Name: Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Aprende a cultivar y dispensar cepas fluorescentes de C. elegans para cribado de alto rendimiento y detección de contaminantes ambientales. Este método utiliza reportadores duales GFP y RFP para cuantificar cambios en la expresión génica en vivo con alta reproducibilidad.

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C. elegans transgénicos fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis (Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN). Este trabajo fue apoyado por el NIH R21 conceder NS0667678-01 a KS. Todos los autores participaron en la recolección, análisis e interpretación de datos. CKL, KS, y KPC participaron en la redacción y revisión del manuscrito.

1. Preparación de comida de gusanos bacteriana Día 1 <ol><li> Añadir 5 ml de grasa saturada E. coli OP50 cultivo bacteriano a 500 ml de caldo fabuloso suplementado con 50 mg / ml de estreptomicina y crecer en una incubadora de agitación (225 rpm) durante la noche a 37 ° C. </li></ol> Día 2 <ol start="2"><li> Dividir el cultivo de bacterias durante la noche en diez tubos de 50 ml y bacterias centrífuga en una centrífuga refrigerada a 2.500 rcf durante 20 minutos. </li><li> Decantar el caldo LB y resuspender cada sedimento bacteriano en 10 ml de líquido de los medios de comunicación nematodo crecimiento (NGM). Agitar horizontalmente en el suelo agitador durante 15 minutos para volver a suspender las bacterias. Para hacer buffer NGM, añadir 3 g de NaCl en 1 l de agua desionizada y autoclave. Enfriar a 55 ° C y añadir con el fin de las siguientes soluciones estériles: 1 ml de 1 M de CaCl 2, 1 ml de 1 M MgSO 4, y 25 ml de 1 M de fosfato de potasio, pH 6,0. </li><li> Centrifugar el cultivo bacteriano en una centrífuga refrigerada a 2500 rcf durante 20 minutos. </li><li> Decantar buffer NGM y pesar el sedimento bacteriano. </li><li> Añadir un volumen igual de tampón de NGM para volver a suspender las pastillas, alícuota de 3 ml de bacterias se concentran en tubos de 15 ml y almacenar a -20 ° C. </li></ol> 2. A gran escala C. elegans de cultivo líquidos Nosotros usamos una línea transgénica VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [dop-3:: RFP]) con dos construcciones fluorescentes: Pgst -4:: GFP 14 para controlar SKN-1 actividad y PDOP 3:: PP 17 para servir como un estándar para la normalización del gusano número. Día 1 <ol><li> Mezclar 150 ml NGM buffer, 1,5 ml de caldo de LB, 150 l de 5 mg / ml de colesterol (en etanol), y 75 l de 100 mg / ml de estreptomicina. Filtro a esterilizar la mezcla y añadir a un frasco estéril de 1 litro. NOTA: Agregar 1% caldo de LB para amortiguar NGM ayuda a evitar que los gusanos se pegue a la cristalería y utensilios de plástico, pero esta cantidad no es suficiente para apoyar el crecimiento de bacterias. </li><li> Sincronizar los gusanos con el procedimiento estándar de hipoclorito de 18 años. Hasta 0,5 ml de gusanos grávidos pueden ser procesados ​​en un tubo de 15 ml solo con 5 ml de solución de hipoclorito (3,75 ml de agua estéril, 1 ml de lejía de uso doméstico, y 250 l de NaOH 10 N). Lavado de los óvulos liberados con agua estéril y se resuspenden en 10 ml de solución tampón NGM. </li><li> Diluir una muestra de los huevos de 100 veces en NGM tampón (por ejemplo, 100 l en 10 ml) y contar el número de huevos en tres separadas 5 alícuotas. Varios el número promedio de 200.000 (100 x factor de dilución 2000) para estimar el número total de huevos. </li><li> Agregar 200.000 a 2 millones de huevos en el matraz con tampón NGM y agitar la cultura a 100 rpm a 20 ° C. </li></ol> Día 2 <ol start="5"><li> Por lo menos 16 horas después de añadir los huevos en el matraz, utilice una pipeta serológica estéril para retirar aproximadamente 0,5 ml de la lombricultura en suspensión. Pipeta de 5 gotas tres l en la tapa estéril de una placa de Petri. Coloque la tapa en un congelador a -20 ° C durante 1-2 minutos para paralizar los gusanos. Cuente el número promedio de gusanos vivos nacidos por cada 5 l, y luego varios en 30.000 (150 ml / 5 l) para estimar el número total de gusanos nacidos. </li><li> Descongelar un tubo de congelados OP50 cultivo bacteriano (Protocolo 1.6) y añadir 3 ml de 50% OP50 en la cultura del gusano por cada 500.000 nacidos gusanos. Agitar el matraz a 100 rpm a 20 ° C. Los gusanos se convierten en larvas L4 y adultos jóvenes en aproximadamente 51 horas. El OD600 de bacterias debe ser cerca de 2.200 desde el principio. Controlar la cantidad de bacterias mediante la absorción y añadir más si el OD 600 cae por debajo de 0.900. </li></ol> 3. Gusano de recogida y distribución Día 4 <ol><li> Use una pipeta serológica estéril para la transferencia de aproximadamente 0,5 ml de la cultura del gusano suspendido sobre una placa de agar NGM estándar. Ver los gusanos con un microscopio estereoscópico para asegurarse de que la mayoría son larvas L4 y adultos jóvenes. L4 larvas tienen una mancha ventral claro en la parte media del cuerpo. Los adultos jóvenes será un poco más grande y no tendrá un lugar despejado. </li><li> Vierta la lombricultura en el estéril tubos de 50 ml y se colocan los tubos en un bastidor de tubo de ensayo en el laboratorio. Permita que los gusanos que conformarse con unos 10 minutos. Eliminar el sobrenadante por aspiración o la pipeta. NOTA: Este paso puede ser importante para eliminar los huevos no eclosionados o gusanos que no se desarrolló debido a que se asentarán más lento que larvas L4 y adultos jóvenes. </li><li> Recoge todos los gusanos en un solo tubo de 50 ml y lavar con buffer NGM con caldo de LB 1% (NGM LB +) 3-4 veces para eliminar las bacterias. NOTA: Esto se hace mejor en una centrífuga de balanceo de cubo mediante la recopilación de los gusanos a 500 rcf durante 30 segundos y reemplazar el sobrenadante con frescos NGM + tampón LB. </li><li> Después del lavado, llenar el tubo con NGM + tampón LB a 50 ml y se vierte en un frasco de gusano personalizado de dosificación. Agregar una barra de poca agitación y revuelo para mantener a los gusanos en suspensión. Conde ªnúmero de gusanos de correo en tres 5 gotas l como se indica más arriba. Diluir con NGM LB + hasta llegar 12-15 gusanos por 5 gota l (~ 2.5-3.0 gusanos / l). NOTA: Un mínimo de 20 ml (60.000 gusanos) que se necesita para llenar el espacio muerto del frasco dispensador y dispensador de cinta. Cada placa de 384 y requiere cerca de 35.000 gusanos o 11,5 ml de suspensión gusanos. </li><li> Cargar un casete de 10 l de dosificación y esterilizar cebado con etanol al 70%. Enjuague el etanol mediante cebado con agua estéril. </li><li> Inserte el extremo de la cinta de distribución en el matraz de manera que es justo por encima de la barra de agitación sin interrumpir su movimiento. Asegúrese de que los gusanos permanecen suspendidas en todo el frasco entero. Programa del dispensador para dispensar a baja velocidad con dos pre-pulsos. Primer y ejecutar al menos 10 ml de suspensión gusanos. Llenar las placas, según sea necesario con rapidez para evitar que los gusanos se asiente en el tubo. </li><li> Sellar las placas con cinta adhesiva transpirable. </li><li> Coloque las placas en una plataforma de agitación en una incubadora a la temperatura adecuada para su análisis. No apile los platos. </li></ol> 4. El análisis de fluorescencia <ol><li> Coloque la placa de destino en un lector de microplacas para medir la intensidad de la fluorescencia de cada pozo con la longitud de onda apropiada de emisión y excitación (Filtros para nuestro ensayo: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em). </li><li> Calcular la proporción de GFP / RFP y normalizar las lecturas de los pozos de control (sin compuesto activador) para determinar la diferencia exacta de veces la intensidad de fluorescencia derivado de los tratamientos individuales. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Nuestra SKN-1 ensayo utiliza una cepa integrado cromosómicamente reportero dual (VP596). Como se muestra en la Figura 1, el número de gusanos se correlaciona bien con el volumen dispensado. Como se muestra en 2A y 2B, el total de las buenas prácticas agrarias y RFP cifras por fluorescencia y es altamente reproducible de un pozo a través de una placa de 384 pocillos. Como se muestra en la Figura 2C, sin inducida Pgst-4: la fluorescencia de GFP es linealmente correlacionada con PDOP-3:: Solicitud de Propuestas a través de 384 pozos. Cuando se expresa como una relación de buenas prácticas agrarias / RFP, la fluorescencia se convierte en altamente reproducible de un pozo a través de una placa de 384 pocillos (comparar el coeficiente de variación de la figura 2D a 2A) que demuestran la capacidad de la DPS-3:: reportero RFP para reducir la variabilidad. Como se muestra en la figura 3, la inducción de las buenas prácticas agrarias en relación a la RFP con un SKN-1 activar xenobióticos (38 M juglone) es sólido y altamente reproducible a través de una placa de 384 pocillos. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. El número de gusanos en función del volumen dispensado. Los gusanos se diluyeron hasta aproximadamente 2/μl y se distribuye en una placa de 24 pocillos para el conteo manual con un microscopio estereoscópico. N = 8 pozos por unidad de volumen. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fluorescencia total de gusanos se distribuye en una placa de 384 y es reproducible. Los gusanos se diluyeron a l aproximadamente 2.5/μl y 30 se distribuye en cada pocillo de una placa de 384 pocillos. GFP (A) y el PP (B) de fluorescencia de todos los pozos tenían un coeficiente de variación por debajo del 9%. (C) la fluorescencia de GFP está altamente correlacionada con la RFP de fluorescencia. (D) Cálculo de la relación de las buenas prácticas agrarias para reducir RFP el coeficiente de variación por debajo de 6% (A, B y D) Las líneas continuas indican los medios y las líneas discontinuas indican tres desviaciones estándar por encima o por debajo de la media. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 La activación de Pgst-4:: GFP es robusta y consistente. Aproximadamente el 75 L4 gusanos fueron dispensadas en los pocillos de una placa de 384 pozos y 38 juglone M se añadió en cada columna. Las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia se midió a las 21 h de incubación. La media de ratios de fluorescencia relativa de todo control (1,0) y juglone pozos (8,9) están marcados con líneas continuas. Tres desviaciones estándar por encima de la media de control y por debajo de la media juglone están marcados con líneas discontinuas.

<ol><li>Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-throughput+screen+identifies+inhibitors+of+the+Schistosoma+mansoni+redox+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade.</a> PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).</li>
<li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+small+animal+models%2C+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li>
<li>Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+a+versatile+platform+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery.</a> Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).</li>
<li>WormBase [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbase.org">http://www.wormbase.org</a> (2012).</li>
<li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).</li>
<li>Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WD40+repeat+protein+WDR-23+functions+with+the+CUL4%2FDDB1+ubiquitin+ligase+to+regulate+nuclear+abundance+and+activity+of+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).</li>
<li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide-responsive+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).</li>
<li>Tullet, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+inhibition+of+the+longevity-promoting+factor+SKN-1+by+insulin-like+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans.</a> Cell. 132, 1025-1038 (2008).</li>
<li>Oliveira, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-adapted+stress+and+longevity+gene+regulation+by+Caenorhabditis+elegans+SKN-1%2FNrf%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf.</a> Aging Cell. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8, 258-269 (2009).</li>
<li>Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+chemoprevention+mechanisms+mediated+through+the+Keap1-Nrf2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway.</a> Antioxid Redox Signal. , (2010).</li>
<li>Kwak, M. K., Kensler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+NRF2+signaling+for+cancer+chemoprevention%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).</li>
<li>Leiser, S. F., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+signaling%2C+a+mechanism+for+cellular+stress+resistance+in+long-lived+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice.</a> Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).</li>
<li>Link, C. D., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+transgenes+for+study+of+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).</li>
<li>Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1%2FNrf2+inhibits+dopamine+neuron+degeneration+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+methylmercury+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity.</a> Toxicol Sci. , (2010).</li>
<li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+inexpensive+method+to+screen+for+common+foods+that+reduce+the+action+of+acrylamide%2C+a+harmful+substance+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food.</a> Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).</li>
<li>Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+extrasynaptic+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).</li>
<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%2C+a+Practical+Guide%22">C. elegans, a Practical Guide</a>. , Oxford University Press. (2005).</li>
<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).</li>
</ol>

Se presenta un método para cultivar y distribuir grandes cantidades de nematodos transgénicos. El equipo utilizado para el cultivo de lombrices es el estándar para los laboratorios que realizan la clonación molecular y el manejo de líquidos y el equipo de fluorescencia es el estándar para los laboratorios de procesamiento de un gran número de microplacas. Otros métodos de dispensación de un gran número de vivir C. elegans requieren partículas caro equipo de clasificación 19. El Pgst-4: ensay...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> LB caldo </td><td> Investigación de Productos International Corp. </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Excelente caldo de </td><td> Investigación de Productos International Corp. </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ HT Multi-modo de lector de microplacas </td><td> BioTek </td><td></td><td> Filtros: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Seleccione dispensador </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gusano de dispensación frasco </td><td> El sur de Scientific Inc., Micanopy, FL </td><td></td><td> Costumbre montado (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 microplacas </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Cinta de sellado transpirable </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-hidroxi-p-naphthoqinone) juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone se disuelve en DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans transgénicos cepa </td><td> Autor de laboratorio </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP y PDOP 3:: SDP </td></tr></tbody></table>

selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con c. elegans las cepas

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Selección de alto rendimiento (HTS) es un poderoso método para la identificación de moduladores químicos de los procesos biológicos. Sin embargo, muchos de los compuestos identificados en las pantallas usando modelos de cultivo celular se encuentran a menudo que son tóxicos o inactivos farmacológicamente in vivo 1-2. Proyección en modelos animales todo puede ayudar a evitar estos escollos y agilizar el camino hacia el desarrollo de fármacos. C. elegans es un organismo multicelular modelo muy adecuado para HTS. Es pequeño (&lt;1 mm) y puede ser económicamente culta y se distribuye en los líquidos. C. elegans es también uno de los modelos animales más manejables experimentalmente que permitan la identificación rápida y detallada de las drogas el modo de acción 3. Se describe un protocolo para el cultivo y distribución de las cepas fluorescentes C. elegans para la selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas o detección de contaminantes ambientales que alteran la expresión de un gen específico. Un gran número de gusanos de desarrollo sincronizado en un cultivo líquido, cosecha, lavado, y suspendió a una densidad definida. Los gusanos se añaden al negro, de fondo plano placas de 384 pocillos con un dispensador de líquidos peristáltica. Las moléculas pequeñas de una biblioteca de química o de las muestras de ensayo (por ejemplo, agua, alimentos o suelo) se pueden añadir a los pozos con los gusanos. En vivo y en tiempo real la intensidad de fluorescencia se mide con un lector de microplacas de fluorescencia. Este método se puede adaptar a cualquier gen inducible en C. elegans para que un periodista adecuados. Estrés inducible muchas vías de desarrollo y de la transcripción están bien definidos en C. elegans y las buenas prácticas agrarias reportero cepas transgénicas ya existen en muchos de ellos 4. Cuando se combina con los reporteros transgénicos corresponda, nuestro método puede ser utilizado para la detección de moduladores de la vía o el desarrollo de sólidas pruebas de biosensor de contaminantes ambientales. Demostramos nuestro C. elegans la cultura y el protocolo de dispensación con un ensayo HTS que hemos desarrollado para controlar el C. factor de transcripción collar &#39;n&#39; elegans tapa SKN-1. SKN-1 y su homólogo de mamíferos Nrf2 activar genes citoprotectores durante el estrés oxidativo y 10.5 xenobióticos. Nrf2 protege a los mamíferos a partir de numerosos trastornos relacionados con la edad como el cáncer, neurodegeneración y la inflamación crónica y se ha convertido en un importante objetivo de la quimioterapia 11-13. Nuestro análisis se basa en un reportero GFP transgénicos para la SKN-1 del gen objetivo -4 gst 14, que codifica un 6 glutatión-s-transferasa. El periodista gst -4 es también un biosensor para los productos químicos xenobióticos y de oxidación, que activan SKN-1 y se puede utilizar para detectar bajos niveles de contaminantes tales como la acrilamida y el metil-mercurio 15-16.

Un procedimiento de cultivo a base de líquido y dispensación de<em&gt; C. elegans</em&gt; Cepas que expresan proteínas fluorescentes reportero se describe que no requiere de equipos de selección caro. Este enfoque puede aplicarse a numerosas inducible<em&gt; C. elegans</em&gt; Genes para la detección de drogas o biosensores de contaminantes.

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

El cribado de alto rendimiento (HTS) es un enfoque potente para identificar moduladores químicos de procesos biológicos. Sin embargo, muchos de los compuestos identificados en...

Este video demuestra un método para cultivar y dispensar cepas fluorescentes de CL gans para el cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas o la detección de contaminantes ambientales, con el fin de evaluar el efecto de agentes químicos o ambientales sobre la actividad de proteínas específicas. En CL elgan, primero se preparan cultivos bacterianos como alimento para los gusanos y gusanos transgénicos GFP. Se cultivan gusanos sincronizados.Se recolectan entre 0,5 y 2 millones de gusanos, se lavan y se distribuyen en 3 placas microtituladoras de 84 pocillos, luego se añaden moléculas pequeñas de una biblioteca química o muestras de prueba, como agua, alimento o suelo, a los gusanos. Finalmente, se mide la fluorescencia de los gusanos mediante un lector de microplacas.El análisis de datos de intensidades de fluorescencia revela moléculas pequeñas que modulan vías transcripcionales inducibles o permite la detección de contaminantes ambientales. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los ensayos basados en cultivo celular o in vitro, es que no se perderá tiempo con compuestos que resulten tóxicos o inactivos in vivo. Este método de alto rendimient

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Investigación

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Biología

Se describe un método sensible para identificar a los reguladores postembrionario de expresión de la proteína y su localización...

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Fuente: Anderson, Q. L. et al. Un patosistema de C. elegans de alto rendimiento, alto contenido y base líquida. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra un método de detección de alto rendimiento que utiliza Caenorhabditis elegans para estudiar las eliminaciones de genes durante las interacciones huésped-patógeno. Describe el procedimiento para preparar gusanos derribados y transferirlos a placas de ensayo para evaluar los efectos de la muerte de gusanos inducida por patógenos.

Un ensayo multipocillo basado en líquido para la detección de derribos de C. elegans

Fuente: Ali, I., et al. Cribado de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demuestra un ensayo fluorescente de alto rendimiento para evaluar cómo las bacterias intestinales afectan la resiliencia al estrés en Caenorhabditis elegans. Al rastrear la fluorescencia azul de los gránulos intestinales rotos, el ensayo revela señales de muerte más tempranas en gusanos expuestos a bacterias de prueba.

Ensayo fluorescente de alto rendimiento para estudiar las interacciones microbio-gusano

Un método para evaluar cuantitativamente la respuesta quimiotáctica de...

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Se describe un protocolo para la detección in vivo de los efectos de los inhibidores mitocondriales en el organismo modelo Caenorhabditis elegans y para la identificación de compuestos potenciadores potenciales. Este protocolo se puede utilizar para analizar las bibliotecas de fármacos en busca de compuestos que modulen la función mitocondrial.

Un rastreable<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo para mitocondrial Moduladores Usando transgénico bioluminiscente<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Aquí describimos un protocolo simple para producir rápidamente cientos de agar medios de crecimiento nematodos, placas 96 pocillos con un número constante de Caenorhhabditis elegans por pozo. Estas culturas son útiles para la detección fenotípica de organismos enteros. Nos centramos aquí en el uso de estas culturas a los productos químicos de la pantalla para efectos de Pro-longevidad.

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Aquí se describe un protocolo que es un host adaptable, todo, herramienta de detección de alto contenido que puede ser utilizada para estudiar las interacciones huésped-patógeno y se utiliza para el descubrimiento de medicamentos.

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

Los microbios intestinales pueden afectar positiva o negativamente la salud de su huésped a través de mecanismos específicos o conservados. Caenorhabditis elegans es una plataforma conveniente para detectar tales microbios. El presente protocolo describe el cribado de alto rendimiento de 48 aislados bacterianos para determinar su impacto en la resistencia al estrés de los nematodos, utilizados como sustitutos de la salud de los gusanos.

Detección de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans

Aquí proporcionamos instrucciones sobre cómo utilizar eficazmente SegElegans, un sistema de aprendizaje profundo que desarrollamos para la segmentación automatizada de gusanos individuales en imágenes de microscopía de campo amplio, para su uso posterior en software de análisis de imágenes como ImageJ. Proporcionamos formas de utilizar el sistema tanto en línea como fuera de línea.

Análisis automatizado de imágenes de fluorescencia de C. elegans usando SegElegans

Aprende a cultivar y dispensar cepas fluorescentes de C. elegans para cribado de alto rendimiento y detección de contaminantes ambientales. Este método utiliza reportadores duales GFP y RFP para cuantificar cambios en la expresión génica en vivo con alta reproducibilidad.

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

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