Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

Este video demuestra un método para cultivar y dispensar cepas fluorescentes de CL gans para la selección de alta capacidad de bibliotecas químicas o la detección de contaminantes ambientales, con el fin de evaluar el efecto de agentes químicos o ambientales sobre la actividad específica de proteínas. En CL elgan, se preparan primero cultivos bacterianos como alimento para los gusanos y gusanos transgénicos GFP. Se cultivan gusanos sincronizados.

Se recolectan entre 0,5 y 2 millones de gusanos, se lavan y se distribuyen en 3 placas microtituladoras de 84 pocillos. Luego, se añaden moléculas pequeñas de una biblioteca química o muestras de prueba, como agua, alimento o suelo, a los gusanos. Finalmente, se mide la fluorescencia de los gusanos mediante un lector de microplacas.

El análisis de datos de intensidades de fluorescencia revela moléculas pequeñas que modulan vías transcripcionales inducibles o permite la detección de contaminantes ambientales. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los ensayos basados en cultivo celular o in vitro, es que no se perderá tiempo con compuestos que resulten tóxicos o inactivos in vivo. Este método de alto rendimiento puede ayudar a identificar moléculas pequeñas que modulan diversas vías inducibles.

Aunque desarrollamos este método para la selección de alto rendimiento de bibliotecas de moléculas pequeñas, también puede aplicarse a la detección de contaminantes en muestras alimentarias y ambientales. El procedimiento lo demostrará Andrew Dine, técnico de mi laboratorio, y Q long, investigador posdoctoral de mi laboratorio. Prepare con anticipación el alimento bacteriano para los gusanos.

Comience inoculando 500 mililitros de caldo excelente, suplementado con 50 microgramos por mililitro de estreptomicina, con cinco mililitros de e coli OP50 saturado. Coloque el cultivo en un agitador y crezca durante la noche a 37 grados Celsius.

Al día siguiente, divida el cultivo en 10 tubos de 50 mililitros. Luego coloque los tubos en una centrífuga refrigerada y centrifugue a 2.500 RCF durante 20 minutos. Después de la centrifugación, suspenda cada pellet bacteriano en 10 mililitros de medio de crecimiento líquido para nematodos o NGM.

Agite las suspensiones horizontalmente. Utilice un agitador de piso durante 15 minutos para resuspender las bacterias. A continuación, centrifugue el cultivo bacteriano a 2.500 RCF a cuatro grados Celsius durante 20 minutos.

Vierta el NGM y pese el pellet bacteriano. A continuación, agregue un volumen igual de tampón NGM y re suspenda los pellets mediante vortex. Por último, alícuote tres mililitros de la cultura bacteriana re suspendida en tubos de 15 mililitros y almacénelos a menos 20 grados Celsius hasta que sean necesarios.

En esta demostración, se medirá el efecto del estrés inducido por Xeno Duke loan sobre el factor de transcripción Sskn one como ejemplo. Se sabe que Sskn one activa genes citoprotectores durante el estrés oxidativo y xenobiótico. Se prepara un cultivo a gran escala de la línea Trenchgenic c gans VP 5 96, que porta dos constructos fluorescentes.

Los gusanos VP 5 96 expresan tanto el promotor GST cuatro que dirige la GFP, el cual se utiliza para monitorear la actividad del factor de transcripción Sskn uno, como el promotor DOP tres que dirige la RFP, la cual se utiliza como estándar para la normalización del número de gusanos.

DOP tres es el promotor de un receptor de dopamina y se expresa constitutivamente en neuronas a lo largo del cuerpo. En el ejemplo, dado que el xenobi lón activa fuertemente sskn uno y aumenta la cantidad de GFP expresada desde el promotor GS T cuatro, para preparar los cultivos comience combinando 150 mililitros de tampón N NGM, 1,5 mililitros de LB 150, microlitros de colesterol uno molar y 75 microlitros de estreptomicina 100 miligramos por mililitro. La adición de LB ayuda a evitar que los gusanos se adhieran al material de vidrio y plástico, pero esta cantidad no es suficiente para sostener el crecimiento bacteriano.

Filtre para esterilizar la mezcla, luego transfiera el filtrado a un matraz estéril de un litro y deje el matraz apartado para liberar los huevos de los gusanos adultos GR. Lave las bacterias de los gusanos centrifugándolos y reemplazando el medio NGM hasta que el sobrenadante esté claro. Lave los gusanos una segunda vez resuspendiéndolos en agua estéril, centrifugue nuevamente siguiendo la centrifugación.

Retire el sobrenadante y llene el tubo con 3,75 mililitros de agua estéril. Añada un mililitro de lejía doméstica y 250 microlitros de hidróxido de sodio 10 normal, mezclando inmediatamente mediante inversión cinco a seis veces. Coloque el tubo en un rotador después de que los gusanos hayan estado expuestos a la lejía durante cuatro minutos.

Coloque el tubo bajo un microscopio estereoscópico. La mayoría de los adultos deberían estar muertos. Agite el tubo vigorosamente de 15 a 20 veces para ayudar a eliminar cualquier gusano adulto restante después de que haya ocurrido la lisis. Después de un total de cinco minutos, agregue agua estéril hasta llenar el tubo.

Mezcle mediante inversión cinco a seis veces para recolectar los huevos. Centrifugue el tubo durante un minuto a 500 RCF. Lave los huevos tres veces mediante Resus, suspendiéndolos en 10 mililitros de agua estéril, centrifugando y eliminando el sobrenadante.

A continuación, diluya una muestra de 100 microlitros de los huevos 100 veces añadiendo 10 mililitros de tampón NGM. Luego, pipetee tres alícuotas de cinco microlitros sobre la tapa de una placa de Petri bajo un microscopio. Cuente el número de huevos en tres alícuotas separadas de cinco microlitros.

Para estimar el número total de huevos, agregue de 200 000 a 2 millones de huevos al matraz con tampón NGM y agite el cultivo a 100 rpm a 20 grados Celsius. Al menos 16 horas después de haber agregado los huevos al matraz, use una pipeta serológica estéril para retirar aproximadamente 0,5 mililitros del cultivo de gusanos en suspensión.

Coloque tres gotas de cinco microlitros sobre la tapa estéril de una placa de Petri. Coloque la tapa en un congelador a menos 20 grados durante uno o dos minutos para paralizar los gusanos una vez que hayan sido paralizados. Cuente el número promedio de gusanos vivos eclosionados por cada cinco microlitros utilizando un microscopio estereoscópico para estimar el número total.

Deshiele la cultura bacteriana congelada de OP 50 preparada anteriormente colocándola sobre la mesa durante unos minutos. Luego agregue tres mililitros de OP 50 al 50% por cada 500.000 gusanos eclosionados. Agite el matraz a 100 RPM a 20 grados Celsius.

Los gusanos se desarrollarán hasta larvas L4 y estadios de adultos jóvenes en aproximadamente 51 horas. Monitoree la cantidad de bacterias durante toda la incubación mediante inspección visual. Añada más bacterias si el medio se vuelve transparente.

Utilice una pipeta serológica estéril para transferir aproximadamente 0,5 mililitros de la cultura de gusanos suspendida a una placa estándar de agar NGM. Observe los gusanos con un microscopio estereoscópico para asegurarse de que la mayoría sean larvas L4 y adultos jóvenes mediante microscopía de campo claro; las larvas L4 tendrán un punto claro ventral en la mitad del cuerpo. Los adultos jóvenes serán ligeramente más grandes y no tendrán un punto claro.

A continuación, aspire el cultivo de gusanos hacia tubos estériles de 50 mililitros. Coloque los tubos en una gradilla para tubos de ensayo dentro de la cabina de seguridad y déjelos reposar para que sedimenten los huevos no eclosionados o los gusanos que no se han desarrollado. Estos sedimentan más lentamente que los gusanos desarrollados.

Después de 10 minutos, retire el sobrenadante, que contiene gusanos no eclosionados y no desarrollados, mediante aspiración, agregando aproximadamente 10 mililitros de tampón NGM a cada precipitado y suspendiendo los gusanos girando suavemente los tubos. Recopile todos los gusanos en un solo tubo de 50 mililitros. Centrifugue en una centrífuga con rotor de balanceo a 500 RCF durante 30 segundos.

Luego, resuspenda los gusanos en 50 mililitros de NGM con 1% de lb para lavarlos. Repita este paso, lavando de tres a cuatro veces para eliminar las bacterias después del lavado. Llene el tubo con NGM más tampón LB hasta 50 mililitros.

Vierta esto en un matraz dispensador personalizado para gusanos con un agitador magnético y colóquelo en una placa agitadora. Se necesita un mínimo de aproximadamente 20 mililitros o 60.000 gusanos para llenar el espacio muerto del matraz dispensador y del cartucho dispensador. Cuente el número de gusanos en tres gotas de cinco microlitros como se mostró previamente.

Después de contar en NGM más LB hasta una concentración de 12 a 15 gusanos por gota de cinco microlitros, cada placa de 84 pocillos requiere aproximadamente 35.000 gusanos o 11,5 mililitros de gusanos en suspensión. Coloque un cassette dispensador de 10 microlitros en el dispensador y esterilícelo mediante cebado con etanol al 70 %. Enjuague el etanol cebando con agua estéril.

Introduzca el extremo del casete de dispensación en el matraz de manera que quede justo por encima de la barra de agitación sin interrumpir su movimiento. Asegúrese de que los gusanos permanezcan en suspensión durante todo el matraz. Programe el dispensador para dispensar gusanos a baja velocidad con dos pulsos previos de cebado y procese al menos 10 mililitros de gusanos en suspensión.

Llene rápidamente las placas de microtitulación, que ya deben contener los compuestos de prueba, para evitar que los gusanos se asienten en el tubo. Aquí el compuesto de prueba previamente cargado en la placa de microtitulación es Due.Glow. Selle las placas con cinta permeable para evitar que el polvo se acumule en los pocillos.

Coloque las placas sobre una plataforma agitadora en un incubador a la temperatura adecuada para el ensayo. No apile las placas, ya que esto puede restringir el flujo de aire. Coloque la placa objetivo en un lector de microplacas para medir la intensidad de fluorescencia de cada pocillo con las longitudes de onda de emisión y excitación adecuadas aquí.

Los filtros utilizados para GFP son excitación a 485 y emisión a 528. Los filtros para RFP son excitación a 540 y emisión a 590. Después de leer la placa, calcule la relación entre GFP y RFP y normalice con las lecturas de los pocillos control, que no contienen el compuesto activador, para determinar la diferencia exacta de veces en la intensidad de fluorescencia derivada de los tratamientos individuales.

El ensayo SSKN mostrado aquí utiliza un reportero dual integrado en el cromosoma, una cepa en la que los gusanos se contaron manualmente con un microscopio estereoscópico. El número de gusanos se correlacionó con el volumen dispensado con un valor de R cuadrado de 0,94 y un valor p menor a 0,0001. Esto indica que la cantidad de gusanos dispensados en cada pocillo puede controlarse ajustando el volumen dispensado.

La fluorescencia total de GFP por pocillo mostrada a la izquierda y la fluorescencia de RFP por pocillo mostrada a la derecha es altamente reproducible de un pocillo a otro en toda una placa de 3 84 pocillos en estas figuras. Las XS indican la fluorescencia relativa medida en cada pocillo. Las líneas continuas indican las medias y las líneas discontinuas indican tres desviaciones estándar por encima o por debajo de la media de fluorescencia de todos los pocillos, con un coeficiente de variación inferior al 9 %. Como se muestra en esta figura, la fluorescencia de GFP del promotor GST cuatro está linealmente correlacionada con la fluorescencia de RFP del promotor DOP tres en 3 84 pocillos, con un valor de R cuadrado de 0,62 y un valor p inferior a 0,0001.

Por lo tanto, el reportero RFP no inducible puede utilizarse para normalizar el reportero GFP inducible. Cuando se expresa, la relación de fluorescencia GFP respecto a RFP se vuelve altamente reproducible de pocillo a pocillo en toda una placa de 384 pocillos.

El cálculo de la relación entre GFP y RFP redujo el coeficiente de variación por debajo del 6 %, lo que demuestra la capacidad del reportero de tres promotores DOP con RFP de reducir la variabilidad, tal como se muestra aquí. La inducción de GFP en relación con RFP mediante un xeno biótico activador SK N uno es robusta y altamente reproducible en toda una placa de 3 84 pocillos; las relaciones medias de fluorescencia relativa de todos los pocillos control y dlo están marcadas con líneas continuas. Tres desviaciones estándar por encima de la media del control y por debajo de la media dlo están marcadas con líneas discontinuas.

Una vez dominado, iniciar un cultivo de gusanos puede realizarse en aproximadamente una hora el primer día, incluyendo la recolección y dispensación. La manipulación de gusanos puede completarse en unas dos horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar con al menos 60.000 gusanos y mantenerlos en suspensión durante la dispensación. Siguiendo este protocolo, se pueden realizar cribados con otros, por ejemplo, cepas reporteras para otras vías inducibles, con el fin de desarrollar moduladores para otras vías tras su desarrollo.

Esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en los campos del cribado de alto rendimiento y la biosensibilidad identifiquen rápidamente moduladores de vías de moléculas pequeñas o detecten contaminantes ambientales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar, dispensar y medir cepas fluorescentes de elegans para cribado de alto rendimiento de vías transcripcionales inducibles o para probar múltiples muestras en busca de contaminantes ambientales.