Name: Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a aislar células madre olfativas nasales de roedores y humanos mediante biopsia de mucosa olfativa. Este método permite identificar anomalías moleculares en enfermedades cerebrales y reparar daños neurológicos.

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Este trabajo fue financiado por la ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Asociación Francesa contra las Miopatías), FEDER en PACA y Irme (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l&#39;Encéphale). Nosotros agradecemos a Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Institute) por su ayuda eficiente durante la grabación de lapso de tiempo.

1. Colección de mucosa olfatoria en ratas <ol><li> Empezar por la elaboración de tres placas de Petri de 35 mm llena de DMEM / HAM F12 medio de cultivo en una campana de cultivo limpio. </li><li> Cualquier método de eutanasia debe ser aprobado previamente por el cuidado de animales de la institución y el uso comisión y llevado a cabo por personal cualificado. Después de la rata ha entrado en una anestesia profunda con el sodio pentobarbital formas inyectables o de otro tipo de anestesia, como la ketamina / xilazina, decapitar y quitar la piel. Anestésicos inhalados deben ser evitados. Adecuación de la anestesia será evaluada por una pizca dedo antes de la decapitación. Retire la mandíbula inferior con unas tijeras y con la ayuda de una gubia, eliminar los músculos faciales en ambos lados. </li><li> A partir de la parte posterior de los incisivos, retire con una gubia del hueso que cubre la cavidad nasal, de un lado a la vez. Los cornetes olfativa entrar en la vista como el naranja / marrón órganos situados en la parte posterior de la nariz. </li><li> Delicadamente descartar los cornetes con una pinza. Usando una aguja de calibre 26, aislar la mucosa olfatoria tendido en el tabique al cortar el tejido a lo largo de tres líneas: el arco de la placa perpendicular, la lámina cribiforme y el techo de la cavidad nasal. </li><li> Recoger las biopsias de ambos lados y la transferencia en un DMEM / HAM F12 lleno de placa de Petri. Este procedimiento no debería tardar más de 10 minutos de la eutanasia inicio. </li><li> Ahora, con el fin de eliminar la mucosidad, la transferencia de las biopsias de dos veces en medio lleno de placas de Petri. </li></ol> 2. Colección de mucosa olfatoria en los seres humanos <ol><li> Este procedimiento debe ser realizado por un Oído, nariz y garganta (ENT), cirujano, de acuerdo con las disposiciones pertinentes de ética local del comité (s), y todos los pacientes ambulatorios deben firmar un formulario de consentimiento informado. </li><li> El uso de un 0 ° o 30 ° endoscopio rígido (4 mm de diámetro), inspeccione ambas cavidades nasales y evaluar la presencia putativa de pólipos o de cualquier lesión inflamatoria. Elige la mejor cavidad nasal, teniendo en cuenta la desviación del tabique. </li><li> Utilizando un aplicador de algodón, aplicar un anestésico local, como la lidocaína con epinefrina, durante 10 minutos. </li><li> Con unas pinzas etmoidal throughcut, se recoge una biopsia de dos milímetros cuadrados, ya sea en la raíz de la cara medial del cornete medio o en el tabique en la zona dorsomedial. </li><li> El olfato biopsia se transfiere, utilizando una aguja estéril, en un tubo estéril de 2 ml llena de 1 ml de DMEM / HAM F12. Punta del tubo hacia abajo para asegurarse de que la biopsia se encuentra inmerso en el medio de cultivo. </li><li> Inserte el tubo en un contenedor refrigerado y transporte al laboratorio de investigación. En esta etapa, la biopsia se puede utilizar por sí mismo para estudios comparados molecular centrado en enfermedades específicas del cerebro o procesados ​​para la generación de células madre. </li></ol> 3. Aislamiento de células madre olfativa de humano y de rata Mucosa <ol><li> Lave las biopsias en DMEM / HAM F12. Incubar las biopsias en una placa de Petri llena con 1 ml de solución dispasa II (2,4 UI / ml), durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> A continuación, en un microscopio de luz invertida con una difracción, el epitelio olfativo se retira de la lámina propia subyacente con una espátula de micro. </li><li> El epitelio olfativo es más delgada y se ve transparente sobre un fondo negro en comparación con la lámina propia, que es a rayas de color naranja / marrón. Sobre un fondo blanco, el epitelio se ve gris y la lámina propia, marrón. </li><li> Una vez purificada, la transferencia de la lámina propia en una placa de Petri llena de DMEM / HAM F12. </li><li> Si el tejido es de un roedor, a continuación, cortar la lámina propia en pequeños trozos con dos agujas de calibre 25. Entonces, la transferencia de las piezas a un tubo de 15 ml llena de 1 ml de colagenasa IA. </li><li> En el tubo, usando una pipeta de plástico estéril, disociar el tejido. A continuación, se incuba el tubo durante 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Para terminar la disociación, agite con cuidado el tubo y agregar 9 ml de Ca-Mg libre y PBS libre y centrifugar a 200 g durante 5 minutos. </li><li> Resuspender el botón celular en DMEM / HAM F12 medio de cultivo complementado con suero bovino fetal al 10%, los antibióticos y la placa en placas de cultivo de plástico. </li><li> Ahora bien, si el tejido es humano, entonces parte de la lámina propia en 3 a 4 piezas con un grosor de entre 200 a 500 micras. </li><li> Insertar cada tira en su propio plato de 2 cm de diámetro y la cultura cubrir el tejido con hojas estériles 1,3 cm de diámetro cubierta de vidrio. </li><li> A continuación, añadir 500 l de medio de cultivo (DMEM / HAM F12 suplementado con suero bovino fetal al 10% y antibióticos) para cada placa de cultivo. </li><li> Para cualquier tipo de tejido, renovar el medio de cultivo cada 2 ó 3 días. </li><li> De cinco a siete días después, las células madre comienzan a invadir la placa de cultivo y después de dos semanas deben ser confluentes. Cuando se llega a la confluencia, la aprobación y la transferencia de las células a frascos de cultivo. </li></ol> 4. Ámbito de formación y difere neuronalntiation olfativo de las células madre <ol><li> Para generar ámbitos de células madre, se incuban los frascos durante dos horas a 37 ° C, con poli-L-lisina. (TEXTO: 5 g/cm2). </li><li> Placa de las células a una densidad de 16.000 células por centímetro cuadrado en los frascos tratados. </li><li> Cada dos días, se alimentan de las células con 0,2 ml por centímetro cuadrado de medio suplementado (DMEM / HAM F12 suplementado con insulina, transferrina, el selenio (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) y FGF2 (50 ng / ml)). </li><li> De dos a cinco días más tarde, recoger esferas flotantes de células y, o bien la placa de re-o se disocian antes de injerto en modelos animales de la terapia celular. </li><li> Para diferenciar las células madre en neuronas olfativas-como las células, las cultivan durante 21 días en un medio que contiene Neurobasal B-27, la penicilina, la estreptomicina, glutamina y glutamato. </li><li> De hacer cambios en el medio cada 3 días. Neuronas como células deben aparecer después de dos a tres semanas. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Nasal humano explante, superando las células madre (Figura 2) se dividen rápidamente y se puede llegar a la confluencia en una o dos semanas. Una característica clave de la troncalidad, nestin expresión, fue evaluado (Figura 2B). Cuando se cultiva en poly-L-lisina con un medio de cultivo libre de suero suplementado con EGF (50 ng / ml) y FGF2 (50 ng / ml), las células olfativas madre dan lugar a las esferas (figura 2C). Cuando se cultiva en medio de cultivo que contiene suero recién esferas plateado dar lugar a células que expresan GFAP (~ 50%), las células que expresan la tubulina (~ 10-15%) y O4, que expresan las células (~ 5.2%) 9 (Figuras 2D-F). Sin embargo, el destino de las células derivadas de esfera puede ser modificada. Por ejemplo, cuando se cultivan en un medio de cultivo Neurobasal complementado con B27 y el glutamato, la mayoría de las células madre en neuronas olfativas nasal-como las células que expresan β-tubulina III (Figura 2 G) y MAP2 (Figura 2H). <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema general del experimento. Biopsias de la mucosa olfativa son extirpados de ratas o de la cavidad nasal humana. Los explantes se puede utilizar por sí mismo para estudios comparativos con el objetivo molecular para identificar los biomarcadores en enfermedades del cerebro. Para aislar las células olfativas del tallo, las interacciones entre la lámina propia y el epitelio neuro-se interrumpió con la enzima dispasa II y, después de 45 minutos, el epitelio se retira con una espátula de micro. Las células madre son roedores olfativo más seleccionados por la disociación de la lámina propia con colagenasa IA. Para los tejidos humanos, pedazos de lámina propia olfatoria son cultivadas en cubreobjetos de vidrio hasta superando las células madre invaden todo bien. Después de la proliferación, utilizando un medio de cultivo adecuado, las células olfativas madre pueden generar esferas o diferenciarse en neuronas como las células. Células olfativas madre se pueden utilizar para: i) las enfermedades de la reparación cerebral o un traumatismo, o ii) la identificación de marcadores moleculares de enfermedades del sistema nervioso. Las ilustraciones están hechas con la ayuda de Servier arte médico. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cultura y la diferenciación de células madre humanas nasales olfativas. Las células madre humanas que surgen de la lámina propia explante (A) se dividen rápidamente, cuando se cultivan en un medio que contiene suero. Las células madre expresan la troncalidad marcador nestina (B). Cuando se siembran en poli-L-lisina de plástico y se cultivan en un medio de cultivo libre de suero complementado con EGF y FGF2, las células olfativas madre generar ámbitos (C). Esfera células derivadas, cuando se siembran en el medio de cultivo que contiene suero, dan lugar a células que expresan GFAP (~ 50%), las células que expresan la tubulina (~ 10-15%) y O4, que expresan las células (~ 2.5%) 9 (DF). Cuando se cultiva en un medio de cultivo Neurobasal complementado con B27 y el glutamato, que se diferencian en neuronas como células que expresan β-tubulina III (G) y MAP2 (H).

<ol><li>Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques+for+biopsy+and+culture+of+human+olfactory+epithelial+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).</li>
<li>Ronnett, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+biopsies+demonstrate+a+defect+in+neuronal+development+in+Rett%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome.</a> Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).</li>
<li>Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+adhesion%2C+proliferation+and+death+in+neural+cultures+from+adults+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia.</a> Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).</li>
<li>Matigian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific%2C+neurosphere-derived+cells+as+models+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders.</a> Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).</li>
<li>Arnold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+epithelium+amyloid-beta+and+paired+helical+filament-tau+pathology+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease.</a> Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).</li>
<li>Boone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+stem+cells%2C+a+new+cellular+model+for+studying+molecular+mechanisms+underlying+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia.</a> PLoS One. , (2010).</li>
<li>McCurdy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+alterations+in+biopsied+olfactory+neuroepithelium+in+schizophrenia+and+bipolar+I+disorder+using+cell+culture+and+gene+expression+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses.</a> Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).</li>
<li>Roisen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+olfactory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Adult human olfactory stem cells.</a> Brain Res. 890, 11-22 (2001).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem+cells+from+adult+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa.</a> Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).</li>
<li>Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+nonepithelial+multipotent+cells+in+the+embryonic+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa.</a> Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).</li>
<li>Delorme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+nose+harbors+a+niche+of+olfactory+ectomesenchymal+stem+cells+displaying+neurogenic+and+osteogenic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties.</a> Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+rescue+axotomized+rodent+rubrospinal+neurons+and+promote+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery.</a> Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+promote+axotomized+rubrospinal+tract+axonal+reinnervation+and+locomotor+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery.</a> Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).</li>
<li>Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li>
<li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia%3A+a+3-year+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las técnicas presentadas aquí hacen los roedores y la mucosa olfativa humana un modelo útil para la investigación clínica sobre las causas de las enfermedades del neurodesarrollo y neurodegenerativos, así como una herramienta para reparar el cerebro patológico o traumatizados. El protocolo es relativamente sencillo y puede ser fácilmente llevados a cabo por un biólogo celular de la experiencia. La tasa de éxito de las técnicas de biopsia y cultivo es alto. Los pasos críticos <ul><li> Para la recogida de la mucosa olfatoria de roedores, se recomienda no exceder un límite de tiempo de 10 minutos entre la eutanasia y la escisión definitiva del tejido olfativo. </li><li> La disociación de la propia lámina de roedores olfativa se logra generalmente después de 10 min. incubación en la colagenasa IA. Si no es así, se recomienda recoger al día siguiente del sobrenadante en el que los bits no disociado de acciones en circulación de la lámina propia, se centrifuga a 200 g y mecánicamente disociar la lámina flotante con una pipeta Pasteur antes de replating las células de un nuevo pozo. El primer pozo que contiene las células ya instalada está llena de medio de cultivo fresco. </li><li> De la lámina propia humana, que es más compacto que el tejido de los roedores, no recomendamos una disociación enzimática. El tejido se corta y cada explante se inserta entre la parte inferior del plato de plástico y un cubreobjetos. Culturas exitosas incluyen explantes cuyo espesor rango 200 a 500 micras. </li></ul> Posibles modificaciones <ul><li> El protocolo actual puede ser ligeramente modificada con el fin de generar neuronas olfativas in vitro. A tal efecto, la neuro-epitelio no se quita y la mucosa olfatoria todo se corta con un helicóptero McIlwain (200 micras de espesor). Cada explante se platea en un plato, parcialmente seco durante una hora y luego rehidratados con medio de cultivo que contienen FCS. Durante el forro días después de la primera, las células epiteliales y mesenquimales surgen de los explantes. Entonces, los progenitores neuronales migrarán en la parte superior de esta capa de células y se diferencian en neuronas. </li><li> Purificación de las células madre olfativa se puede lograr mediante citometría de flujo. Marcadores específicos de superficie puede ser recuperada de la lista publicada en el documento de caracterización 11. </li><li> Para los experimentos de trasplante, es posible utilizar una cepa de ratones cuyas células olfativas madre son las buenas prácticas agrarias-positivas. Esta cepa de rata (Sprague Dawley, eGFP impulsada por el promotor PGK) está disponible en ITERT (Nantes, Francia). Para insertar el gen de la GFP en las células madre olfativa, se utiliza un método basado en la infección por lentivirus. </li><li> Este documento se centra en las células madre olfativa ecto-mesenquimal. Sin embargo, otro tipo de célula de interés, las células olfativas ensheathing, puede purificar a partir del mismo tejido. Se describe un método para su obtención y purificación de 1,17 y se utilizaron las células nasales ensheathing de una fase I / IIa de ensayos clínicos en pacientes parapléjicos 18. </li><li> Como miembro de la superfamilia de las células madre mesenquimales, OE-MSC son capaces, bajo condiciones de cultivo adecuadas, que se diferencian en adipocitos, osteocitos y los miocitos 11. </li></ul> Las futuras aplicaciones <ul><li> Ya hemos utilizado biopsias humanas olfativas para estudiar las anomalías celulares y moleculares en pacientes con autismo, trastorno bipolar, disautonomía familiar, enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia 2.7. En teoría, todas las enfermedades del cerebro pueden ser estudiados usando biopsias nasales o células madre periféricas olfativo. </li><li> Roedores y las células madre olfativo nasal ya han sido injertados en modelos animales de la amnesia, la enfermedad de Parkinson, daño coclear y traumatismo de la médula espinal 12-16. Cabe la posibilidad de trasplantar estas células en modelos animales de enfermedad de Alzheimer, isquemia cerebral, la esclerosis múltiple. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td colspan="3"> Colección de la mucosa olfatoria en ratas </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Pentobarbital sódico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gubia </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26 calibre de la aguja </td><td> Terumo </td><td> NN-2613R </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Colección de la mucosa olfatoria en los seres humanos </td></tr><tr><td> Endoscopio rígido </td><td> Karl Storz o Richard Wolf Médico </td><td></td></tr><tr><td> Lidocaína </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Epinefrina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut etmoidal fórceps </td><td> Karl Storz o Richard Wolf Médico </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Aislamiento de células madre olfativo </td></tr><tr><td> Dispasa II </td><td> Roche </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Espátula de micro </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa IA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> Suero fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio </td><td> Knittel Glaser </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> Ámbito de formación y diferenciación neuronal </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-1274 </td></tr><tr><td> La insulina de transferrina selenio (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> FEAG </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 236-EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td></tr><tr><td> Medio Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B-27 libre de suero Suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Glutamato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr></tbody></table>

aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

La mucosa olfatoria, que se encuentra en la cavidad nasal, se encarga de detectar olores. También es el único tejido nervioso que se encuentra expuesta al ambiente externo y de fácil acceso en todos los individuos que viven. Como resultado, este tejido es único para cualquier persona con el objetivo de identificar las anomalías moleculares en el cerebro patológico o aislar las células madre adultas para la terapia celular. Alteraciones moleculares en las enfermedades cerebrales son estudiados a menudo usando muestras de tejido nervioso recogido post-mortem. Sin embargo, este material tiene numerosas limitaciones. Por el contrario, la mucosa olfativa es de fácil acceso y puede hacer una biopsia de forma segura sin ningún tipo de pérdida del sentido del olfato 1. En consecuencia, la mucosa olfativa ofrece una &quot;ventana abierta&quot; en el adulto humano a través del cual se puede estudiar el desarrollo (autismo, la esquizofrenia, por ejemplo,) 2-4 o neurodegenerativas (como Parkinson, Alzheimer) enfermedades 4,5. Mucosa olfatoria se puede utilizar ya sea para estudios comparativos molecular 4,6 o en experimentos in vitro sobre la neurogénesis 3,7. El epitelio olfativo es también un tejido nervioso que produce nuevas neuronas cada día para reemplazar a aquellos que están dañados por la contaminación, bacterias de infecciones virales. Esta neurogénesis permanente se sustenta por los progenitores, sino también las células madre que residen dentro de los dos compartimientos de la mucosa, es decir, la neuroepithelium y el 10.8 lámina propia subyacente. Recientemente hemos desarrollado un método para purificar las células madre adultas ubicados en la lámina propia y, después de haber demostrado que están estrechamente relacionadas con las células mesenquimales de la médula ósea (BM-MSC), que nombró olfativa ecto-mesenquimal de células madre (OE- MSC) 11. Curiosamente, en comparación con el BM-MSC, OE-MSC mostrar una tasa de proliferación de alto, un clonogenicidad elevado y una inclinación de diferenciarse en células neuronales. Nos aprovechamos de estas características para llevar a cabo estudios específicos para dar a conocer nuevos genes candidatos en la esquizofrenia y la enfermedad de Parkinson 4. Nosotros y otros han demostrado también que la OE-MSC son candidatos prometedores para la terapia celular, después de un traumatismo de la médula espinal 12,13, un daño coclear en un 14 o modelos animales de enfermedad de Parkinson 15 o amnesia 16. En este estudio, se presentan los métodos de biopsia de mucosa olfatoria en ratas y humanos. Después de la recolección, la lámina propia es enzimáticamente separada del epitelio y las células madre se purifican mediante un enzimáticos o un método no enzimático. Purificada de células olfativas madre pueden ser cultivadas en grandes cantidades y en bancos en nitrógeno líquido o inducidas a formar esferas o diferenciarse en células neuronales. Estas células madre también se pueden utilizar para ómicas comparativa (genómica, transcriptómica, epigenómico, proteómica) los estudios.

Se describe aquí un método para la biopsia de mucosa olfatoria de ratas y humanos cavidades nasales. Estas biopsias se pueden utilizar tanto para la identificación de anomalías moleculares en las enfermedades cerebrales o el aislamiento de células madre adultas multipotentes que pueden ser utilizados para el trasplante de células en modelos animales de trauma cerebral / enfermedad

Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

La mucosa olfatoria, ubicada en la cavidad nasal, se encarga de detectar los olores. Es también el único tejido nervioso que está expuesto al exterior...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre olfativas nasales de ratas o humanos con el fin de identificar anomalías moleculares o reparar el cerebro afectado por enfermedad o trauma. Esto se logra primero mediante la recolección quirúrgica de biopsias del epitelio olfativo desde la cavidad nasal. A continuación, se elimina el epitelio olfativo y sus células madre epiteliales para centrarse en las células madre ecto mesenquimales presentes en la lámina propia subyacente, y luego se aíslan estas células disociando el tejido de roedores o recolectando las células que migran desde implantes humanos cultivados bajo cubreobjetos de vidrio.El paso final del procedimiento consiste en cultivar esferas de células madre que induzcan la diferenciación en células semejantes a neuronas. En última instancia, el explante de toda la mucosa olfativa, compuesto por células madre individualizadas, puede utilizarse. Las esferas flotantes o las células semejantes a neuronas pueden emplearse para identificar marcadores moleculares en enfermedades cerebrales o para reparar daños en el sistema nervioso.Describimos su método para aislar células madre nasales humanas y de roedores a partir de la mucosa olfativa. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que las células madre pertenecen a un tejido nervioso, son fácilmente accesibles en cada individuo vivo y pueden utilizarse para diagnosticar o reparar el cerebro afectado por enfermedades. Como cirujano otorrinolaringólogo, he realizado cientos de biopsias nasales para estudios clínicos interesantes.El procedimiento es seguro y puede realizarse con anestesia local general. Soy un científico novel con experiencia en el cultivo de células madre humanas o de roedores, nasales o de factores.Esto presenta una alta tasa de preparación y una tendencia a diferenciarse en tipos celulares neuronales. Se ha demostrado que son eficaces en modelos animales de amnesia y enfermedad neurodegenerativa. Antes de recolectar la mucosa, las biopsias se colocan en placas de Petri de 3 a 35 milímetros con DMEM Ham, medio de cultivo F-12, preparado en una campana de flujo laminar estéril.Ahora, tras verificar mediante el pellizco en el dedo del pie que la rata ha entrado en anestesia profunda con pentobarbital sódico, sacrificar mediante decapitación. Aislar la cabeza y retirar la piel. Retirar la mandíbula inferior con tijeras y, con la ayuda de su propio jurado, eliminar los músculos faciales en ambos lados comenzando desde la parte posterior de los incisivos.Utilizando el Ron Jur, retire el hueso que cubre la cavidad nasal un lado a la vez. Los cornetes olfativos aparecen como órganos de color anaranjado o marrón ubicados en la parte posterior de la nariz; deseche delicadamente los cornetes con pinzas.Utilizando una aguja de calibre 26, aísle la mucosa olfativa que se encuentra en el tabique cortando el tejido a lo largo de tres líneas: el arco de la lámina perpendicular, la placa del CRI y el techo de la cavidad nasal. Recolecte biopsias de ambos lados y transfiéralas a una placa de Petri con medio A-D-M-E-M ham F 12. Este procedimiento no debe tardar más de 10 minutos desde el inicio de la eutanasia.Ahora, para eliminar el moco, transfiera las biopsias dos veces a placas de Petri llenas de medio de acuerdo con los comités éticos locales pertinentes. Un cirujano otorrinolaringólogo debe realizar este procedimiento y cada paciente ambulatorio debe firmar un formulario de consentimiento informado utilizando un endoscopio rígido de cero grados o de 30 grados. Inspeccione ambas cavidades nasales y evalúe la presencia presunta de pólipos o cualquier lesión inflamatoria.Seleccione la mejor cavidad nasal teniendo en cuenta la desviación del tabique. Con un aplicador de algodón, aplique un anestésico local como lidocaína con epinefrina durante 10 minutos con un corte transversal. Con fórceps etmoidales, obtenga una biopsia de dos milímetros cuadrados ya sea en la raíz de la cara medial del cornete medio o en el tabique en la zona medial dorsal.Aquí mostramos la biopsia de la zona de la raíz. Luego, la biopsia olfatoria se transfiere con una aguja estéril a un tubo estéril de dos mililitros que contiene un mililitro de DMEM/F12. Invierta el tubo para asegurarse de que la biopsia quede sumergida en el medio de cultivo.Introduzca el tubo en un recipiente refrigerado y transpórtelo al laboratorio de investigación. En esta etapa, la biopsia puede utilizarse directamente para estudios moleculares comparativos centrados en enfermedades cerebrales específicas o procesarse para generar células madre. Lave las biopsias humanas o de rata y el DMEM ham F 12, e incube las biopsias en una placa de Petri llena con un mililitro de dis paste.Dos soluciones durante una hora a 37 grados celsius. A continuación, el epitelio olfatorio humano o de rata se separa de la lámina propia subyacente utilizando una espátula microscópica bajo un microscopio estereoscópico con luz invertida difractada. El epitelio olfatorio es translúcido sobre un fondo negro en comparación con la lámina propia, que presenta rayas de color marrón anaranjado sobre un fondo blanco.El epitelio se ve gris y la lámina propia marrón una vez purificada; transfiera la lámina propia a una placa de Petri llena con DMEM/F12. Si el tejido proviene de un roedor, corte la lámina propia en pequeños fragmentos utilizando dos agujas de calibre 25. Luego, transfiera los fragmentos a un tubo de 15 mililitros que contenga un mililitro de colagenasa I A en el tubo, usando una pipeta de plástico estéril para disociar el tejido.Luego, incubar el tubo durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Para finalizar la disociación, agitar suavemente el tubo y añadir mililitros de PBS sin calcio ni magnesio y centrifugar a 200 Gs durante cinco minutos. Suspender, el pellet celular en medio de cultivo y sembrar en placas de cultivo de plástico.Ahora, si el tejido es humano, corte el limón adecuadamente en tres o cuatro piezas. Introduzca cada tira en su propio pozo de dos centímetros de diámetro en una placa de cuatro pozos y cubra el tejido con láminas de vidrio estériles de 1,3 centímetros de diámetro.Luego, agregue 500 microlitros de medio de cultivo a cada placa de cultivo, ya sea para el tipo de tejido. Renueve el medio de cultivo cada dos o tres días. Después de cinco a siete días de cultivo, las células madre comenzarán a invadir la placa de cultivo.Y después de dos semanas, deberían estar confluentes. Cuando se alcance la confluencia, pase y transfiera las células a frascos de cultivo para generar esferas de células madre.Replique las células a una densidad de 16.000 células por centímetro cuadrado en frascos previamente tratados cada dos días. Alimente las células con 0,2 mililitros por centímetro cuadrado de medio suplementado. De dos a cinco días después, recolecte las esferas de células flotantes y replate o disocie estas antes del injerto.Un modelo animal de terapia celular para diferenciar las células madre olfativas en células semejantes a neuronas. Cultive las células durante 21 días en medio neurobasal que contenga B27, penicilina, estreptomicina, glutamina y glutamato, y realice cambios de medio cada tres días. Las células semejantes a neuronas deben aparecer entre dos y tres semanas, cinco a siete días después del siembra.Las células madre olfativas humanas nasales salieron del explante y proliferaron rápidamente. Se podía alcanzar la confluencia en una o dos semanas. Una característica clave de las células madre, la formación de nidos y la expresión, se evaluó cuando crecieron sobre polilisina con un medio de cultivo libre de suero suplementado con EGF y FGF dos; las células madre olfativas dieron lugar a esferoides cuando los esferoides se sembraron en un cultivo que contenía suero.Medio, dieron lugar a poblaciones celulares que contenían aproximadamente un 50 % de células que expresaban GFAP, hasta un 15 % de células que expresaban tubulina y hasta un 5 % de células que expresaban oh cuatro. Cuando las células derivadas de esferas se cultivaron en medio de cultivo neuro basal suplementado, la mayor parte de la población se convirtió en células semejantes a neuronas que expresaban beta tres tubulina. Las mismas células semejantes a neuronas también expresaban map dos.Por lo tanto, el destino de las células madre podría modificarse en un semestre. Esta técnica puede generar fácilmente millones de células madre en menos de cuatro semanas, lo que permite a los clínicos realizar futuros trasplantes celulares autólogos. Las biopsias nasales refractarias son muy útiles para identificar biomarcadores y enfermedades cerebrales.Recientemente hemos tenido éxito al identificar nuevos genes candidatos para el autismo. Ya hemos establecido un banco de células madre olfativas de individuos autistas y controles, y este puede ampliarse a otros trastornos cerebrales humanos.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

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Aprenda a aislar células madre olfativas nasales de roedores y humanos mediante biopsia de mucosa olfativa. Este método permite identificar anomalías moleculares en enfermedades cerebrales y reparar daños neurológicos.

Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

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