En vivo láser axotomía en C. elegans

El objetivo general de este procedimiento es cortar con precisión las neuronas del CL con un láser in vivo. Esto se logra ensamblando el sistema de taxotomía y enfocando, alineando y ajustando con precisión la potencia del láser. Cuando los gusanos están inmovilizados en una placa de microscopio, sus neuronas pueden ser seccionadas con control espacial y temporal preciso.

El grado en que los neuronas seccionados se regeneran se mide entonces mediante la puntuación de conos de crecimiento o mediante el trazado de las longitudes de los neuritos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el láser de femtosegundo es que el láser de pulso puntual microscópico es un sistema rentable, fácil de configurar y mantener, y adaptable fácilmente a una amplia variedad de aplicaciones, aunque normalmente aplicamos este método para estudiar la regeneración de las neuronas motoras GABA. El sistema también puede utilizarse para ablacionar otros tipos celulares, como la piel, el músculo o sinapsis neuronales específicas.

Este método requiere un sistema láser de micro punta. El láser se monta en el puerto de fluorescencia epiescopia de un microscopio compuesto e incluye un divisor dicróico único que coincide con el fluoróforo en las células que se van a cortar, un generador de pulsos y un pedal para operar el láser. Como mínimo, el microscopio debe estar equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 100 aumentos y 1,4 de apertura numérica y un objetivo de cuatro aumentos.

Debe contar con una platina motorizada con operación mediante joystick y estar montada sobre una mesa de aire para la iluminación. Una fuente de luz con guía de luz y un mecanismo de obturación está conectada al láser de micro punto. El mecanismo de obturación es útil para reducir la intensidad de iluminación independientemente del láser.

Una cámara que esté conectada a una computadora requiere una frecuencia de cuadros de al menos 16 hercios y debe funcionar bien con poca luz. La computadora requiere un software de imagen como Nikon Elements para visualizar las neuronas, controlar la cámara y manipular la platina motorizada. Una vez completamente montado, el usuario puede enfocar el microscopio con una mano, mover la platina con la otra, activar el láser con el pedal de pie y tener una vista clara de la imagen en pantalla.

Cortar neuronas en un organismo del tamaño de un grano de arena puede ser difícil. Para lograrlo, el láser debe enfocarse estrechamente en las tres dimensiones. Comience enfocando el plano Z.

Introduzca el filtro de densidad neutra ND 16 para atenuar el láser durante el enfoque, lo que permite un enfoque más preciso, insertando tanto el ND 16 como los cuatro filtros fluorescentes. A continuación, configure el láser de punto micro en un pulso mediante el interruptor de selección, y luego mueva la rueda de filtros hasta el filtro de paso largo adecuado. Ahora coloque un portaobjetos con espejo en la platina y enfoque los orificios dentro de él utilizando el objetivo de cuatro aumentos y luz transmitida.

Una vez enfocado, agregue una gota de aceite de inmersión a la preparación y vuelva a enfocar los orificios con el objetivo de 100 aumentos. Luego, use la palanca de conmutación del trayecto óptico para abrir el obturador de la cámara y abra el obturador del láser. Si resulta difícil obtener un enfoque preciso, reduzca la intensidad de la luz transmitida para que los bordes del orificio sean nítidos.

Para probar el enfoque, use el pedal de control para disparar el láser. Si el plano Z está correctamente enfocado, debería aparecer un pequeño orificio en el espejo. Ahora enfoque ligeramente el microscopio por encima del plano del portaobjetos reflectante y dispare el láser nuevamente.

Esto debería generar un orificio aún más pequeño que el del primer disparo o no dejar ninguna marca en absoluto. Se deberían observar los mismos resultados al enfocar por debajo de la lámina reflectante. Sin embargo, si se produce un orificio más grande, vuelva a enfocar el láser utilizando el anillo de enfoque en la cabeza de ablación.

Finalmente, verifique que el orificio siga alineado correctamente con las líneas cruzadas en el ocular. Con un uso consistente, rara vez es necesario ajustar el enfoque en el plano Z. Para enfocar el láser en el plano XY, haga otro orificio en el espejo y luego acceda al software en Nikon Elements.

Inicie el modo de captura en vivo en el menú de adquisición. En la barra de herramientas de medición, seleccione el editor de ROI, elija la herramienta de doble cruz y arrastre los hilos cruzados para alinearlos con el centro del nuevo orificio. Haga clic en guardar ROI y luego salga del editor para reanudar la captura en vivo.

Para manipular la platina con el ratón, active la configuración de mouse XY. Ahora el láser está enfocado. Restablezca los filtros de densidad neutra a su posición original y configure los pulsos del láser de uno a 10 para uso futuro.

Primero, prepare una solución de 3% de aros fundido en solución M nueve y transfiera aproximadamente cinco mililitros a un tubo de 50 mililitros. Coloque el tubo en un baño de agua a 55-65 grados Celsius y guarde el resto para uso futuro. Ahora use dos portaobjetos cubiertos con etiquetado.

Colete un par de portaobjetos limpios y una gota de agarosa para hacer una almohadilla donde se puedan colocar los gusanos. Después de 30 segundos, cuando el agarosa haya solidificado, pipetee de tres a cinco microlitros de microesferas de poliestireno de 0,05 a 0,1 micrómetros sobre la almohadilla dentro de los 10 minutos y coloque rápidamente de cinco a diez gusanos transgénicos sobre las microesferas con una aguja de platino, de modo que sus neuronas marcadas sean fácilmente visibles. Para evitar dañar los gusanos, coloque cuidadosamente una cubreobjetos estándar sobre ellos.

Deslizándolo alrededor. La preparación del portaobjetos con gusanos ya está lista para realizar taxonomías. Mediante el ocular, localice los gusanos con un aumento de cuatro veces, vuelva a enfocar con el objetivo de 100 aumentos, apague la luz transmitida, encienda la fluorescencia y cambie la trayectoria óptica hacia la cámara.

Use el ratón para centrar la neurona en las cruces. Ahora active el láser con el pedal. La cantidad adecuada de potencia del láser seccionará la neurona en uno o dos pulsos.

Demasiada potencia láser causará daño periférico o perforará un agujero en el gusano; para ajustar la potencia del láser, mueva la placa atenuadora. Si el láser se debilita, se puede ajustar la posición de la placa atenuadora para mantener el corte. Sin embargo, esto probablemente indique que el Kumar en cuatro 40 en la celda D del láser necesita ser reemplazado cuando se realiza correctamente.

La taxotomía con láser produce una pequeña ruptura en la neurona. En ciertos casos, puede formarse una pequeña cicatriz alrededor del sitio de la lesión. Prácticamente entre una y tres neuronas son cortadas por animal, pero no existe un límite teórico.

Una vez finalizado, recupere los gusanos retirando la cubeta con un movimiento directo hacia arriba, teniendo cuidado de que los gusanos permanezcan sobre la almohadilla de agarosa. No deslice la cubeta. Utilice pinzas de punta fina para cortar la almohadilla alrededor de los gusanos.

Coloque la almohadilla sobre una placa de NGM recién sembrada que contenga OP50 y libere los gusanos con 10 microlitros de M nueve estéril. Entre ocho y 48 horas después, se puede evaluar la regeneración tras la exotomía; para ello, vuelva a montar los gusanos sanos en tres a cinco microlitros de microesferas de poliestireno y visualice sus neuronas en neuronas seccionadas. Un muñón neuronal distal al sitio de corte permanecerá. Tanto los muñones distal como proximal se retraen inicialmente tras el corte, pero se espera que la regeneración ocurra a partir del muñón proximal.

La regeneración puede evaluarse según la formación de un cono de crecimiento. Alternativamente, puede trazarse y compararse la longitud de los neuritas, siendo típico que entre el 60 y el 70 % de las neuronas GABA formen conos de crecimiento dentro de las 24 horas posteriores al corte. Si el láser no está cortando adecuadamente, es probable que sea porque el láser está desenfocado o porque el colorante en la celda de colorante necesita ser reemplazado.

Además, si observa que los gusanos se están moviendo, probablemente se deba a que la almohadilla de agarosa está demasiado húmeda. Hemos encontrado que es necesario dejar las almohadillas durante aproximadamente 30 segundos antes de colocar los gusanos sobre ellas para evitar este problema. Asimismo, puede intentar usar microesferas de menor tamaño para inmovilizar a los gusanos.

Por último, si observa que los axones tienen un aspecto engrosado, es probable porque la almohadilla de agros está demasiado seca. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar el sistema láser de micro-punto. Monte gusanos para taxotomía, corte neuronas individuales y evalúe la regeneración subsiguiente.