Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre olfativas nasales de ratas o humanos con el fin de identificar anomalías moleculares o reparar el cerebro afectado por enfermedad o trauma. Esto se logra primero mediante la recolección quirúrgica de biopsias del epitelio olfativo desde la cavidad nasal. A continuación, se elimina el epitelio olfativo y sus células madre epiteliales para centrarse en las células madre ecto mesenquimales presentes en la lámina propia subyacente, y luego se aíslan estas células disociando el tejido de roedores o recolectando las células que migran desde implantes humanos cultivados bajo cubreobjetos de vidrio.

El paso final del procedimiento consiste en cultivar esferas de células madre que induzcan la diferenciación en células semejantes a neuronas. En última instancia, el explante de toda la mucosa olfativa, compuesto por células madre individualizadas, puede utilizarse. Las esferas flotantes o las células semejantes a neuronas pueden emplearse para identificar marcadores moleculares en enfermedades cerebrales o para reparar daños en el sistema nervioso.

Describimos su método para aislar células madre nasales humanas y de roedores a partir de la mucosa olfativa. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que las células madre pertenecen a un tejido nervioso, son fácilmente accesibles en cada individuo vivo y pueden utilizarse para diagnosticar o reparar el cerebro afectado por enfermedades. Como cirujano otorrinolaringólogo, he realizado cientos de biopsias nasales para estudios clínicos interesantes.

El procedimiento es seguro y puede realizarse con anestesia local general. Soy un científico novel con experiencia en el cultivo de células madre humanas o de roedores, nasales o de factores.

Esto presenta una alta tasa de preparación y una tendencia a diferenciarse en tipos celulares neuronales. Se ha demostrado que son eficaces en modelos animales de amnesia y enfermedad neurodegenerativa. Antes de recolectar la mucosa, las biopsias se colocan en placas de Petri de 3 a 35 milímetros con DMEM Ham, medio de cultivo F-12, preparado en una campana de flujo laminar estéril.

Ahora, tras verificar mediante el pellizco en el dedo del pie que la rata ha entrado en anestesia profunda con pentobarbital sódico, sacrificar mediante decapitación. Aislar la cabeza y retirar la piel. Retirar la mandíbula inferior con tijeras y, con la ayuda de su propio jurado, eliminar los músculos faciales en ambos lados comenzando desde la parte posterior de los incisivos.

Utilizando el Ron Jur, retire el hueso que cubre la cavidad nasal un lado a la vez. Los cornetes olfativos aparecen como órganos de color anaranjado o marrón ubicados en la parte posterior de la nariz; deseche delicadamente los cornetes con pinzas.

Utilizando una aguja de calibre 26, aísle la mucosa olfativa que se encuentra en el tabique cortando el tejido a lo largo de tres líneas: el arco de la lámina perpendicular, la placa del CRI y el techo de la cavidad nasal. Recolecte biopsias de ambos lados y transfiéralas a una placa de Petri con medio A-D-M-E-M ham F 12. Este procedimiento no debe tardar más de 10 minutos desde el inicio de la eutanasia.

Ahora, para eliminar el moco, transfiera las biopsias dos veces a placas de Petri llenas de medio de acuerdo con los comités éticos locales pertinentes. Un cirujano otorrinolaringólogo debe realizar este procedimiento y cada paciente ambulatorio debe firmar un formulario de consentimiento informado utilizando un endoscopio rígido de cero grados o de 30 grados. Inspeccione ambas cavidades nasales y evalúe la presencia presunta de pólipos o cualquier lesión inflamatoria.

Seleccione la mejor cavidad nasal teniendo en cuenta la desviación del tabique. Con un aplicador de algodón, aplique un anestésico local como lidocaína con epinefrina durante 10 minutos con un corte transversal. Con fórceps etmoidales, obtenga una biopsia de dos milímetros cuadrados ya sea en la raíz de la cara medial del cornete medio o en el tabique en la zona medial dorsal.

Aquí mostramos la biopsia de la zona de la raíz. Luego, la biopsia olfatoria se transfiere con una aguja estéril a un tubo estéril de dos mililitros que contiene un mililitro de DMEM/F12. Invierta el tubo para asegurarse de que la biopsia quede sumergida en el medio de cultivo.

Introduzca el tubo en un recipiente refrigerado y transpórtelo al laboratorio de investigación. En esta etapa, la biopsia puede utilizarse directamente para estudios moleculares comparativos centrados en enfermedades cerebrales específicas o procesarse para generar células madre. Lave las biopsias humanas o de rata y el DMEM ham F 12, e incube las biopsias en una placa de Petri llena con un mililitro de dis paste.

Dos soluciones durante una hora a 37 grados celsius. A continuación, el epitelio olfatorio humano o de rata se separa de la lámina propia subyacente utilizando una espátula microscópica bajo un microscopio estereoscópico con luz invertida difractada. El epitelio olfatorio es translúcido sobre un fondo negro en comparación con la lámina propia, que presenta rayas de color marrón anaranjado sobre un fondo blanco.

El epitelio se ve gris y la lámina propia marrón una vez purificada; transfiera la lámina propia a una placa de Petri llena con DMEM/F12. Si el tejido proviene de un roedor, corte la lámina propia en pequeños fragmentos utilizando dos agujas de calibre 25. Luego, transfiera los fragmentos a un tubo de 15 mililitros que contenga un mililitro de colagenasa I A en el tubo, usando una pipeta de plástico estéril para disociar el tejido.

Luego, incubar el tubo durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Para finalizar la disociación, agitar suavemente el tubo y añadir mililitros de PBS sin calcio ni magnesio y centrifugar a 200 Gs durante cinco minutos. Suspender, el pellet celular en medio de cultivo y sembrar en placas de cultivo de plástico.

Ahora, si el tejido es humano, corte el limón adecuadamente en tres o cuatro piezas. Introduzca cada tira en su propio pozo de dos centímetros de diámetro en una placa de cuatro pozos y cubra el tejido con láminas de vidrio estériles de 1,3 centímetros de diámetro.

Luego, agregue 500 microlitros de medio de cultivo a cada placa de cultivo, ya sea para el tipo de tejido. Renueve el medio de cultivo cada dos o tres días. Después de cinco a siete días de cultivo, las células madre comenzarán a invadir la placa de cultivo.

Y después de dos semanas, deberían estar confluentes. Cuando se alcance la confluencia, pase y transfiera las células a frascos de cultivo para generar esferas de células madre.

Replique las células a una densidad de 16.000 células por centímetro cuadrado en frascos previamente tratados cada dos días. Alimente las células con 0,2 mililitros por centímetro cuadrado de medio suplementado. De dos a cinco días después, recolecte las esferas de células flotantes y replate o disocie estas antes del injerto.

Un modelo animal de terapia celular para diferenciar las células madre olfativas en células semejantes a neuronas. Cultive las células durante 21 días en medio neurobasal que contenga B27, penicilina, estreptomicina, glutamina y glutamato, y realice cambios de medio cada tres días. Las células semejantes a neuronas deben aparecer entre dos y tres semanas, cinco a siete días después del siembra.

Las células madre olfativas humanas nasales salieron del explante y proliferaron rápidamente. Se podía alcanzar la confluencia en una o dos semanas. Una característica clave de las células madre, la formación de nidos y la expresión, se evaluó cuando crecieron sobre polilisina con un medio de cultivo libre de suero suplementado con EGF y FGF dos; las células madre olfativas dieron lugar a esferoides cuando los esferoides se sembraron en un cultivo que contenía suero.

Medio, dieron lugar a poblaciones celulares que contenían aproximadamente un 50 % de células que expresaban GFAP, hasta un 15 % de células que expresaban tubulina y hasta un 5 % de células que expresaban oh cuatro. Cuando las células derivadas de esferas se cultivaron en medio de cultivo neuro basal suplementado, la mayor parte de la población se convirtió en células semejantes a neuronas que expresaban beta tres tubulina. Las mismas células semejantes a neuronas también expresaban map dos.

Por lo tanto, el destino de las células madre podría modificarse en un semestre. Esta técnica puede generar fácilmente millones de células madre en menos de cuatro semanas, lo que permite a los clínicos realizar futuros trasplantes celulares autólogos. Las biopsias nasales refractarias son muy útiles para identificar biomarcadores y enfermedades cerebrales.

Recientemente hemos tenido éxito al identificar nuevos genes candidatos para el autismo. Ya hemos establecido un banco de células madre olfativas de individuos autistas y controles, y este puede ampliarse a otros trastornos cerebrales humanos.