Name: Imágenes en vivo del calcio celular combinado con el silenciamiento de genes mediada por siRNA Identifica Ca 2 + Canales de fugas en la membrana del ER y sus mecanismos de regulación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Aprende a identificar canales de fuga de Ca²⁺ en el retículo endoplásmico mediante silenciamiento de genes con siRNA e imágenes de calcio en vivo. Este método revela mecanismos reguladores clave en células HeLa.

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SL fue apoyado por una beca de la DFG (Escuela de Posgrado de Investigación 845). Este trabajo fue apoyado por becas de la DFG (SFB y 530/C1 PARA 967) y por HOMFOR.

1. Preparación de soluciones madre <ol><li> Prepare libre de calcio tampón (140 mM NaCl, 5 KCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM EGTA, 10 mM de glucosa en 10 mM HEPES-KOH (pH 7,35)). </li><li> Solubilizar FURA-2 de la mañana en DMSO para obtener una solución 1 mM. Mezclar con un agitar hasta que la solución es homogénea de color amarillo claro. Proteger a la taza de la luz. Diluir la FURA-02 a.m. solución madre en 1 ml Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS) y el 1% penicilina / estreptomicina a una concentración final de 4 M para la carga de las células HeLa. </li><li> Preparar un 12,5 puromicina mM solución madre en agua destilada (pH 7,0). Alícuotas de almacenar a -20 ° C. Diluir el 12,5 puromicina mM solución madre en el buffer libre de calcio a una concentración final de puromicina M 500. </li><li> Disolver thapsigargin en DMSO para obtener una solución 1 mM de archivo. </li><li> Solubilizar 1 mg ophiobolin A en 20 l de cloroformo y, posteriormente, se mezclan con 25 l de DMSO. El tubo de microcentrífuga permanece abierta hasta que el cloroformo se evapora. Así, el final de ophiobolin una concentración de 100 mm. Alícuotas de almacenar a -20 ° C. Antes de su uso, las soluciones diluidas de valores en calcio sin buffer a una concentración final de 100 mM. Por lo tanto, la concentración final de DMSO de imágenes de células vivas no exceda del 0,1%. </li><li> Disolver la trifluoperazina en DMSO a una concentración de 10 mM y alícuotas almacenar a -20 ° C. Las soluciones diluidas de valores en calcio sin buffer a una concentración final de 10 mM antes de su uso. Así, la concentración final de DMSO de imágenes de células vivas, como por ophiobolin A, no supere el 0,1%. </li><li> Disolver el siRNAs (siRNA SEC61A1, siRNA SEC61A1-UTR y el control de siRNA) en RNasa libre de agua para preparar una solución 20 M de acciones. Mezclar con un vórtice y observar la solubilización de los ojos. Almacenar 50 alícuotas a -20 ° C. </li></ol> 2. El silenciamiento de genes en las células HeLa Con el fin de estudiar la contribución de una determinada proteína de ER Ca 2 + flujo de salida, el gen respectivo tiene que ser eficiente callar con dos diferentes siRNAs (Fig. 1). Además, el efecto de silenciar tiene que ser superada por la expresión del gen de tipo salvaje respectivo. Normalmente usamos siRNAs que se dirigen contra la codificación y la región no codificante (UTR), respectivamente, del gen de interés. El empleo de UTR-dirigido siRNA proporciona una manera conveniente para la complementación. <ol><li> Semillas de 5,2 x 10 5 células HeLa (ATCC no. CCL-2) en una placa de cultivo de 6 cm con una hoja de 25 mm de la cubierta (pre-tratados con 200 l de ácido poli-L-lisina (1 mg / ml) durante 1 h) en Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (SFB) y 1% de penicilina / estreptomicina y se incuba a 37 ° C en un ambiente humidificado con un 5% de CO 2 (volumen final 3,9 ml). </li><li> Transfectar las células con SEC61A1 siRNA, siRNA SEC61A1-UTR, o siRNA control negativo utilizando el reactivo HiPerFect de acuerdo a las instrucciones del fabricante (concentración final de siRNA: 20 nM). En pocas palabras, preparar siRNAs recién en un tubo de microcentrífuga separados antes de la actual procedimiento de transfección: Añadir 20 l de reactivo de transfección HiPerFect a 4 l de cada siRNA (20 M) que se disuelve en 80 l de OptiMEM. Esta mezcla se agita y suavemente se incuban a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir la mezcla de siRNA (104 l) gota a gota a la cabeza de serie 5,2 x 10 5 células HeLa (3,9 ml). </li><li> Después de 24 h, el cambio del medio (3,9 ml) y transfectar las células por segunda vez con la mezcla de siRNA mismo (104 l). </li><li> Evaluar el silenciamiento por Western blot. Debe estar por encima del 80%. Lavar las células de la placa de cultivo de células en tampón fosfato salino (PBS) y la cosecha en DMEM. Contar las células mediante el empleo de la lucha contra la condesa de células automatizado. Lisis de las células en tampón de lisis celular (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 mM MgCl 2, 0,5% NP40), complementado con un cóctel de inhibidores de la proteasa (3 mg / ml Pepstatin A, 3 mg / ml leupeptina, 3 mg / ml Antipain, 3 mg / ml Chymastatin) y mezclar con tampón SDS-muestra (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS 2%, glicerol al 10%, 5% β-mercaptoetanol, 0.01% azul de bromofenol ) para obtener una concentración final de 10.000 células / microlitro. Muestras de calor a 56 ° C durante 15 minutos y, posteriormente, añadir algunas perlas de vidrio y agitar durante 20 minutos a fragmentos de ADN. Separado de 20 l de cada muestra por un tipo de Laemmli SDS-PAGE (típicamente 15% de poliacrilamida para la separación de gel). Transferencia de las proteínas separadas a una membrana de PVDF mediante electrotransferencia ("wet-blot") a precios constantes de 400 mA durante 3 horas o toda la noche en tampón de transferencia (100 mM glicina, 12,5 mM Tris-HCl). A continuación, el bloque con un 5% (w / v) de leche baja en grasa seca en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego exponer la mancha con el anticuerpo primario contra el C-terminal de Sec61α de conejo y un anti-β-actina de anticuerpos de ratón. Lavar la mancha en PBS-TritonX-100 (0,05%) y tWICE en PBS durante 5 min, respectivamente. Visualizar los anticuerpos primarios utilizando ECL Plex de cabra anti-IgG de conejo-Cy5 o ECL Plex de cabra anti-IgG de ratón-Cy3-conjugado y el sistema de imágenes Typhoon Trio en combinación con el software Image Quant TL 7.0. En el caso del gen SEC61A1, el efecto silenciador máxima se ve típicamente 96 horas después de la transfección en primer lugar. Un representante experimento se muestra en la figura. 2. </li></ol> 3. Complementación de las células HeLa Con el fin de rescatar el fenotipo de SEC61A1 silenciamiento, la SEC61A1 cDNA se inserta en el sitio de clonación múltiple (MCS) de un sitio de entrada ribosomal interno-pCDNA3 (IRES)-GFP-vector que contenía el citomegalovirus (CMV), la MCS, el IRES, además de la proteína fluoresecent verde (GFP) la secuencia de codificación. <ol><li> 48 h después de la transfección de siRNA en primer lugar, el intercambio de la media (3,9 ml) por segunda vez y transformar las células con el vector vacío o SEC61A1 plásmido de expresión utilizando Fugene HD de acuerdo con el protocolo del fabricante (ratio final del vector a Fugene HD es de 4 mg vector a 16 l Fugene HD). En pocas palabras, preparar plásmidos recién en un tubo de microcentrífuga separados antes de que el procedimiento de transformación: Añadir 16 l de reactivo Fugene transformación HD a 4 mg de cada plásmido que se disuelve en 80 l de OptiMEM. Suavemente vórtice de esta mezcla e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir la mezcla de plásmidos (0,1 ml) gota a gota a la cabeza de serie 5,2 x 10 5 células HeLa (3,9 ml). </li><li> Después de 48 h de plásmido de expresión, platos sujetos a la cultura antes de la microscopía de fluorescencia de imágenes de calcio y la cosecha. Si es necesario reemplazar DMEM por PBS para mejorar las señales de fluorescencia. Grabar imágenes de fluorescencia en un microscopio de fluorescencia equipado con cámara CCD enfriado. La eficiencia de transformación se puede determinar al dividir el número de células que presentan fluorescencia de GFP por células contadas en el modo claro y debe estar por encima del 80%. Un resultado típico se muestra en la figura. 3. </li></ol> 4. Células vivas imágenes de calcio <ol><li> Antes de la medición, la transferencia de la hoja de la cubierta revestida con células HeLa transfectadas en una placa de cultivo separadas 3,5 cm. Las células de carga con 4 M FURA-2 de la mañana en 1 ml de DMEM durante 45 min a 25 ° C en la oscuridad 11,12. </li><li> Fijar una hoja de 25 mm de la cubierta de metal en la cámara mencionada anteriormente y lavar las células dos veces y se incuban en un tampón libre de calcio (cada vez que 300 l). </li><li> Empezar a recoger datos en un microscopio iMic con policromía V alternativamente excitante a 340 nm y 380 nm y medir la fluorescencia emitida a 510 nm (de filtros: divisor, 565 nm; emisor, 605/70 nm). Las imágenes de muestra que contiene 20 a 50 células / frame cada 3 s. Registro FURA-2 señales de que la relación F340/F380, F340 y F380 que corresponden a los antecedentes-resta intensidad de fluorescencia a 340 y 380 nm, respectivamente. </li><li> Después de 1 minuto, tratar las células con puromicina (500 M) en tampón libre de calcio o con el mismo tampón. Por otra parte, tratar las células con un inhibidor de molécula pequeña (como la trifluoperazina M 10 o 100 M ophibolin A) o con el tampón libre de calcio. </li><li> Después de las mediciones radiométrica se llevan a cabo de 2 a 10 minutos, añadir thapsigargin (1 M) y continuar con las mediciones. </li><li> Con el tiempo, cytoslic [Ca 2 +] se calcula a partir de mediciones relación con un método de calibración establecida. 2 Analizar los datos de Excel 2007 y origen 6.1. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Hasta ahora, hemos abordado la cuestión de si el silenciamiento del gen afecta SEC61A1 calcio (Ca 2 +) las fugas de la sala de emergencia (Fig. 1). El gen SEC61A1 fue silenciada por dos diferentes siRNAs en células HeLa durante 96 horas. Mientras que el silenciamiento de crecimiento apenas se ven afectados y la viabilidad celular, el transporte de proteínas en la sala de emergencias de semi-permeabilized células se inhibió casi completamente. Además, las células SEC61A1 silencio se vieron gravemente afectados con respecto a Ca 2 + de fuga de la sala de emergencias. El efecto de silenciamiento de los genes fue revocada por la expresión del gen SEC61A1. Por lo tanto, Sec61 complejos que están presentes en la membrana del ER de todas las células nucleadas forma canales de Ca 2 + de fugas que se puede esperar para jugar un papel fundamental en la homeostasis del Ca 2 +. Sin embargo, la presencia de grandes poros llenos de agua con la permeabilidad de iones de control, como formado por Sec61 complejos en la membrana del RE, seriamente interferir con la liberación regulada de Ca 2 + desde el lumen del RE en el citosol, un mecanismo esencial para intracelular señalización. Se identificó un calmodulina (CaM) motivo de unión en el citosol N-terminal de Sec61α mamíferos que la CAM consolidados, pero no de Ca 2 + libre apocalmodulin con afinidad nanomolar y especificidad de secuencia. A nivel celular, dos antagonistas de la CaM diferentes estimulado Ca (Figuras 4 y 5). Este último no se observó cuando Sec61 canales estaban presentes que contenían mutaciones en el motivo de IQ Sec61α. Por lo tanto, Ca 2 +-CAM está involucrado en la limitación de Ca 2 + de fuga de la sala de emergencia (Fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo. Ver texto para más detalles. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Análisis de los datos para silenciar la eficiencia. Silenciar fue evaluada mediante Western-blot utilizando anticuerpos que se dirige contra Sec61α y β-actina (control de carga). Los anticuerpos primarios fueron visualizadas mediante el uso de anticuerpos ECL Plex secundaria y de imágenes de fluorescencia. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Análisis de los datos de eficacia de la transfección. Las imágenes fueron grabadas en un microscopio de fluorescencia equipado con cámara CCD enfriado. La eficiencia de transformación se puede determinar al dividir el número de células que presentan fluorescencia de GFP por células contadas en el modo de campo claro. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 disparos. Pantalla de imágenes en vivo de calcio celular de las células HeLa en presencia de control o SEC61A1 siRNA y la presencia o ausencia del antagonista del CAM-células ophiobolin A. HeLa fueron tratados con siRNA dirigido contra SEC61A1 (B) o un siRNA control negativo (A) durante 96 horas como se indica. Estas células se cargaron con el indicador de calcio fura-2 AM y se incubaron en un tampón de Ca 2 + libre que contiene 0,5 mM EGTA, luego de amortiguación o ophiobolin A (Ophio A) en tampón y se añadió reanudó la incubación. Después de 10 minutos, liberación de Ca 2 + se inició mediante la aplicación de thapsigargin (TG) en ausencia de Ca 2 + externo y la incubación se continuó. Las capturas de pantalla de la imagen continua de calcio fueron tomadas en el momento indicado. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Análisis de los datos para los experimentos de células vivas imágenes de calcio. (A) El análisis cinético y cuantitativa de una serie de experimentos como se muestra en la figura. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] se calcula a partir de mediciones relación con un método de calibración establecida 2. El efecto de thapsigargin se muestra como diagrama de barras. (BD) Las células fueron tratadas con siRNA control o el indicado SEC61A1-siRNA durante 48 horas y luego se transformó con el vector de control, ya sea (C), o SEC61A1 plásmido de expresión (C), o mutantes SEC61A1 plásmido de expresión (D) como se indica. Después de 48 h, los experimentos de imagen de calcio se llevaron a cabo como en las figuras 4 y 5A. El análisis estadístico de los cambios en la citosólica de Ca 2 + de concentración después de la adición de thapsigargin en los experimentos tal como se presenta en A se muestran. Los valores de p &lt;0,001 fueron definidos como significativos por la prueba t no apareada y se indican con tres asteriscos (***), ns, no significativo. El número de células que se analizaron se indican. Los valores medios se da, las barras de error representan los errores típicos de los medios de barrido (SEM). Tomamos nota de que estos ejemplos han sido adaptados de ref. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Estos datos indican que la liberación de las cadenas nacientes del complejo Sec61 de hecho conduce a la liberación de calcio desde la sala de emergencias y la formación de un nanodomain de calcio alrededor de la boca citosólica del complejo Sec61. Este calcio se une a la calmodulina y calcio-calmodulina se cierra el complejo Sec61. "

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+physiological+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li>
<li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li>
<li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li>
<li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum%3A+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li>
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<li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocon+closure+to+Ca2%2B+leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li>
<li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilins+form+ER+Ca2%2B+leak+channels%2C+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer%27s+disease-linked+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li>
<li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li>
<li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li>
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<li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li>
</ol>

En células de mamíferos, el retículo endoplasmático (ER) juega un papel clave en la biogénesis de proteínas, así como en la señalización de calcio. Aquí hemos descrito un sistema experimental que nos permite abordar directamente el papel de un potencial canal de Ca 2 + de fuga y la caracterización de sus posibles mecanismos reglamentarios 13. Este sistema experimental nos da la oportunidad única de i) evaluar la contribución de las diferentes proteínas de la membrana ER pasiva Ca 2 + flujo de salida de la sala de emergencia en varios tipos de células, ii) caracterizar las proteínas y los mecanismos que limitan el pasivo de Ca 2 + flujo de salida, y iii) estudiar los efectos de las mutaciones de las enfermedades vinculadas a los componentes pertinentes. Tomamos nota de que sólo las células viables deben ser analizados y que la viabilidad en general debe estar por encima del 80%. Por lo tanto, la viabilidad celular es evaluada en forma rutinaria empleando nucleares ID reactivo para la viabilidad de azul / verde de acuerdo con el protocolo del fabricante. Además, el análisis estadístico de los cambios en el citosol concentración de Ca2 + es obligatorio. Por lo tanto, los experimentos que se llevarán a cabo durante cuatro lotes diferentes de las células y los dos cubreobjetos con al menos 20 células tienen que ser analizados para cada condición en un solo experimento. Tomamos nota de que los diversos experimentos que se llevarán a cabo al mismo tiempo, después de la siembra en el cubreobjetos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> DMEM + Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Nuclear-ID Azul / Verde reactivo de viabilidad celular </td><td> Enzo Ciencias de la Vida </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> FURA-02 a.m. </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> A Ophiobolin </td><td> Enzo Ciencias de la Vida </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazina </td><td> Sigma </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Condesa ® contador celular automático </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Tifón-Trio sistema de imágenes </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S microscopio con cámara DS-5Mc </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> microscopio iMic con policromía V </td><td> Hasta Fotónica </td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo del calcio celular combinado con el silenciamiento de genes mediada por sirna identifica ca 2 + canales de fugas en la membrana del er y sus mecanismos de regulación

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

En células de mamíferos, el retículo endoplasmático (ER) juega un papel clave en la biogénesis de proteínas, así como en la señalización del calcio 1. El heterotrimeric Sec61 complejo en la membrana del ER proporciona una ruta acuosa de polipéptidos recién sintetizados en el lumen del ER. Trabajos recientes de varios laboratorios sugieren que este complejo heterotrimeric también forma transitoria de Ca 2 + canales de fuga de 2-8. La observación clave de esta idea fue que la liberación de polipéptidos nacientes de los ribosomas y complejo Sec61 por puromicina conduce a la liberación transitoria de Ca 2 + de la sala de emergencias. Además, se ha observado in vitro que la proteína luminal ER Bip está involucrado en la prevención de la permeabilidad de iones a nivel del complejo Sec61 9,10. Hemos establecido un sistema experimental que nos permite abordar directamente el papel del complejo Sec61 como posibles canales de Ca 2 + de fuga y la caracterización de sus mecanismos de regulación putativo 11-13. Este sistema combina mediada siRNA silenciamiento de los genes y células vivas imágenes de Ca 2 + 13. Las células son tratadas con siRNAs que se dirigen contra la codificación y la región no traducida (UTR), respectivamente, del gen SEC61A1 o un siRNA control negativo. En el análisis de complementación, las células co-transfectadas con un vector de IRES-GFP que permite que el siRNA resistentes a la expresión del gen de tipo salvaje SEC61A1. Luego, las células se cargan con el radiométrica Ca 2 +-indicador Fura-2 para controlar simultáneamente los cambios en la citosólica de Ca 2 + de concentración en un número de células a través de un microscopio de fluorescencia. La medición continua de citosólica de Ca 2 + también permite la evaluación del impacto de los diversos agentes, como la puromicina, inhibidores de moléculas pequeñas, y thapsigargin de Ca 2 + de fuga. Este sistema experimental nos da la oportunidad única de i) evaluar la contribución de las diferentes proteínas de la membrana ER pasiva Ca 2 + flujo de salida de la sala de emergencia en varios tipos de células, ii) caracterizar las proteínas y los mecanismos que limitan el pasivo de Ca 2 + flujo de salida, y iii) estudiar los efectos de las mutaciones de las enfermedades vinculadas a los componentes pertinentes.

El retículo endoplasmático juega un papel clave en la biogénesis de proteínas y en la homeostasis del calcio. Hemos establecido un sistema experimental que nos permite abordar el papel de los canales de Ca2 + de fugas y para caracterizar sus mecanismos de regulación putativo. Este sistema consiste en el silenciamiento de genes mediada por siRNA y de células vivas imágenes de Ca2 +.

Imágenes en vivo del calcio celular combinado con el silenciamiento de genes mediada por siRNA Identifica Ca 2 + Canales de fugas en la membrana del ER y sus mecanismos de regulación

En las células de mamíferos, el retículo endoplasmático (RE) desempeña un papel fundamental tanto en la biogénesis de proteínas como en la señalización de calcio1. El complejo heterotrimérico Sec61...

En las células de mamíferos, el retículo endoplasmático o RE desempeña un papel importante en la biogénesis de proteínas y en la señalización de calcio. El complejo heterotrimérico Sec61 en la membrana del RE proporciona una vía acuosa para que los polipéptidos recién sintetizados ingresen al lumen del RE. Datos recientes sugieren que Sec61 también podría formar canales de fuga de calcio transitorios, lo que lleva a investigar directamente el papel del complejo Sec61 como un posible canal de fuga de calcio.Y para caracterizar sus mecanismos reguladores putativos, primero se tratan las células con siARN dirigidos contra el gen sex 61 A uno. En el análisis de complementación, las células se transfectan simultáneamente con un vector iris GFP que permite la expresión resistente al irna del gen de tipo silvestre sex 61 A uno. Luego, las células se cargan con el indicador de calcio con relación métrica RO dos y se monitorean los cambios en la concentración de calcio citosólico mediante microscopía de fluorescencia.Mientras se miden los niveles de calcio, se realizan cambios en la solución para evaluar el impacto de diversos agentes, como antagonistas de la calmodulina y fábs argón, sobre la fuga de calcio. El análisis cuantitativo de las imágenes resultantes revela cambios en el flujo de calcio F inducidos por el silenciamiento de sex 61 A uno. En este video, se presentará un modelo para el papel de sex 61 A uno en el flujo de calcio F tras la demostración del procedimiento y la presentación de los resultados.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los experimentos de bio membranas planetarias o las mediciones de canal único es que las proteínas de membrana candidatas pueden analizarse en su entorno nativo y sin la tediosa purificación ni la reconstitución funcional generalmente ineficiente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización por calcio, como, por ejemplo, cuál es la contribución de una proteína específica de la membrana del RE al flujo de calcio desde el RE en diferentes tipos celulares y cómo están reguladas. El procedimiento será demostrado por Sway Long y NICO, dos talentosos estudiantes de posgrado de nuestros laboratorios. Comience este procedimiento preparando las soluciones y reactivos que se utilizarán. Primero, prepare el tampón sin calcio según las instrucciones del protocolo escrito adjunto.A continuación, diluya una solución stock del indicador de calcio. Diluya fura 2:00 AM en un mililitro de DMEM que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina hasta una concentración final de cuatro micromolares. Diluya una solución stock de Apso Garin de un milimolar en tampón libre de calcio hasta una concentración final de tres micromolares. Tenga también disponible oleína A 200 micromolar y 20 micromolar para reducir el riesgo de estudiar efectos fuera del blanco de un irna particular. Se utilizan dos irna diferentes para silenciar cada gen con el fin de evaluar posibles efectos secundarios del procedimiento de transfección.Los siARN de control negativo, que están compuestos por una secuencia aleatoria de nucleótidos, se transfectan en paralelo con los siARN experimentales. Es importante que el efecto del silenciamiento mediado por irna pueda rescatarse mediante la expresión del ADNc de tipo salvaje. Por lo tanto, los siARN utilizados para el experimento se seleccionan específicamente de modo que el plásmido de rescate no se vea afectado por los siARN. En este experimento, los siARN se dirigen tanto contra la región de revestimiento como contra la región no codificante o región no traducida, abreviada como UTR, del gen de interés.Cuando los siARN se dirigen contra el rescate del UTR, se pueden utilizar plásmidos sin el UTR endógeno para realizar la transfección en células HeLa. Prepare las células para la transfección colocando un cubreobjetos de 25 milímetros recubierto con polilisina en un plato de cultivo celular de seis centímetros para cada transfección; después de una hora, agregue 5,2 × 10⁵ células HeLa y DMEM suplementado a cada plato. Para transfectar las células, etiquete un tubo microcentrífugo.Para cada reacción de transfección, añada a cada tubo cuatro microlitros de ARNi de 20 micromolar disuelto en 80 microlitros de Opti-MEM. SEC61A1, SEC61A1 UTR y ARNi de control negativo se preparan en cada tubo. Añada 20 microlitros del reactivo de transfección Hyperfect, vortexee suavemente y luego incube las reacciones a temperatura ambiente durante 10 minutos. Para transfectar las células, añada la mezcla de ARNi (104 microlitros en total) gota a gota sobre las células Hela sembradas y agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de los complejos de transfección.Incubar a 37 grados Celsius en un ambiente humedecido con 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, reemplace el medio con 3,9 mililitros de medio fresco. Luego, para aumentar la eficiencia de transfección, realice la transfección una segunda vez, utilizando la misma mezcla de irna; para evaluar el silenciamiento, realice un análisis por inmunotransferencia (western blot).El silenciamiento debe ser superior al 80 %, como se muestra aquí para sex 61 A uno. El efecto máximo de silenciamiento se observa típicamente 96 horas después de la primera transfección, 48 horas después de la primera transfección preparada para rescatar el fenotipo resultante del silenciamiento de sex. 61, comience etiquetando un nuevo tubo de microcentrífuga.Para cada reacción, las células se transfectarán ahora con un vector vacío o con un plásmido de expresión del tipo silvestre de sex 61 A uno. El plásmido de expresión del tipo silvestre utilizado aquí se generó insertando el ADNc de sex 61 A uno en el sitio de clonación múltiple de un pcd.Un vector de entrada ribosómica interna triple que contiene el promotor del citomegalovirus, la iris y la secuencia de recubrimiento de la proteína verde fluorescente. Prepare el reactivo de transfección añadiendo cuatro microgramos de cada plásmido disuelto en 80 microlitros de óptimo a cada tubo. Luego, añada a esto 16 microlitros del reactivo de transfección FU gene HD, vortexe suavemente esta solución e incúbela a temperatura ambiente durante 10 minutos.Luego de cambiar el medio, agregue la mezcla de plásmidos gota a gota a las células Heli 5,2 × 10⁵ adheridas y agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de los complejos de transfección. Incube las células a 37 °C y 5 % de dióxido de carbono durante 48 horas adicionales. Para determinar la eficiencia de transfección, evalúe la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia.Después de 48 horas, al menos el 80 % de las células deben estar transfectadas. Antes de la adquisición de imágenes, use pinzas para transferir los cubreobjetos con las células HeLa transfectadas a una nueva placa de cultivo celular de 3,5 centímetros y agregue un mililitro de DMEM con cuatro micromolares.Si usted es un incubado de 2:00 AM durante 45 minutos a 25 grados Celsius en la oscuridad. Para realizar la imagen, transfiera el cubreobjetos con menos de dos células cargadas a una cámara de registro metálica y fíjelo en su lugar atornillando las dos partes de la cámara juntas. Utilizando una pipeta, agregue y retire 300 microlitros de tampón sin calcio a las células para lavarlas.Repita y luego monte la cámara de registro en un microscopio I MIC con cinco cremadores policromáticos. Utilizando un juego de filtros para URA dos, busque un campo que contenga al menos 20 células para estimar la fluorescencia independiente de calcio de FU A dos. La longitud de onda de excitación utilizada en este paso es de 360 nanómetros.Una vez seleccionado un campo adecuado, configure el software de imagen para excitar a 340 nanómetros y 380 nanómetros y para medir la fluorescencia emitida a 510 nanómetros cada tres segundos; ajuste el tiempo de exposición para producir intensidades de fluorescencia alrededor de 1000 unidades arbitrarias para el montaje mostrado aquí. Se establece un tiempo de exposición de cinco milisegundos. Además, marque las regiones de interés o ROI para una región de fondo sin células y hasta 20 contornos celulares.Inicie la imagen de células vivas mientras el experimento está en curso; el sistema presentará imágenes con relación métrica para menos de dos señales, así como las relaciones F340/F380 en tiempo real para cada ROI marcada en forma de gráfico de líneas, donde F340 y F380 corresponden a la intensidad de fluorescencia dentro de las ROI a 340 y 380 nanómetros, respectivamente. Después de un minuto, agregue soluciones de prueba a la cámara de imagen para evaluar diferentes parámetros experimentales. En estos experimentos, se evalúan el antagonista de Calmodulina, trifluoperazina y bolina A, tras realizar mediciones con relación métrica durante 10 minutos adicionales.Para antagonistas modulares de CAL, agregue DSA gargan y continúe con las mediciones. Registre 400 imágenes emparejadas por experimento. Una vez que se hayan recopilado las imágenes, revíselas y marque las ROI para al menos 20 células en cada campo de visión.Posteriormente, utilice la opción de análisis cinético del software para crear una secuencia de imágenes de cociente con sustracción de fondo y una gráfica que muestre la cinética del cociente de calcio con sustracción de fondo. Para cada ROI, finalmente exporte los datos a Excel y Origin utilizando un método de calibración establecido. La concentración de calcio en el citosol puede calcularse a partir de las mediciones del cociente para examinar si el gen sex 61 A afecta la fuga de calcio desde el RE.El gen sex 61 A uno se silenció mediante dos ARN diferentes en células helo durante 96 horas. El silenciamiento se evaluó mediante análisis de Western blot de números similares de células por triplicado; como se muestra aquí, hay una señal fuerte de 6 61 alfa en las bandas de uno a tres y una señal significativamente más débil en las bandas de cuatro a seis y de siete a nueve, que corresponden a las células con silenciamiento de 6 61 A uno. Para cuantificar los resultados, las señales de 6 61 alfa se normalizaron respecto a las señales de beta actina; se logró un silenciamiento superior al 80 %. Esto se realizó para evaluar el papel de la calmodulina en el flujo de calcio en el RE.Se realizó una imagen URA dos de células sex 61 A tratadas con helo en presencia o ausencia del antagonista de la calmodulina, Bollin A. Esta película muestra células de control tratadas con Bollin A; 10 minutos después del tratamiento con Bollin A, se inició la liberación de calcio mediante la aplicación de FSO Gargan, un inhibidor cíclico que desencadena la liberación de calcio desde el retículo endoplásmico en ausencia de calcio externo, tal como puede observarse aquí.La adición de argón FSA provocó un aumento transitorio pero significativo en la fluorescencia, lo que indica una liberación de calcio desde el RE. En contraste, la liberación de calcio tras la adición de garin FSO en células silenciosas del hueso PHE, tratadas con la sustancia A 61 A, es mucho menos pronunciada, como puede observarse aquí. Esta diferencia puede verse claramente en este diagrama, que muestra el calcio citosólico estimado a lo largo del tiempo en una serie de películas; los resultados cuantitativos mostrados aquí confirman un aumento en la liberación de calcio en células control en respuesta al argón tíc en presencia de bolina A, tal como se observa en este diagrama de barras.El mismo fenómeno se observó para un segundo triazina antagonista de cam. Sin embargo, los efectos de los antagonistas de cam no se observaron cuando el complejo sex 61 fue agotado en las células mediante cualquiera de los dos sex. 61 Un rescate parcial específico de este fenotipo puede observarse cuando las células silenciosas de sex 61 A uno fueron transfectadas con sex.61 un plásmido de expresión, como se puede observar aquí. La respuesta del calcio ffl frente a los agonistas de Cal Modin se restaura parcialmente mediante la transfección del plásmido de tipo silvestre insensible al irna. Estos resultados sugieren que Cal Modlin participa en la limitación del flujo de calcio en el RE a nivel del complejo a sex 61 en las células.Si es así, la transfección del gen sex 61 A uno con una mutación doble en el sitio de unión a calmodulina no debería revertir el fenotipo inducido por irna. De hecho, cuando las células fueron transfectadas utilizando un plásmido de expresión de sex 61 A uno con una mutación doble en el motivo IQ, no hubo rescate del fenotipo considerado en conjunto. Estos datos indican que la liberación de cadenas nacientes del complejo sex 61 efectivamente conduce a la liberación de calcio desde el retículo endoplásmico y a la formación de un nano-dominio de calcio alrededor de la boca citosólica del complejo sex 61.Este calcio es unido por Cal Moulin y el calcio-Cal Moulin cierra el complejo sex 61. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo combinar el silenciamiento génico mediado por ARNi en células humanas con la imagenología de calcio intracelular siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la expresión de ADNc con mutaciones asociadas a enfermedades, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como el impacto potencial de mutaciones asociadas a enfermedades en componentes irrelevantes.Y no olvide que trabajar con fármacos como tap, una vez más, puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al realizar este procedimiento.

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