Caracterización de los aislados y ventilados, y pulmón de ratón instrumentado perfundidos con flujo pulsátil

Estudiar las relaciones de flujo de presión pulmonar pulsátil. Este protocolo explica cómo aislar, ventilar y perfundir pulmones de ratón. La tráquea se expone quirúrgicamente para la ventilación.

Luego, se aíslan el corazón y los pulmones para poder canular la arteria pulmonar y la aurícula izquierda. A continuación, se perfunde el sistema pulmonar. Los experimentos se realizan alterando el flujo de la arteria pulmonar, la magnitud, la forma de onda y/o la frecuencia.

Las formas de onda de presión de la arteria pulmonar y de la aurícula izquierda resultantes se registran y demuestran las relaciones de flujo de presión pulmonar pulsátil. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las preparaciones in vivo, es que cambia en las relaciones de flujo de presión. Las relaciones de flujo de presión pulsátil se pueden obtener en ausencia de cambios en el estado del volumen, el tono del sistema nervioso simpático, la actividad y los efectos de la anestesia.

Además, la mayoría de las preparaciones pulmonares aisladas miden solo las relaciones de flujo de presión constante, mientras que nuestra técnica permite determinar las relaciones de flujo de presión pulsátil. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología pulmonar, como por ejemplo, ¿cómo afecta la enfermedad vascular pulmonar a la hemodinámica pulmonar pulsátil o cómo afecta el endurecimiento de la arteria pulmonar grande a la poscarga del ventrículo derecho? La demostración visual de este método es fundamental, ya que exponer el corazón y los pulmones y asegurar la cánula en la arteria pulmonar es difícil de aprender.

El exceso de presión de la instrumentación puede causar edema en los pulmones y la colocación incorrecta de la cánula puede perforar la arteria pulmonar. Antes de comenzar el experimento, es necesario preparar el sistema IL one utilizado para ventilar y perfundir el pulmón aislado. El tubo debe estar conectado a los transductores de presión.

O bomba solitaria y medidor de flujo completamente Enjuague el sistema con agua destilada calentada a 37 grados centígrados y elimine las burbujas en la tubería. A continuación, cebe el tubo de la bomba Endur tech con 1%PBS. Ahora cero.

La presión para cada transductor P 75 cerrando primero su válvula al sistema IL one y abriendo su válvula a la atmósfera. A continuación, utilice el amplificador SIS de enchufe para poner a cero automáticamente la presión antes de preparar el animal, humidifique la configuración IO one sumergiendo la pieza cerámica porosa en agua destilada. Después de anestesiar al ratón, estabilícelo para la cirugía sujetando sus patas delanteras a la tabla de corcho.

Ahora rocíe el cofre con 95% de alcohol. Use pinzas rectas para agarrar la piel por el cuello y corte una abertura de un centímetro con las tijeras rectas. Una vez que el interior del cuello esté expuesto, corte el tejido glandular blanco en los músculos superficiales mientras busca el esófago y la tráquea.

Aísle el esófago y la tráquea del tejido a ambos lados y en la parte posterior y ate una sutura suelta alrededor de la tráquea. Para canular la tráquea, corte con cuidado una pequeña V en un lado de la misma con las tijeras pequeñas. Ahora lleve el ratón al sistema IL one con pinzas romas.

Agarre la cánula traqueal y deslícela dentro de la tráquea. Asegure la cánula con una sutura. Comience la ventilación con aire ambiental primero, rocíe el pecho con alcohol y retire la piel con pinzas y tijeras rectas.

Corta la piel hacia arriba a lo largo del esternón. Levanta la piel a cada lado y corta a lo largo de la línea de las costillas inferiores. Ahora agarre la apófisis xifoides con pinzas y use unas tijeras de punta esférica para cortar un agujero en el diafragma donde se une con la parte inferior del esternón.

Agarra el diafragma y córtalo de las costillas. Con unas tijeras con punta de bola, vuelva a sujetar la apófisis xifoides y utilice las tijeras con punta de bola para cortar cuidadosamente el esternón a través de las costillas sin dañar los pulmones, el corazón o los vasos sanguíneos. Para exponer el corazón, agarra las costillas izquierdas y córtale las puntas.

Ahora inyecte lentamente el ventrículo derecho con 0,1 mililitros de heparina Después de la inyección, corte el resto de las costillas. Use la parte posterior o el extremo redondeado de las pinzas para empujar suavemente los pulmones lejos de la costilla mientras corta las costillas con un microscopio. Extirpa el tejido glandular de la grasa que se encuentra en la parte superior del corazón.

Usa las pinzas para separar los pañuelos y recórtalos. Con las tijeras de resorte para colocar una sutura alrededor de la aorta y la arteria pulmonar, frote suavemente el corazón con unas pinzas desafiladas. Debería haber poca resistencia.

Ahora ate una sutura suelta con el doble tiro. A continuación, corta la parte inferior del abdomen. Use tijeras en ángulo para cortar las costillas y el lomo.

Esto hará que fluya una cantidad significativa de sangre. Use un hisopo para detener el flujo. Una vez que se detenga el flujo sanguíneo, prepare el sistema IL con cuatro mililitros de RPMI de una jeringa llena con 10 mililitros de RPMI.

Es bueno verificar que el tubo no contenga burbujas. Ahora canula el ventrículo derecho cortando una pequeña muesca cerca del ápice e insertando la cánula Apunte hacia abajo en la derecha para llegar a la arteria pulmonar. La punta de la sonda debe ser visible a través de la pared casi transparente de la arteria pulmonar.

A continuación, apriete la sutura alrededor de la cánula, la aorta y la arteria pulmonar para canular el ventrículo izquierdo. Corta una muesca en el ápice e inserta la cánula apuntando hacia arriba en la aurícula izquierda. Es posible que se necesite una ligera presión para encontrar la válvula, pero una vez encontrada, la cánula se deslizará y estará segura sin una sutura.

Infunda manualmente RPMI de la jeringa de 10 mililitros a 0,3 mililitros por minuto hasta que vea flujo en el tubo de salida. Si no hay flujo en el tubo de salida, vuelva a colocar la cánula del ventrículo izquierdo. Sin embargo, si no hay flujo en los pulmones, aborta el experimento porque es probable que la arteria pulmonar tenga una fuga.

Ahora que el corazón está completamente canulado, conecte la jeringa de 60 mililitros al sistema IL one. Usando la bomba de flujo constante e infundir el RPMI Perfuse ocho a una velocidad de un mililitro por minuto. Compruebe si hay fugas durante la perfusión inicial.

Perfunda gradualmente los pulmones durante otros dos minutos, durante los cuales los pulmones se volverán blancos. Para estudios de flujo pulsátil. Primero ajuste el desplazamiento del pistón de la bomba solitaria a los niveles deseados.

A continuación, ajuste el caudal constante. Ahora abra la válvula de la bomba osli y comience a registrar datos justo antes de ejecutar el perfil de flujo osli. Una vez que haya terminado, abra el archivo de salida de datos y trace el flujo experimental en función de los flujos experimentales de la prueba inicial.

Ajuste el desplazamiento del pistón de la bomba oscilatoria a cada frecuencia para que Q max sea el deseado. Mantenga la ventilación a una presión constante Durante la recopilación de datos para las pruebas de flujo constante, cierre la válvula de la bomba solitaria y ajuste el caudal constante al nivel deseado. Comience a registrar datos y recorra el protocolo de flujo constante.

Recopilación de datos durante al menos 10 segundos en cada caudal entre ensayos. Restablezca el caudal a 0,5 mililitros por minuto. Asegúrese de mantener la ventilación a una presión constante durante la recopilación de datos.

Si se desea realizar pruebas de presión auricular izquierda cero, retire el tubo de salida mientras realiza las pruebas. Esté atento a la RPMI en el tubo de las vías respiratorias. No se debe permitir que la RPMI llegue a los transductores de presión de las vías respiratorias o se dañarán.

Estos son los resultados de la perfusión de flujo constante con flujo Q en la fila superior y las presiones resultantes de la arteria pulmonar y la aurícula izquierda en la segunda fila bajo una variedad de condiciones. En los dos primeros paneles, la presión de la aurícula izquierda aumentó y disminuyó con Q debido a que el tubo de salida estaba en su lugar, el primer panel muestra la presión del aire al final, la presión inspiratoria, y el segundo muestra la presión del aire al final de la presión espiratoria. A continuación, se retiró el tubo para que la presión de la aurícula izquierda fuera constante e independiente de Q. A continuación, se ajustó manualmente la altura del tubo de salida para que la presión de la aurícula izquierda fuera mayor.

Pero independientemente de Q de nuevo, el primer panel muestra la presión del aire en el extremo, la presión inspiratoria, y el segundo muestra la presión del aire en el extremo. Presión espiratoria. Las relaciones de flujo de presión constante de la arteria pulmonar resultantes para cada caso se pueden obtener trazando la presión frente al flujo.

Estos son los resultados de la perfusión de flujo pulsátil con flujo Q en el panel superior y las presiones resultantes de la arteria pulmonar, la aurícula izquierda y el aire. En el panel inferior. A partir de estas relaciones de flujo de presión pulmonar pulsátil, se puede calcular la impedancia vascular pulmonar, que refleja la poscarga total del ventrículo derecho.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en 20 a 30 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante que se tome su tiempo y se relaje para que sus manos estén firmes. Una vez que los pulmones están adecuadamente perfundidos, la parte difícil ha terminado.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como la histología o los ensayos bioquímicos en el tejido pulmonar, para responder a preguntas adicionales, como qué mecanismos moleculares son responsables de los cambios observados en las relaciones de flujo de presión pulsátil pulmonar. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología pulmonar exploren el papel de genes y proteínas específicos en el desarrollo y la progresión de la enfermedad vascular pulmonar utilizando ratones modificados genéticamente.