Name: Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Aprende a cultivar y dispensar cepas fluorescentes de C. elegans para cribado de alto rendimiento y detección de contaminantes ambientales. Este método utiliza reportadores duales GFP y RFP para cuantificar cambios en la expresión génica en vivo con alta reproducibilidad.

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C. elegans transgénicos fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis (Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN). Este trabajo fue apoyado por el NIH R21 conceder NS0667678-01 a KS. Todos los autores participaron en la recolección, análisis e interpretación de datos. CKL, KS, y KPC participaron en la redacción y revisión del manuscrito.

1. Preparación de comida de gusanos bacteriana Día 1 <ol><li> Añadir 5 ml de grasa saturada E. coli OP50 cultivo bacteriano a 500 ml de caldo fabuloso suplementado con 50 mg / ml de estreptomicina y crecer en una incubadora de agitación (225 rpm) durante la noche a 37 ° C. </li></ol> Día 2 <ol start="2"><li> Dividir el cultivo de bacterias durante la noche en diez tubos de 50 ml y bacterias centrífuga en una centrífuga refrigerada a 2.500 rcf durante 20 minutos. </li><li> Decantar el caldo LB y resuspender cada sedimento bacteriano en 10 ml de líquido de los medios de comunicación nematodo crecimiento (NGM). Agitar horizontalmente en el suelo agitador durante 15 minutos para volver a suspender las bacterias. Para hacer buffer NGM, añadir 3 g de NaCl en 1 l de agua desionizada y autoclave. Enfriar a 55 ° C y añadir con el fin de las siguientes soluciones estériles: 1 ml de 1 M de CaCl 2, 1 ml de 1 M MgSO 4, y 25 ml de 1 M de fosfato de potasio, pH 6,0. </li><li> Centrifugar el cultivo bacteriano en una centrífuga refrigerada a 2500 rcf durante 20 minutos. </li><li> Decantar buffer NGM y pesar el sedimento bacteriano. </li><li> Añadir un volumen igual de tampón de NGM para volver a suspender las pastillas, alícuota de 3 ml de bacterias se concentran en tubos de 15 ml y almacenar a -20 ° C. </li></ol> 2. A gran escala C. elegans de cultivo líquidos Nosotros usamos una línea transgénica VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [dop-3:: RFP]) con dos construcciones fluorescentes: Pgst -4:: GFP 14 para controlar SKN-1 actividad y PDOP 3:: PP 17 para servir como un estándar para la normalización del gusano número. Día 1 <ol><li> Mezclar 150 ml NGM buffer, 1,5 ml de caldo de LB, 150 l de 5 mg / ml de colesterol (en etanol), y 75 l de 100 mg / ml de estreptomicina. Filtro a esterilizar la mezcla y añadir a un frasco estéril de 1 litro. NOTA: Agregar 1% caldo de LB para amortiguar NGM ayuda a evitar que los gusanos se pegue a la cristalería y utensilios de plástico, pero esta cantidad no es suficiente para apoyar el crecimiento de bacterias. </li><li> Sincronizar los gusanos con el procedimiento estándar de hipoclorito de 18 años. Hasta 0,5 ml de gusanos grávidos pueden ser procesados ​​en un tubo de 15 ml solo con 5 ml de solución de hipoclorito (3,75 ml de agua estéril, 1 ml de lejía de uso doméstico, y 250 l de NaOH 10 N). Lavado de los óvulos liberados con agua estéril y se resuspenden en 10 ml de solución tampón NGM. </li><li> Diluir una muestra de los huevos de 100 veces en NGM tampón (por ejemplo, 100 l en 10 ml) y contar el número de huevos en tres separadas 5 alícuotas. Varios el número promedio de 200.000 (100 x factor de dilución 2000) para estimar el número total de huevos. </li><li> Agregar 200.000 a 2 millones de huevos en el matraz con tampón NGM y agitar la cultura a 100 rpm a 20 ° C. </li></ol> Día 2 <ol start="5"><li> Por lo menos 16 horas después de añadir los huevos en el matraz, utilice una pipeta serológica estéril para retirar aproximadamente 0,5 ml de la lombricultura en suspensión. Pipeta de 5 gotas tres l en la tapa estéril de una placa de Petri. Coloque la tapa en un congelador a -20 ° C durante 1-2 minutos para paralizar los gusanos. Cuente el número promedio de gusanos vivos nacidos por cada 5 l, y luego varios en 30.000 (150 ml / 5 l) para estimar el número total de gusanos nacidos. </li><li> Descongelar un tubo de congelados OP50 cultivo bacteriano (Protocolo 1.6) y añadir 3 ml de 50% OP50 en la cultura del gusano por cada 500.000 nacidos gusanos. Agitar el matraz a 100 rpm a 20 ° C. Los gusanos se convierten en larvas L4 y adultos jóvenes en aproximadamente 51 horas. El OD600 de bacterias debe ser cerca de 2.200 desde el principio. Controlar la cantidad de bacterias mediante la absorción y añadir más si el OD 600 cae por debajo de 0.900. </li></ol> 3. Gusano de recogida y distribución Día 4 <ol><li> Use una pipeta serológica estéril para la transferencia de aproximadamente 0,5 ml de la cultura del gusano suspendido sobre una placa de agar NGM estándar. Ver los gusanos con un microscopio estereoscópico para asegurarse de que la mayoría son larvas L4 y adultos jóvenes. L4 larvas tienen una mancha ventral claro en la parte media del cuerpo. Los adultos jóvenes será un poco más grande y no tendrá un lugar despejado. </li><li> Vierta la lombricultura en el estéril tubos de 50 ml y se colocan los tubos en un bastidor de tubo de ensayo en el laboratorio. Permita que los gusanos que conformarse con unos 10 minutos. Eliminar el sobrenadante por aspiración o la pipeta. NOTA: Este paso puede ser importante para eliminar los huevos no eclosionados o gusanos que no se desarrolló debido a que se asentarán más lento que larvas L4 y adultos jóvenes. </li><li> Recoge todos los gusanos en un solo tubo de 50 ml y lavar con buffer NGM con caldo de LB 1% (NGM LB +) 3-4 veces para eliminar las bacterias. NOTA: Esto se hace mejor en una centrífuga de balanceo de cubo mediante la recopilación de los gusanos a 500 rcf durante 30 segundos y reemplazar el sobrenadante con frescos NGM + tampón LB. </li><li> Después del lavado, llenar el tubo con NGM + tampón LB a 50 ml y se vierte en un frasco de gusano personalizado de dosificación. Agregar una barra de poca agitación y revuelo para mantener a los gusanos en suspensión. Conde ªnúmero de gusanos de correo en tres 5 gotas l como se indica más arriba. Diluir con NGM LB + hasta llegar 12-15 gusanos por 5 gota l (~ 2.5-3.0 gusanos / l). NOTA: Un mínimo de 20 ml (60.000 gusanos) que se necesita para llenar el espacio muerto del frasco dispensador y dispensador de cinta. Cada placa de 384 y requiere cerca de 35.000 gusanos o 11,5 ml de suspensión gusanos. </li><li> Cargar un casete de 10 l de dosificación y esterilizar cebado con etanol al 70%. Enjuague el etanol mediante cebado con agua estéril. </li><li> Inserte el extremo de la cinta de distribución en el matraz de manera que es justo por encima de la barra de agitación sin interrumpir su movimiento. Asegúrese de que los gusanos permanecen suspendidas en todo el frasco entero. Programa del dispensador para dispensar a baja velocidad con dos pre-pulsos. Primer y ejecutar al menos 10 ml de suspensión gusanos. Llenar las placas, según sea necesario con rapidez para evitar que los gusanos se asiente en el tubo. </li><li> Sellar las placas con cinta adhesiva transpirable. </li><li> Coloque las placas en una plataforma de agitación en una incubadora a la temperatura adecuada para su análisis. No apile los platos. </li></ol> 4. El análisis de fluorescencia <ol><li> Coloque la placa de destino en un lector de microplacas para medir la intensidad de la fluorescencia de cada pozo con la longitud de onda apropiada de emisión y excitación (Filtros para nuestro ensayo: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em). </li><li> Calcular la proporción de GFP / RFP y normalizar las lecturas de los pozos de control (sin compuesto activador) para determinar la diferencia exacta de veces la intensidad de fluorescencia derivado de los tratamientos individuales. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Nuestra SKN-1 ensayo utiliza una cepa integrado cromosómicamente reportero dual (VP596). Como se muestra en la Figura 1, el número de gusanos se correlaciona bien con el volumen dispensado. Como se muestra en 2A y 2B, el total de las buenas prácticas agrarias y RFP cifras por fluorescencia y es altamente reproducible de un pozo a través de una placa de 384 pocillos. Como se muestra en la Figura 2C, sin inducida Pgst-4: la fluorescencia de GFP es linealmente correlacionada con PDOP-3:: Solicitud de Propuestas a través de 384 pozos. Cuando se expresa como una relación de buenas prácticas agrarias / RFP, la fluorescencia se convierte en altamente reproducible de un pozo a través de una placa de 384 pocillos (comparar el coeficiente de variación de la figura 2D a 2A) que demuestran la capacidad de la DPS-3:: reportero RFP para reducir la variabilidad. Como se muestra en la figura 3, la inducción de las buenas prácticas agrarias en relación a la RFP con un SKN-1 activar xenobióticos (38 M juglone) es sólido y altamente reproducible a través de una placa de 384 pocillos. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. El número de gusanos en función del volumen dispensado. Los gusanos se diluyeron hasta aproximadamente 2/μl y se distribuye en una placa de 24 pocillos para el conteo manual con un microscopio estereoscópico. N = 8 pozos por unidad de volumen. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fluorescencia total de gusanos se distribuye en una placa de 384 y es reproducible. Los gusanos se diluyeron a l aproximadamente 2.5/μl y 30 se distribuye en cada pocillo de una placa de 384 pocillos. GFP (A) y el PP (B) de fluorescencia de todos los pozos tenían un coeficiente de variación por debajo del 9%. (C) la fluorescencia de GFP está altamente correlacionada con la RFP de fluorescencia. (D) Cálculo de la relación de las buenas prácticas agrarias para reducir RFP el coeficiente de variación por debajo de 6% (A, B y D) Las líneas continuas indican los medios y las líneas discontinuas indican tres desviaciones estándar por encima o por debajo de la media. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 La activación de Pgst-4:: GFP es robusta y consistente. Aproximadamente el 75 L4 gusanos fueron dispensadas en los pocillos de una placa de 384 pozos y 38 juglone M se añadió en cada columna. Las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia se midió a las 21 h de incubación. La media de ratios de fluorescencia relativa de todo control (1,0) y juglone pozos (8,9) están marcados con líneas continuas. Tres desviaciones estándar por encima de la media de control y por debajo de la media juglone están marcados con líneas discontinuas.

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<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).</li>
</ol>

Se presenta un método para cultivar y distribuir grandes cantidades de nematodos transgénicos. El equipo utilizado para el cultivo de lombrices es el estándar para los laboratorios que realizan la clonación molecular y el manejo de líquidos y el equipo de fluorescencia es el estándar para los laboratorios de procesamiento de un gran número de microplacas. Otros métodos de dispensación de un gran número de vivir C. elegans requieren partículas caro equipo de clasificación 19. El Pgst-4: ensay...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> LB caldo </td><td> Investigación de Productos International Corp. </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Excelente caldo de </td><td> Investigación de Productos International Corp. </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ HT Multi-modo de lector de microplacas </td><td> BioTek </td><td></td><td> Filtros: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Seleccione dispensador </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gusano de dispensación frasco </td><td> El sur de Scientific Inc., Micanopy, FL </td><td></td><td> Costumbre montado (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 microplacas </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Cinta de sellado transpirable </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-hidroxi-p-naphthoqinone) juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone se disuelve en DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans transgénicos cepa </td><td> Autor de laboratorio </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP y PDOP 3:: SDP </td></tr></tbody></table>

selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con c. elegans las cepas

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Selección de alto rendimiento (HTS) es un poderoso método para la identificación de moduladores químicos de los procesos biológicos. Sin embargo, muchos de los compuestos identificados en las pantallas usando modelos de cultivo celular se encuentran a menudo que son tóxicos o inactivos farmacológicamente in vivo 1-2. Proyección en modelos animales todo puede ayudar a evitar estos escollos y agilizar el camino hacia el desarrollo de fármacos. C. elegans es un organismo multicelular modelo muy adecuado para HTS. Es pequeño (&lt;1 mm) y puede ser económicamente culta y se distribuye en los líquidos. C. elegans es también uno de los modelos animales más manejables experimentalmente que permitan la identificación rápida y detallada de las drogas el modo de acción 3. Se describe un protocolo para el cultivo y distribución de las cepas fluorescentes C. elegans para la selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas o detección de contaminantes ambientales que alteran la expresión de un gen específico. Un gran número de gusanos de desarrollo sincronizado en un cultivo líquido, cosecha, lavado, y suspendió a una densidad definida. Los gusanos se añaden al negro, de fondo plano placas de 384 pocillos con un dispensador de líquidos peristáltica. Las moléculas pequeñas de una biblioteca de química o de las muestras de ensayo (por ejemplo, agua, alimentos o suelo) se pueden añadir a los pozos con los gusanos. En vivo y en tiempo real la intensidad de fluorescencia se mide con un lector de microplacas de fluorescencia. Este método se puede adaptar a cualquier gen inducible en C. elegans para que un periodista adecuados. Estrés inducible muchas vías de desarrollo y de la transcripción están bien definidos en C. elegans y las buenas prácticas agrarias reportero cepas transgénicas ya existen en muchos de ellos 4. Cuando se combina con los reporteros transgénicos corresponda, nuestro método puede ser utilizado para la detección de moduladores de la vía o el desarrollo de sólidas pruebas de biosensor de contaminantes ambientales. Demostramos nuestro C. elegans la cultura y el protocolo de dispensación con un ensayo HTS que hemos desarrollado para controlar el C. factor de transcripción collar &#39;n&#39; elegans tapa SKN-1. SKN-1 y su homólogo de mamíferos Nrf2 activar genes citoprotectores durante el estrés oxidativo y 10.5 xenobióticos. Nrf2 protege a los mamíferos a partir de numerosos trastornos relacionados con la edad como el cáncer, neurodegeneración y la inflamación crónica y se ha convertido en un importante objetivo de la quimioterapia 11-13. Nuestro análisis se basa en un reportero GFP transgénicos para la SKN-1 del gen objetivo -4 gst 14, que codifica un 6 glutatión-s-transferasa. El periodista gst -4 es también un biosensor para los productos químicos xenobióticos y de oxidación, que activan SKN-1 y se puede utilizar para detectar bajos niveles de contaminantes tales como la acrilamida y el metil-mercurio 15-16.

Un procedimiento de cultivo a base de líquido y dispensación de<em&gt; C. elegans</em&gt; Cepas que expresan proteínas fluorescentes reportero se describe que no requiere de equipos de selección caro. Este enfoque puede aplicarse a numerosas inducible<em&gt; C. elegans</em&gt; Genes para la detección de drogas o biosensores de contaminantes.

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

El cribado de alto rendimiento (HTS) es un enfoque potente para identificar moduladores químicos de procesos biológicos. Sin embargo, muchos de los compuestos identificados en...

Este video demuestra un método para cultivar y dispensar cepas fluorescentes de CL gans para el cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas o la detección de contaminantes ambientales, con el fin de evaluar el efecto de agentes químicos o ambientales sobre la actividad de proteínas específicas. En CL elgan, primero se preparan cultivos bacterianos como alimento para los gusanos y gusanos transgénicos GFP. Se cultivan gusanos sincronizados.Se recolectan entre 0,5 y 2 millones de gusanos, se lavan y se distribuyen en 3 placas microtituladoras de 84 pocillos, luego se añaden moléculas pequeñas de una biblioteca química o muestras de prueba, como agua, alimento o suelo, a los gusanos. Finalmente, se mide la fluorescencia de los gusanos mediante un lector de microplacas.El análisis de datos de intensidades de fluorescencia revela moléculas pequeñas que modulan vías transcripcionales inducibles o permite la detección de contaminantes ambientales. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los ensayos basados en cultivo celular o in vitro, es que no se perderá tiempo con compuestos que resulten tóxicos o inactivos in vivo. Este método de alto rendimiento puede ayudar a identificar moléculas pequeñas que modulan diversas vías inducibles.Aunque desarrollamos este método para la selección de alto rendimiento de bibliotecas de moléculas pequeñas, también puede aplicarse a la detección de contaminantes en muestras alimentarias y ambientales. El procedimiento será demostrado por Andrew Dine, técnico de mi laboratorio, y Q long, investigador postdoctoral de mi laboratorio. Prepare con anticipación la comida bacteriana para los gusanos.Comience inoculando 500 mililitros de caldo excelente, suplementado con 50 microgramos por mililitro de estreptomicina, con cinco mililitros de e coli OP 50 saturado. Coloque el cultivo en un agitador y crezca durante la noche a 37 grados Celsius.Al día siguiente, divida el cultivo en 10 tubos de 50 mililitros. Luego coloque los tubos en una centrífuga refrigerada y centrifugue a 2.500 RCF durante 20 minutos. Después de la centrifugación, suspenda cada pellet bacteriano en 10 mililitros de medio de crecimiento líquido para nematodos o NGM.Agite las suspensiones horizontalmente. Utilice un agitador de piso durante 15 minutos para resuspender las bacterias. A continuación, centrifugue la cultura bacteriana a 2.500 RCF a cuatro grados Celsius durante 20 minutos.Decante el NGM y pese el pellet bacteriano. A continuación, añada un volumen igual de tampón NGM y re suspenda los pellets mediante vortex. Finalmente, alícuote tres mililitros de la cultura bacteriana re suspendida en tubos de 15 mililitros y almacénelos a menos 20 grados Celsius hasta que sean necesarios.En esta demostración, se medirá el efecto del estrés inducido por el compuesto Xeno Duke sobre el factor de transcripción Sskn uno como ejemplo. Se sabe que Sskn uno activa genes citoprotectores durante el estrés oxidativo y xenobiótico. Se prepara un cultivo a gran escala de la línea Trenchgenic c gans VP 5 96, que porta dos constructos fluorescentes.Los gusanos VP 5 96 expresan tanto el promotor GST cuatro que dirige la GFP, el cual se utiliza para monitorear la actividad del factor de transcripción Sskn uno, como el promotor DOP tres que dirige la RFP, la cual se utiliza como estándar para la normalización del número de gusanos.DOP tres es el promotor de un receptor de dopamina y se expresa constitutivamente en neuronas a lo largo del cuerpo. En el ejemplo, dado que el xenobi lón activa fuertemente sskn uno y aumenta la cantidad de GFP expresada desde el promotor GS T cuatro, para preparar los cultivos comience combinando 150 mililitros de tampón N NGM, 1,5 mililitros de LB 150, microlitros de colesterol uno molar y 75 microlitros de estreptomicina 100 miligramos por mililitro. La adición de LB ayuda a evitar que los gusanos se adhieran al material de vidrio y plástico, pero esta cantidad no es suficiente para soportar el crecimiento bacteriano.Filtre para esterilizar la mezcla, luego transfiera el filtrado a un matraz estéril de un litro y deje el matraz aparte para liberar los huevos de los gusanos adultos GR. Lave las bacterias de los gusanos mediante centrifugación y reemplace el medio NGM hasta que el sobrenadante esté claro. Lave los gusanos una segunda vez resuspendiéndolos en agua estéril, centrifugue nuevamente tras la rotación.Retire el sobrenadante y llene el tubo con 3,75 mililitros de agua estéril. Añada un mililitro de lejía doméstica y 250 microlitros de hidróxido de sodio 10 normal, mezclando inmediatamente mediante cinco o seis inversiones. Coloque el tubo en un rotador después de que los gusanos hayan estado expuestos a la lejía durante cuatro minutos.Coloque el tubo bajo un microscopio estereoscópico. La mayoría de los adultos deberían estar muertos. Agite el tubo vigorosamente de 15 a 20 veces para ayudar a eliminar cualquier gusano adulto restante después de que haya ocurrido la lisis durante un total de cinco minutos; agregue agua estéril hasta llenar el tubo.Mezcle mediante inversión cinco a seis veces para recolectar los huevos. Centrifugue el tubo durante un minuto a 500 RCF. Lave los huevos tres veces con Resus, suspendiéndolos en 10 mililitros de agua estéril, centrifugando y eliminando el sobrenadante.A continuación, diluya una muestra de 100 microlitros de los huevos 100 veces añadiendo 10 mililitros de tampón NGM. Luego, pipetee tres alícuotas de cinco microlitros sobre la tapa de una placa de Petri bajo un microscopio. Cuente el número de huevos en tres alícuotas separadas de cinco microlitros.Para estimar el número total de huevos, agregue de 200 000 a 2 millones de huevos al matraz con tampón NGM y agite el cultivo a 100 rpm a 20 grados Celsius. Al menos 16 horas después de haber agregado los huevos al matraz, use una pipeta serológica estéril para retirar aproximadamente 0,5 mililitros del cultivo de gusanos en suspensión.Pipetee tres gotas de cinco microlitros sobre la tapa estéril de una placa de Petri. Coloque la tapa en un congelador a menos 20 grados durante uno o dos minutos para paralizar los gusanos una vez que hayan sido paralizados. Cuente el número promedio de gusanos vivos eclosionados por cada cinco microlitros utilizando un microscopio estereoscópico para estimar el número total.Deshiele la cultura bacteriana congelada de OP 50 preparada previamente dejándola sobre la mesa durante unos minutos. A continuación, agregue tres mililitros de OP 50 al 50% por cada 500.000 gusanos eclosionados. Agite el matraz a 100 RPM a 20 grados Celsius.Los gusanos se desarrollarán hasta larvas L4 y estadios de adultos jóvenes en aproximadamente 51 horas. Supervise la cantidad de bacterias durante toda la incubación mediante inspección visual. Añada más bacterias si el medio se vuelve transparente.Utilice una pipeta serológica estéril para transferir aproximadamente 0,5 mililitros de la cultura de gusanos suspendida a una placa estándar de agar NGM. Observe los gusanos con un microscopio estereoscópico para asegurarse de que la mayoría sean larvas L4 y adultos jóvenes mediante microscopía de campo brillante; las larvas L4 tendrán un punto claro ventral en el centro del cuerpo. Los adultos jóvenes serán ligeramente más grandes y no tendrán un punto claro.A continuación, aspire el cultivo de gusanos hacia tubos estériles de 50 mililitros. Coloque los tubos en una gradilla para tubos de ensayo dentro de la campana y deje asentar los huevos no eclosionados o los gusanos que no se desarrollen. Estos se sedimentan más lentamente que los gusanos desarrollados.Después de 10 minutos, retire el sobrenadante, que contiene gusanos no eclosionados y no desarrollados, mediante aspiración, agregando aproximadamente 10 mililitros de tampón NGM a cada pellet y suspendiendo los gusanos girando suavemente los tubos. Recopile todos los gusanos en un solo tubo de 50 mililitros. Centrifugue en una centrífuga con rotor de balanceo a 500 RCF durante 30 segundos.Luego, resuspenda los gusanos en 50 mililitros de NGM con 1% de lb para lavarlos. Repita este paso, lavando de tres a cuatro veces para eliminar las bacterias tras el lavado. Llene el tubo con NGM más tampón LB hasta 50 mililitros.Vierta esto en un matraz dispensador personalizado con un agitador magnético y colóquelo en una placa agitadora. Se necesita un mínimo de aproximadamente 20 mililitros o 60.000 gusanos para llenar el espacio muerto del matraz dispensador y del cartucho dispensador. Cuente el número de gusanos en tres gotas de cinco microlitros como se mostró previamente.Después de contar en NGM más LB hasta una concentración de 12 a 15 gusanos por gota de cinco microlitros, cada placa de 84 pocillos requiere aproximadamente 35.000 gusanos o 11,5 mililitros de gusanos en suspensión. Coloque un cassette dispensador de 10 microlitros en el dispensador y esterilícelo mediante cebado con etanol al 70 %. Enjuague el etanol cebando con agua estéril.Introduzca el extremo del casete de dispensación en el matraz de manera que quede justo por encima de la barra de agitación sin interrumpir su movimiento. Asegúrese de que los gusanos permanezcan en suspensión durante todo el matraz. Programe el dispensador para dispensar gusanos a baja velocidad con dos pulsos previos de cebado y procese al menos 10 mililitros de gusanos en suspensión.Llene rápidamente las placas de microtitulación, que ya deben contener los compuestos de prueba, para evitar que los gusanos se asienten en el tubo. Aquí el compuesto de prueba previamente cargado en la placa de microtitulación es Due.Glow. Selle las placas con cinta transpirable para evitar que el polvo se acumule en los pocillos.Coloque las placas sobre una plataforma agitadora en un incubador a la temperatura adecuada para el ensayo. No apile las placas, ya que esto puede restringir el flujo de aire. Coloque la placa objetivo en un lector de microplacas para medir la intensidad de fluorescencia de cada pocillo con las longitudes de onda de emisión y excitación adecuadas aquí.Los filtros utilizados para GFP son excitación a 485 y emisión a 528. Los filtros para RFP son excitación a 540 y emisión a 590. Después de leer la placa, calcule la relación entre GFP y RFP y normalice con las lecturas de los pocillos control, que no contienen el compuesto activador, para determinar la diferencia exacta de veces en la intensidad de fluorescencia derivada de los tratamientos individuales.El ensayo SSKN mostrado aquí utiliza un reportero dual integrado en el cromosoma, una cepa en la que los gusanos se contaron manualmente con un microscopio estereoscópico. El número de gusanos se correlacionó con el volumen dispensado con un valor de R cuadrado de 0,94 y un valor de p menor a 0,0001. Esto indica que la cantidad de gusanos dispensados en cada pocillo puede controlarse ajustando el volumen dispensado.La fluorescencia total de GFP por pocillo mostrada a la izquierda y la fluorescencia de RFP por pocillo mostrada a la derecha es altamente reproducible de un pocillo a otro en toda una placa de 3 84 pocillos en estas figuras. Las XS indican la fluorescencia relativa medida en cada pocillo. Las líneas continuas indican las medias y las líneas discontinuas indican tres desviaciones estándar por encima o por debajo de la media de fluorescencia de todos los pocillos, con un coeficiente de variación inferior al 9 %. Como se muestra en esta figura, la fluorescencia de GFP del promotor GST cuatro está linealmente correlacionada con la fluorescencia de RFP del promotor DOP tres en 3 84 pocillos, con un valor de R cuadrado de 0,62 y un valor p menor de 0,0001.Por lo tanto, el reportero RFP no inducible puede utilizarse para normalizar el reportero GFP inducible. Cuando se expresa, la relación de la fluorescencia GFP respecto a RFP se vuelve altamente reproducible de pocillo a pocillo en toda una placa de 384 pocillos.El cálculo de la relación entre GFP y RFP redujo el coeficiente de variación por debajo del 6 %, lo que demuestra la capacidad del reportero de tres promotores DOP con RFP de reducir la variabilidad, tal como se muestra aquí. La inducción de GFP en relación con RFP mediante un xenobiótico activador SK N uno es robusta y altamente reproducible en toda una placa de 384 pocillos; las relaciones medias de fluorescencia relativa de todos los pocillos control y dlo están marcadas con líneas continuas. Tres desviaciones estándar por encima de la media del control y por debajo de la media dlo están marcadas con líneas discontinuas.Una vez dominado, iniciar un cultivo de gusanos puede hacerse en aproximadamente una hora el primer día, incluyendo la recolección y dispensación. La manipulación de gusanos puede realizarse en aproximadamente dos horas si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar con al menos 60.000 gusanos y mantenerlos en suspensión durante la dispensación. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar ensayos con otros, por ejemplo, cepas indicadoras para otras vías inducibles, con el fin de desarrollar moduladores para otras vías tras su desarrollo.Esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en los campos del cribado de alto rendimiento y la biosensibilidad identifiquen rápidamente moduladores de vías de moléculas pequeñas o detecten contaminantes ambientales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar, dispensar y medir cepas fluorescentes de elegans para cribado de alto rendimiento de vías transcripcionales inducibles o para probar múltiples muestras en busca de contaminantes ambientales.

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