso, desde la extracción en vial hasta la detección de amox y la interpretación del resultado final, se puede realizar en aproximadamente seis horas. La parte del procedimiento de detección de Ampl Fox, incluida la calibración del instrumento, se puede completar en aproximadamente 30 minutos siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación parcial o completa del genoma, para responder a preguntas adicionales.

Este ensayo de detección de la influenza está destinado a ser una prueba de detección inicial, particularmente para muestras que dan como resultado un patrón de hibridación único. Debido a que la detección es un ensayo general, esperamos que los investigadores encuentren nuevas e interesantes aplicaciones de microarrays de baja densidad para las que la detección podría agregar valor.