Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

En este video, se describe un método para obtener imágenes de células vivas de la división asimétrica sensorial células progenitoras de órganos y células de la epidermis intacta en

El objetivo general de este procedimiento es preparar a Driss Pupi para la obtención de imágenes de células vivas de progenitores de órganos sensoriales torácicos en división o células SOP durante la metamorfosis. Esto se logra configurando primero el cruce genético apropiado para obtener puy de progenie para la obtención de imágenes de células vivas. El segundo paso del procedimiento es recolectar oph puy en la etapa apropiada para visualizar las células progenitoras neurales que se dividen asimétricamente.

El tercer paso del procedimiento es retirar la carcasa de la pupila para montar la pupa para la obtención de imágenes. El paso final del procedimiento es montar la pupa entre el portaobjetos y el cubreobjetos y proceder a la obtención de imágenes de células vivas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la dinámica de las proteínas marcadas con fluorescencia durante la división celular asimétrica y la diferenciación de células de órganos sensoriales de tipo salvaje o mutantes a través de epifluorescencia o microscopía confocal.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la inmunohistoquímica, es que la dinámica de las proteínas se puede seguir en tiempo real y en el transcurso de varias horas en una pipa intacta desde el ancho de la línea gal four deseada y la proteína de fusión marcada con GFP. Bajo el control de UAS, identifique los puy que han sido sometidos a una hora. Estos puys poseerán una morfología característica de la pupila pero carecerán de pigmentación.

El puy seleccionado se puede transferir a una lima nueva o se puede marcar en la lima cruzada para recordar cuáles eran blancos. 18 horas más tarde, cuando el puy alcance la etapa adecuada, coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de microscopio y adhiera el estuche de la pupila al portaobjetos con el lado ventral hacia abajo debajo del microscopio de disección. Identifique y agarre el borde de la URM con un par de pinzas y levántelo suavemente, revelando la cabeza de la mosca inmadura.

Teniendo cuidado de no perforar el cuerpo de la mosca. Rasgue suavemente el costado de la caja de la pupila y retírela por completo para revelar el tórax y la porción anterior del abdomen. Continúe rasgando con cuidado el mismo lado hacia la parte posterior y tire de la carcasa de la pupila hacia el lado opuesto y péguela a la cinta.

Ahora que el abdomen está completamente expuesto, empuja suavemente un cepillo de cerdas suaves debajo de la cabeza de la pupa y levántalo del resto de la caja de la pupila. Coloque la pupa en un portaobjetos de microscopio con el lado dorsal hacia arriba Coloque la pupa en un ángulo de 45 grados para que el cubreobjetos toque la región de las células SOP torácicas. Primero, haz un marco cuadrado de 18 por 18 milímetros con papel de filtro watman cortando una ventana de 10 por 10 milímetros en el centro.

Sumerge el marco en agua hasta que esté saturado y luego colócalo alrededor de la pupa. Use una jeringa de cinco cc para aplicar una capa uniforme de grasa de silicona alrededor del marco, de modo que el grosor de la capa sea solo un poco mayor que el diámetro de la pupila. Pipetee aproximadamente un microlitro de agua en el centro de un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros y coloque el cubreobjetos de manera que la gota toque la pupila nodom.

Presione suavemente para formar un sello completo y una superficie plana contra la pupa. Ahora que la pupa viva ha sido montada, se pueden obtener imágenes mediante microscopía confocal combinando las técnicas de disección y montaje. Con las imágenes en vivo, se puede visualizar la acumulación de la proteína de fusión GFP de actina en el surco de escisión de una célula SOP mitótica.

Con el tiempo, la distribución de los socios de Num RFP y RAB 5G FP se puede comparar entre dos celdas hijas SOP. Tenga en cuenta que mientras que el socio de NUM RFP se distribuye asimétricamente, RAB 5G FP se distribuye por igual en ambas celdas en las últimas etapas de la pupila. Los órganos sensoriales externos diferenciados se pueden visualizar, los alvéolos menos sensoriales y los pelos exhiben autofluorescencia y se muestran aquí superpuestos con L-G-L-G-F-P expresado en un subconjunto de células SOP.

Uso del sistema Markem Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 10 minutos si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica para responder a preguntas adicionales como la identificación de sulfatos de células de órganos sensoriales con marcadores de anticuerpos específicos o el estudio de colocalización de proteínas de fusión de GFP con proteínas endógenas.