Name: Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Aprende a extraer ADN de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina mediante desparafinización con xileno, rehidratación y digestión con proteinasa K. Este protocolo permite obtener ADN de alta calidad para análisis genéticos y epigenéticos.

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Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio de Lam para su evaluación y las críticas de este video y artículo. Este trabajo fue financiado por los fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud.

<p class="jove_title"&gt; 1. NOTAS DE LOS PROCEDIMIENTOS</p&gt;<ul&gt;<li&gt; El xileno y el fenol son los productos químicos tóxicos y deben ser manejados en un fumehood. Consulte la hoja de datos de seguridad (MSDS) antes de su uso.</li&gt;<liXileno&gt; disuelve algunos tipos de plástico, tubos de polipropileno debe ser utilizado como toleran estos compuestos.</li&gt;<liConsejos&gt; especiales se pueden comprar que contienen un tapón de carbón interno. Esto evita que el xileno de la disolución de los componentes de goma en la pipeta. Por otra parte, puntas con filtro se puede utilizar.</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. Eliminación de parafina</p&gt;<ol&gt;<li&gt; En un fumehood, añadir 800 l de xileno (VWR, CABDH6216-4) en el tubo rotulado, con su muestra y colocar en un eje de balancín con agitación suave durante 5 a 15 minutos para disolver la parafina.</li&gt;<li&gt; Pellet la muestra girando a la velocidad máxima (14.000 rpm o 16 000 xg) en una microcentrífuga durante 3 minutos. Saque con cuidado el sobrenadante xileno y disponer en un tubo de polipropileno para desechar los residuos en el xileno. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento.</li&gt;<li&gt; Repita los pasos 1 y xileno lavado de parafina 2until se disolvió completamente. Esto por lo general requiere de dos a tres lavados, dependiendo del tamaño de la muestra de tejido. Una muestra totalmente disuelto aparecerá suave, y algunas veces perder su integridad estructural. La integridad de la muestra puede ser evaluado con cuidado con una punta de la pipeta.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. El etanol de rehidratación</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Añadir 800 l de etanol al 100% (v / v) de grado de biología molecular del etanol, vórtice, gira la rueda durante 3 minutos a 14.000 rpm en microcentrífuga. Eliminar el sobrenadante etanol, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.</li&gt;<li&gt; Añadir 800 l de etanol al 70% (100% (v / v) de etanol diluido en agua destilada (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)) y agitar, girar y durante 3 minutos a 14.000 rpm. Retire con cuidado el sobrenadante etanol.</li&gt;<li&gt; Añadir 800 l de etanol al 50% (100% (v / v) de etanol diluido en agua destilada (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)), vórtice, y girar durante 5 minutos a 14.000 rpm. Retire con cuidado el etanol tanto como sea posible con la pipeta. Tenga mucho cuidado de perturbar el precipitado en este momento como el tejido está completamente hidratada no pellet, así como los tejidos deshidratados.</li&gt;<li&gt; Después de eliminar el sobrenadante de etanol, secar al aire el precipitado durante 5 minutos, teniendo cuidado de no más de seco.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. Tejido digestión</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Añadir 200-500 l de buffer de lisis (fórmula abajo). Vuelva a suspender el pellet con una pipeta o un vórtice. Esfuerzo adicional en este punto para volver a suspender totalmente el tejido dará como resultado una digestión más completa de la muestra y un mejor rendimiento de ADN.</li&gt;<li&gt; Se incuban las muestras a 56 ° C en un baño de agua o un calentador.</li&gt;<li&gt; Para los núcleos de tejido, pico 20 l de proteinasa K (20 mg / ml de solución stock, Invitrogen, AM2548) mañana y tarde.</li&gt;<li&gt; Repita los pasos anteriores para la digestión de 2 a 5 días hasta que el tejido esté totalmente disuelto.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_step"&gt; Tampón de lisis</p<ul&gt;<li&gt; 10 mM Tris-HCl pH 8,0</li&gt;<li&gt; 100 mM EDTA pH 8,0</li&gt;<li&gt; 50 mM NaCl</li&gt;<li&gt; SDS al 0,5%</li&gt;<li&gt; 200 mg / ml de proteinasa K (añadir justo antes de usar)</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 5. ADN de limpieza</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Añadir un volumen igual de buffer de fenol saturado (Fisher, BP1750I-400) y mezclar por inversión. Girar por lo menos 5 minutos a 14.000 rpm en microcentrífuga.</li&gt;<li&gt; Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo. Nota de la interfase: hay una gran cantidad de material blanco?</li&gt;<li&gt; Repita los pasos 1 y 2 de la fracción acuosa hasta que la interfase está claro (por lo general tres o más veces). Realizar extracciones de nuevo * cuando la interfase es difusa para aumentar el rendimiento final.</li&gt;<li&gt; Una vez que la interfase es clara, añadir un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400) a la fracción acuosa se extrajo de la muestra. Mezclar durante 5 minutos y luego girar durante 5 minutos a 14.000 rpm. Thisreduces fenol residual y agudiza aún más la interfase, lo que facilita la extracción de la capa acuosa</li&gt;<li&gt; Eliminar la capa acuosa a un tubo nuevo y treatwith RNasa A a 100 mg / ml durante 1 hora a 37 ° C.</li&gt;<li&gt; Repita los pasos 1 a 4 para eliminar cualquier resto de RNasa A y recoger la fracción acuosa. Sólo es necesario un buffer o dos pasos de fenol saturado, ya que debe ser proteína y mucho menos de eliminar que en el lisado inicial.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_content"&gt; * Para realizar extracciones de nuevo añadir 50-100 l de dH<sub&gt; 2</sub&gt; 0 para el tubo de muestra con la interfase y la parte orgánica. Invierta el tubo para mezclar, y girar la muestra a 14.000 rpm en una microcentrífuga durante 5 minutos. Recoger la fase acuosa y añadir a la extracción acuosa previamente adquiridos. Continúa tu camino hasta que la extracción de la interfase es clara.</p&gt;<p class="jove_title"&gt; 6. ADN precipitación</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Estimación del volumen de la capa acuosa recogidos.</li&gt;<li&gt; Añadir 1 / 10 del volumen de 3 M de acetato de sodio pH 5,2 y un volumen de 100% de isopropanol (v / v) de calidad para biología molecular (o 2,5 volúmenes de etanol al 100%).</li&gt;<li&gt; Mezclar bien y colocar en hielo o en un congelador a -20 ° C durante 30 minutos o toda la noche.</li&gt;<liGiro&gt; a la máxima velocidad (14.000 rpm) a 4 ° C en microcentrífuga durante 10 minutos</li&gt;<li&gt; Eliminar el sobrenadante.</li&gt;<li&gt; Lavar el sedimento con etanol 70% frío de hielo para eliminar las sales no deseadas.</li&gt;<li&gt; Vuelva a suspender el precipitado en el tampón de su elección (por lo general dH<sub&gt; 2</sub&gt; O).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 7. Cuantificación del ADN</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Cuantificar la concentración de ADN. El A260: A280 relación debe ser ~ 1,8. Para pequeñas cantidades de ADN, medida con un espectrofotómetro NanoDrop se prefiere.</li&gt;<liCuantificación&gt; Después, electroforesis en gel se debe realizar para poner a prueba la calidad de su muestra de ADN y determinar si la contaminación del ARN se ha degradado completamente.</li&gt;<li&gt; Alta calidad del ADN extraído ahora es adecuada para aplicaciones posteriores, o puede ser almacenado a -20 ° C para su uso posterior. Si el ARN está presente en la muestra, repita el ADN de limpieza y etapas de precipitación, y volver a cuantificar y calificar la calidad de sus muestras.</li&gt;</ol&gt;

<ol><li>Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+paraffin-embedded+tissue+sections+of+human+fetuses+fixed+and+stored+in+formalin+for+long+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods.</a> Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).</li>
<li>Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proteinase+K+action+by+denaturing+agents%3A+application+to+the+isolation+of+nucleic+acids+and+the+degradation+of+%27masked%27+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins.</a> Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).</li>
<li>Sambrook, J. oseph, R, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+Joseph+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+demonstration+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Thu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+DNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methylated DNA immunoprecipitation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2009).</li>
<li>Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues.</a> Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).</li>
</ol>

Tejidos biopsia o extirpado quirúrgicamente para el análisis histopatológico y el diagnóstico son a menudo fijado en formol e incluidas en parafina (FFPE) para el almacenamiento a largo plazo. Con el creciente interés en la comprensión de las bases genéticas de la enfermedad, la capacidad de extraer el ADN de estas muestras representa una valiosa fuente de material de diagnóstico que pueden ser utilizados para el análisis genómico y los estudios de traducción. Históricamente muestras FFPE no fueron considerados una fuente viable para el análisis molecular de los ácidos nucleicos puede ser muy modificado por el ácido nucleico y proteína-proteína-proteína transversal que une 6. Sin embargo, el descubrimiento de que la digestión de la proteasa versiones fragmentadas ácidos nucleicos que son adecuados para análisis posteriores como PCR, CGH array, la secuenciación y perfiles de metilación, permite el uso de estos valiosos ejemplares para el análisis genético 6. Extracción de ADN de tejidos embebidos en parafina es un procedimiento sólido que se basa en la solubilidad diferencial para purificar el ADN. Calidad y cantidad de ADN extraído y el éxito de la amplificación de ADN posterior depende de una serie de parámetros antes, durante y después de la extracción. Estos incluyen, pero no se limitan a: el tipo y la cantidad de tejido, el tipo de fijador utilizado para la preservación de los tejidos, la duración de la fijación, la edad del bloque de parafina y las condiciones de almacenamiento, así como la longitud del segmento de ADN que se desea amplificada 1,7. La eliminación de la parafina de los tejidos es el paso más crítico para la extracción de éxito como la parafina disuelta hace que la calidad de la muestra pobre y la inhibición de la amplificación por PCR.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Xileno </td><td> VWR </td><td> CABDH6216-4 </td><td> - </td></tr><tr><td> 1,7 ml Tubos de microcentrífuga SafeSeal </td><td> Sorenson BioScience </td><td> 11510 </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectrafuge 16M Microcentrífuga </td><td> Labnet </td><td> C0160-B </td><td> - </td></tr><tr><td> Tampón de lisis </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 200 mg / ml de proteinasa K </td></tr><tr><td> Proteinasa K solución madre </td><td> Invitrogen </td><td> AM2548 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Proteinasa K solución madre </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Buffer pH fenol saturado 6.6/7.9 </td><td> Pescador </td><td> BP1750I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> Fenol: cloroformo: isoamilalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) </td><td> Pescador </td><td> BP1752I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> RNasa A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td><td> 100mg </td></tr><tr><td> Acetato de sodio 3M pH 5.2 </td><td> - </td><td> - </td><td> 40.81g NaOAc en 80 ml Ajustar a pH 5,2 con ácido acético glacial Añadir dH 2 O a 100 ml Autoclave </td></tr><tr><td> ND 3300 Espectrofotómetro </td><td> NanoDrop </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table>

extracción de adn a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

 DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Desarrollo de la enfermedad y la progresión se caracteriza por frecuentes aberraciones genéticas y epigenéticas como reordenamientos cromosómicos, las ganancias y las pérdidas del número de copias y la metilación del ADN. Los avances en alto rendimiento, tecnologías de perfilado todo el genoma, como los microarrays, han mejorado significativamente nuestra capacidad para identificar y detectar esas alteraciones específicas. Sin embargo, como la tecnología continúa mejorando, sigue siendo un factor limitante de la calidad de la muestra y la disponibilidad. Información clínica, además, el seguimiento y la evolución de la enfermedad se recogen a menudo años después de la recolección de la muestra inicial. Muestras, por lo general fijado en formol e incluidas en parafina (FFPE), se almacenan en los archivos del hospital durante años o décadas. ADN puede ser eficiente y eficaz se recuperó de las muestras incluidas en parafina, si el método adecuado de extracción se aplica. ADN de alta calidad extraído de muestras de adecuada conservación y almacenados pueden apoyar los ensayos cuantitativos para la comparación de los tejidos normales y enfermos y la generación de firmas genéticas y epigenéticas 1. Para extraer el ADN de las muestras incluidas en parafina, las muestras de tejido o tejido microdissected son sometidos a un tratamiento xileno, que se disuelve la parafina de los tejidos, y luego rehidratado con una serie de lavados de etanol. Proteínas y enzimas perjudiciales como nucleasas son posteriormente digeridos por proteinasa K. La adición de tampón de lisis, que contiene agentes desnaturalizantes como el dodecilsulfato sódico (SDS), facilita la digestión 2. Los ácidos nucleicos son purificados a partir del lisado de tejido con buffer saturado de velocidad de centrifugado de alta fenol y que genera una solución bifásica. ADN y ARN permanecen en la fase acuosa superior, mientras que las proteínas, lípidos y polisacáridos son secuestradas en las inter-fases y orgánicos, respectivamente. La retención de la fase acuosa y se repite extracciones con fenol genera una muestra limpia. Después de una extracción con fenol, RNasa A se añade para eliminar la contaminación de ARN. Adicionales extracciones con fenol después de la incubación con RNasa A se utilizan para eliminar cualquier resto de la enzima. La adición de acetato de sodio y el ADN precipita isopropanol, y centrifugación de alta velocidad se utiliza para precipitar el ADN y facilitar la eliminación de isopropanol. El exceso de sales prorrogados de precipitación pueden interferir con la consiguiente ensayos enzimáticos, pero se puede quitar a partir del ADN mediante el lavado con etanol al 70%, seguido de centrifugación para volver a la pastilla de ADN 3. ADN se resuspendió en agua destilada o el buffer de la elección, cuantificado y almacenado a -20 ° C. ADN purificado posteriormente se puede utilizar en aplicaciones posteriores que incluyen, pero no se limitan a, PCR, hibridación genómica comparada serie 4 (CGH array), inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP) y la secuenciación, lo que permite un análisis integral de las muestras de tejido / tumor.

Este video muestra el protocolo para la extracción de ADN de fijado en formol e incluido en parafina de material. Este es un procedimiento de varios días en los que las secciones de tejido se deparaffinized con xileno, rehidratada con etanol y se tratan con proteinasa K para purificar y aislar el ADN para su posterior análisis de genes específicos o en todo el genoma.

Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

El desarrollo y la progresión de las enfermedades se caracterizan por frecuentes aberraciones genéticas y epigenéticas, que incluyen reordenamientos cromosómicos, variaciones en el número de copias...

Este video demostrará cómo extraer ADN de muestras de tejido incluidas en parafina. La muestra utilizada en esta demostración es un cilindro de tejido de tres milímetros de diámetro y seis milímetros de longitud. Aunque en esta demostración se utiliza un solo cilindro, se pueden procesar en una sola reacción muestras más grandes, con un diámetro superior a cinco milímetros y una longitud mayor a 10 milímetros, o bien dos o tres cilindros del tamaño empleado aquí.Sin embargo, es importante tener en cuenta que puede ser necesario ajustar el protocolo para garantizar la eliminación completa de la parafina y la digestión del tejido. Antes de realizar cualquier procedimiento con el tejido, debe disolverse la parafina cerosa que lo conserva. Esto se logra utilizando xileno, ya que tanto el xileno como el fenol son tóxicos. Todo trabajo con estos productos químicos debe realizarse en una campana extractora; agregue 800 microlitros de xileno al tubo que contiene su muestra.Luego, coloque la muestra en un agitador rotatorio durante 10 minutos con agitación suave. Centrifugue la muestra a 14.000 RPM durante tres minutos para formar el pellet y luego retire el xileno y disuelva la parafina del tubo. Repita estos pasos dos o tres veces hasta que la parafina se disuelva completamente.El tejido debe verse húmedo y blando. Es importante eliminar toda la parafina para aumentar el rendimiento final de ADN. Por lo tanto, se requieren más lavados para muestras de tejido más grandes.Ahora que se ha eliminado la parafina de la muestra, el tejido debe ser rehidratado para permitir la digestión tisular. Esto se logra mediante una serie de rehidratación con etanol. Primero, agregue 800 microlitros de etanol al 100 % a la muestra, vortexee y centrifugue la muestra a 14 000 RPM durante tres minutos.Retire el sobrenadante. Repita estos pasos utilizando 800 microlitros de etanol al 70%, y luego utilizando etanol al 50%. La centrifugación final debe durar cinco minutos porque el tejido será menos sólido y requerirá más fuerza para formar el pellet.Ahora el tejido necesita ser digerido para liberar el ADN de las células. Esto se realiza utilizando un tampón de lisis, una solución compuesta por desnaturalizantes de proteínas, como SDS y proteinasa K, la enzima responsable de la degradación del tejido.Agregue de 200 a 500 microlitros de tampón de lisis a la muestra. Según el tamaño, 400 microlitros es un volumen adecuado para usar. Por supuesto, los componentes del tampón de lisis, así como la temperatura de incubación de 56 grados Celsius, sirven para maximizar la actividad de la proteína.Debido a que la proteína ACE K solo puede degradar el tejido durante un tiempo limitado, se debe agregar más enzima periódicamente para continuar la reacción. Se añaden 20 microlitros de la proteína ACE K a una concentración de 10 miligramos por M a la muestra por la mañana y por la noche hasta que el tejido se disuelva completamente.Cuando no se puede ver más tejido sólido, el ADN debe extraerse del tampón de restos celulares. Se utiliza fenol saturado para separar la muestra en fases acuosa y orgánica. La fase acuosa contiene el ADN.Es importante utilizar fenol saturado con tampón porque la acidez del fenol normal no solo degrada el ADN, sino que también invierte la estratificación de las fases acuosa y orgánica. Tenga en cuenta que el fenol saturado con tampón se almacena en dos fases, siendo el fenol la capa inferior.Añada un volumen igual de fenol saturado con tampón a la muestra e invierta el tubo varias veces. A continuación, coloque la muestra en la centrífuga y hágala girar a 14.000 RPM durante cinco minutos para inducir la separación de fases.El ADN y el ARN se encontrarán en la fase acuosa superior, mientras que las proteínas, los lípidos y los polisacáridos se encuentran en la interfase y en la fase orgánica inferior. Retire cuidadosamente la capa acuosa sin perturbar la interfase y colóquela en un tubo nuevo. A menudo, después de la primera centrifugación, la interfase es suelta y difusa.Se requieren extracciones utilizando pequeños volúmenes de agua. El protocolo para las extracciones inversas se encuentra en el texto que acompaña a este video. Repita estos pasos hasta que la interfase esté clara, lo cual generalmente se logra tras tres a cinco repeticiones; continúe agregando un volumen igual de fenol-cloroformo, alcohol isoamílico a la muestra de ADN.Esto cumple el mismo propósito que el fenol solo, pero define mejor la interfase para maximizar el rendimiento de ADN. Repita este procedimiento una o dos veces hasta que la interfase esté clara y bien definida. Ahora que su muestra está libre de proteínas, debe eliminarse cualquier ARN contaminante.Esto se logra mediante ARN. Se agrega un ARN de degradación A a la muestra a una concentración final de 100 microgramos por mililitro, y la muestra se incuba durante una hora a 37 grados Celsius. Ahora que el ARN está degradado, la enzima ARNA debe eliminarse.Se repite el procedimiento de purificación del ADN como antes. Al usar primero fenol saturado con tampón y luego proceder a fenol-cloroformo-isoamil alcohol, se requerirán menos pasos de purificación, ya que ahora la única contaminación corresponde a la enzima ARNasa A y al ARN degradado. Ahora que la muestra contiene solo ADN, el ADN debe precipitarse de la solución; agregue una décima parte del volumen de acetato de sodio y un volumen de isopropanol.Alternativamente, se pueden agregar dos volúmenes y medio de etanol, aunque en ese caso se requeriría un tubo más grande. Incube la muestra a menos 20 grados Celsius durante 30 minutos hasta una hora, o durante la noche si está trabajando más tarde. Dado que ahora está trabajando con ADN, asegúrese de mantener la muestra sobre hielo para que no se degrade.Centrifugar la muestra a 14 000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para obtener el pellet del ADN precipitado. Retirar el sobrenadante teniendo cuidado de no desalojar el pellet, con el fin de eliminar las sales en exceso que podrían interferir en experimentos posteriores, como la secuenciación. Por ejemplo, añadir un mililitro de etanol al 70 % enfriado y resuspender suavemente la muestra.Centrifugar la muestra nuevamente a 14.000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Retirar cuidadosamente el sobrenadante y dejar secar al aire cualquier exceso de etanol durante hasta cinco minutos. Es importante no secar en exceso la muestra.Finalmente, el ADN se purifica y está listo para resuspenderse en el tampón de su elección. Aquí estamos utilizando agua destilada autoclaveada. Oh sí.Almacene las muestras de ADN a menos 20 grados Celsius para su uso posterior. Una vez completada la extracción, debe evaluar la calidad y cantidad de su ADN. Esto se realiza mediante espectrometría utilizando el NanoDrop tres 30 nd, configure el tipo de medición en ácido nucleico, seleccione ADN 50 como cálculo e inicialice el instrumento con 1.5 microlitros de agua.Limpie el pedestal y realice una medición en blanco utilizando 1,5 microlitros de diluyente. En este caso, agua destilada. Limpie el pedestal, cargue 1,5 microlitros de muestra y presione medir. Sí. Excelente.Una proporción A260/A280 de 1,8 es ideal en este momento. Su ADN está listo para su uso en aplicaciones posteriores, que incluyen, entre otras, matriz, hibridación genómica comparativa, inmunoprecipitación de ADN metilado y secuenciación.Los enlaces para estos protocolos se muestran aquí, si no son necesarios de inmediato. Almacene sus muestras a menos 20 grados Celsius para su uso posterior.

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Biología

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