Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

Este video muestra un método para cultivar y dispensar cepas fluorescentes de CL gans para el cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas o la detección de contaminantes ambientales para evaluar el efecto de agentes químicos o ambientales en la actividad de proteínas específicas. En CL elgan, los cultivos bacterianos se preparan primero como alimento para los gusanos y GFP transgénicos. Se cultivan gusanos sincronizados.

A continuación, se recogen, lavan y distribuyen entre 0,5 y 2 millones de lombrices, 3 84. A continuación, se añaden a los gusanos pequeñas moléculas de una biblioteca química o muestras de prueba como agua, alimentos o tierra. Finalmente, se mide la fluorescencia de los gusanos con un lector de microplacas.

El análisis de datos de intensidades de fluorescencia revela moléculas pequeñas que modulan las vías transcripcionales inducibles o permiten la detección de contaminantes ambientales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los ensayos in vitro y basados en cultivos celulares, es que no se perderá tiempo en compuestos tóxicos o inactivos in vivo. Este método de alto rendimiento puede ayudar a identificar moléculas pequeñas que modulan diversas vías inducibles.

Aunque desarrollamos este método para el cribado de alto rendimiento de bibliotecas de moléculas pequeñas, también se puede aplicar a la biodetección de contaminantes en muestras de alimentos y medio ambiente. Andrew Dine, técnico de mi laboratorio, y Q Long, postdoc de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Prepare la comida para lombrices bacterianas con anticipación.

Comience inoculando 500 mililitros de excelente caldo, complementado con 50 microgramos por mililitro de estreptomicina con cinco mililitros de e-coli saturada. OP 50. Coloque el cultivo en una coctelera y crezca durante la noche a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, divida el cultivo en 10 tubos de 50 mililitros. A continuación, coloque los tubos en una centrífuga refrigerada y centrifuga a 2.500 RCF durante 20 minutos. Después del centrifugado Resus, suspenda cada gránulo bacteriano en 10 mililitros de medio de crecimiento líquido de nematodos o NGM.

Agite las suspensiones horizontalmente. Un agitador de suelo durante 15 minutos para resuspender las bacterias. A continuación, centrifugar el cultivo bacteriano a 2.500 RCF a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.

Decantar el NGM y pesar el pellet bacteriano. A continuación, añada un volumen igual de tampón NGM y vuelva a suspender los gránulos mediante vórtice. Finalmente, alícuota tres mililitros del cultivo bacteriano resuspendido en tubos de 15 mililitros y almacenarlos a menos 20 grados centígrados hasta que se necesiten.

En esta demostración, se medirá como ejemplo el efecto del préstamo Xeno Duke inductor de tensión sobre el factor de transcripción Sskn uno. Se sabe que Sskn one activa los genes citoprotectores durante el estrés oxidativo y xenóbico. Se prepara un cultivo a gran escala de la línea de canales trenchgénicos VP 5 96, que lleva dos construcciones fluorescentes.

Los gusanos VP 5 96 expresan tanto el promotor GST cuatro que impulsa la GFP, que se utiliza para monitorear la actividad del factor de transcripción. Sskn uno y el promotor DOP tres conduciendo. RFP se utiliza como estándar para la normalización de números de gusano.

La DOP tres es el promotor de un receptor de dopamina y se expresa constitutivamente en las neuronas de todo el cuerpo. En el ejemplo, dado que el xenobi lon activa fuertemente sskn one y aumenta la cantidad de GFP expresada a partir del promotor GS T cuatro para preparar cultivos se comienza combinando 150 mililitros de tampón N NGM, 1,5 mililitros de LB 150, microlitros de colesterol molar y 75 microlitros de 100 miligramos por mililitro. Estreptomicina. Agregar el LB ayuda a evitar que los gusanos se adhieran a la cristalería y la vajilla de plástico, pero esta cantidad no es suficiente para apoyar el crecimiento bacteriano.

Filtre para esterilizar la mezcla, luego transfiérala a un matraz estéril de un litro y deje el matraz a un lado para liberar los huevos de los gusanos adultos GR. Lave las bacterias de los gusanos centrifugándolos y reemplazando el medio NGM hasta que el supinato esté claro. Lave las lombrices por segunda vez suspendiéndolas en una centrífuga de agua estéril nuevamente después del centrifugado.

Retire el supinato y llene el tubo con 3,75 mililitros de agua estéril. Agregue un mililitro de lejía doméstica y 250 microlitros de 10 hidróxido de sodio normal mezclados inmediatamente por inversión de cinco a seis veces. Coloque el tubo en un rotador después de que las lombrices hayan estado expuestas a la lejía durante cuatro minutos.

Coloque el tubo bajo un microscopio estereoscópico. La mayoría de los adultos deberían ser mentirosos. Agite el tubo vigorosamente de 15 a 20 veces para ayudar a que queden gusanos adultos después de que se haya producido la lisis durante un total de cinco minutos, agregue agua estéril hasta que el tubo esté lleno.

Mezclar por inversión de cinco a seis veces para recoger los huevos. Centrifugar el tubo durante un minuto a 500 RCF. Lavar los huevos tres veces con Resus, doblándolos en 10 mililitros de agua estéril, girando y retirando el supinado.

A continuación, diluya una muestra de 100 microlitros de los huevos 100 veces añadiendo 10 mililitros de tampón NGM. A continuación, pipetee tres alícuotas de cinco microlitros en la tapa de una placa de Petri bajo un microscopio. Cuente el número de huevos en tres alícuotas separadas de cinco microlitros.

Para estimar el número total de huevos. Añadir de 200.000 a 2 millones de huevos al matraz con tampón NGM y agitar el cultivo a 100 RPM a 20 grados centígrados. Al menos 16 horas después de que los huevos se hayan añadido al matraz, se utiliza una pipeta serológica estéril para eliminar aproximadamente 0,5 mililitros del cultivo de lombrices en suspensión.

Pipetee tres gotas de cinco microlitros en la tapa estéril de una placa de Petri. Coloque la tapa en un congelador de menos 20 grados durante uno o dos minutos para paralizar los gusanos una vez que los gusanos se hayan paralizado. Cuente el número promedio de gusanos vivos eclosionados por cinco microlitros con un microscopio estereoscópico para estimar el número total.

Descongele el cultivo bacteriano OP 50 congelado preparado anteriormente colocándolo en un banco durante unos minutos. Luego agregue tres mililitros de 50%OP 50 por cada 500, 000 gusanos eclosionados. Agite el matraz a 100 RPM a 20 grados centígrados.

Los gusanos se desarrollarán en etapas de larvas L cuatro y adultos jóvenes en aproximadamente 51 horas. Controle la cantidad de bacterias a lo largo de la incubación mediante inspección visual. Agregue más bacterias si el medio se vuelve transparente.

Utilice una pipeta serológica estéril para transferir aproximadamente 0,5 mililitros del cultivo de gusanos en suspensión a una placa de agar NGM estándar. Observe los gusanos con un microscopio estereoscópico para asegurarse de que la mayoría son larvas L cuatro y adultos jóvenes bajo microscopía de campo claro, las larvas L cuatro tendrán un punto ventral claro en el centro del cuerpo. Los adultos jóvenes serán un poco más grandes y no tendrán un lugar despejado.

A continuación, coloque el cultivo de lombrices en tubos estériles de 50 mililitros. Coloque los tubos en una rejilla para tubos de ensayo en la campana y permita que se asienten los huevos sin eclosionar o los gusanos que no se desarrollan. Se asientan más lentamente que los gusanos desarrollados.

Después de 10 minutos, retire el supinado, que contiene gusanos sin eclosionar y sin desarrollar, aspirando aproximadamente 10 mililitros de tampón NGM a cada gránulo y suspenda los gusanos girando suavemente los tubos. Recoge todos los gusanos en un solo tubo de 50 mililitros. Gire en la centrífuga de cubo oscilante a 500 RCF durante 30 segundos.

Luego vuelva a suspender los gusanos en 50 mililitros de NGM con 1%lb para lavarlos. Repita esto, lave de tres a cuatro veces para eliminar las bacterias después del lavado. Llene el tubo con tampón NGM plus LB hasta 50 mililitros.

Vierta esto en un matraz dispensador de gusanos personalizado en una barra de agitación y colóquelo en una placa para revolver. Se necesita un mínimo de unos 20 mililitros o 60.000 gusanos para llenar el espacio muerto en el matraz dispensador y el casete dispensador. Cuente el número de gusanos en tres gotas de cinco microlitros como se muestra anteriormente.

Después de contar a NGM más LB a una concentración de 12 a 15 gusanos por gota de cinco microlitros, cada placa de 3 84 pocillos requiere alrededor de 35.000 gusanos o 11,5 mililitros de gusanos en suspensión. Cargue un casete dispensador de 10 microlitros en el dispensador y esterilícelo cebándolo con etanol al 70%. Enjuague el etanol cebándolo con agua estéril.

Inserte el extremo del casete dispensador en el matraz de modo que quede justo por encima de la barra de agitación sin interrumpir su movimiento. Asegúrese de que los gusanos permanezcan suspendidos en todo el matraz. Programe el dispensador para dispensar gusanos a baja velocidad con dos prepulsos cebadores y haga funcionar al menos 10 mililitros de gusanos en suspensión.

Llene rápidamente las placas de microtitulación, que ya deben contener compuestos de prueba, para evitar que los gusanos se asienten en el tubo. Aquí se debe el compuesto de prueba previamente cargado en la placa de microtitulación. Resplandecer. Selle las placas con cinta adhesiva transpirable para evitar que el polvo se acumule en los pozos.

Coloque las placas en una plataforma de agitación en una incubadora a la temperatura adecuada para el ensayo. No apile las placas, ya que esto puede restringir el flujo de aire. Coloque la placa objetivo en un lector de microplacas para medir la intensidad de fluorescencia de cada pocillo con las longitudes de onda de emisión y excitación adecuadas aquí.

Los filtros utilizados para GFP son la excitación a 4 85 y la emisión a 5 28. Los filtros para RFP son excitación a cinco 40 y emisión a cinco 90. Después de leer la placa, calcule la relación entre GFP y RFP y normalice con las lecturas de los pocillos de control, que no contienen el compuesto activador, para determinar la diferencia exacta de pliegue de la intensidad de fluorescencia derivada de los tratamientos individuales.

El ensayo SSKN one que se muestra aquí utiliza un informe dual cromosómicamente integrado, una cepa cuando los gusanos se contaron manualmente con un microscopio estereoscópico. El número de gusanos correlacionados con el volumen dispensado con un valor de R cuadrado de 0,94 y un valor de p inferior a 0,0001. Esto indica que el número de gusanos dispensados en cada pocillo se puede controlar ajustando el volumen dispensado.

La fluorescencia total de GFP por pocillo que se muestra a la izquierda y la fluorescencia RFP por pocillo que se muestra a la derecha es altamente reproducible de pocillo a pocillo a través de una placa de 3 84 pocillos en estas figuras. XS indica la fluorescencia relativa medida en cada pocillo. Las líneas continuas indican las medias y las líneas discontinuas indican tres desviaciones estándar por encima o por debajo de la fluorescencia media de todos los pocillos que tenían un coeficiente de variación inferior al 9%Como se muestra en esta figura, la fluorescencia de GFP del promotor GST cuatro se correlaciona linealmente con la fluorescencia RFP del promotor DOP tres en 3 84 pozos con un valor R cuadrado de 0,62 y un valor p inferior a 0,0001.

Por lo tanto, el reportero RFP no inducible se puede utilizar para normalizar el inducible. Reportero de GFP. Cuando se expresa una relación de GFP sobre RFP, la fluorescencia se vuelve altamente reproducible de pocillo a pocillo a través de una placa de 3 a 84 pocillos.

El cálculo de la relación entre GFP y RFP redujo el coeficiente de variación por debajo del 6%, lo que demuestra la capacidad del reportero de RFP de tres promotores DOP para reducir la variabilidad, como se muestra aquí. La inducción de GFP en relación con RFP con un xenobiótico activador SK N uno es robusta y altamente reproducible en una placa de 3 84 pocillos, las relaciones de fluorescencia relativas medias de todos los pocillos de control y debido GLO están marcadas con líneas sólidas. Tres desviaciones estándar por encima de la media de control y por debajo de la media dlo están marcadas con líneas discontinuas.

Una vez dominado, el inicio de un cultivo de lombrices se puede hacer aproximadamente una hora el primer día y la recolección y dispensación. Un gusano se puede hacer alrededor de dos horas si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento es importante recordar comenzar con al menos 60.000 gusanos y mantenerlos suspendidos mientras se dispensan, siguiendo este procedimiento se pueden realizar pantallas con otros, por ejemplo, se pueden realizar cadenas de informes para otras vías inducibles con el fin de desarrollar moduladores para otras vías después de su desarrollo.

Esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en los campos de cribado de alto rendimiento y biodetección identifiquen rápidamente moduladores de la vía de moléculas pequeñas o detecten contaminantes ambientales. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar, dispensar y medir cepas fluorescentes de elegan para el cribado de alto rendimiento si son inducibles vías transcripcionales o analizar múltiples muestras para detectar contaminantes ambientales.