Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos
26 de marzo de 2011
Este video muestra el protocolo para la extracción de ADN de fijado en formol e incluido en parafina de material. Este es un procedimiento de varios días en los que las secciones de tejido se deparaffinized con xileno, rehidratada con etanol y se tratan con proteinasa K para purificar y aislar el ADN para su posterior análisis de genes específicos o en todo el genoma.
Este video demostrará cómo extraer ADN de muestras de tejido incluidas en parafina. La muestra utilizada en esta demostración es un cilindro de tejido de tres milímetros de diámetro y seis milímetros de longitud. Aunque en esta demostración se utiliza un solo cilindro, se pueden procesar en una sola reacción muestras más grandes, con un diámetro superior a cinco milímetros y una longitud mayor a 10 milímetros, o bien dos o tres cilindros del tamaño empleado aquí.
Sin embargo, es importante tener en cuenta que puede ser necesario ajustar el protocolo para garantizar la eliminación completa de la parafina y la digestión del tejido. Antes de realizar cualquier procedimiento con el tejido, debe disolverse la parafina cerosa que lo conserva. Esto se logra utilizando xileno, ya que tanto el xileno como el fenol son tóxicos. Todo trabajo con estos productos químicos debe realizarse en una campana extractora; agregue 800 microlitros de xileno al tubo que contiene su muestra.
Luego, coloque la muestra en un agitador rotatorio durante 10 minutos con agitación suave. Centrifugue la muestra a 14.000 RPM durante tres minutos para formar el pellet y luego retire el xileno y disuelva la parafina del tubo. Repita estos pasos dos o tres veces hasta que la parafina se disuelva completamente.
El tejido debe verse húmedo y blando. Es importante eliminar toda la parafina para aumentar el rendimiento final de ADN. Por lo tanto, se requieren más lavados para muestras de tejido más grandes.
Ahora que se ha eliminado la parafina de la muestra, el tejido debe ser rehidratado para permitir la digestión tisular. Esto se logra mediante una serie de rehidratación con etanol. Primero, agregue 800 microlitros de etanol al 100 % a la muestra, vortexee y centrifugue la muestra a 14 000 RPM durante tres minutos.
Retire el sobrenadante. Repita estos pasos utilizando 800 microlitros de etanol al 70%, y luego utilizando etanol al 50%. La centrifugación final debe durar cinco minutos porque el tejido será menos sólido y requerirá más fuerza para formar el pellet.
Ahora el tejido necesita ser digerido para liberar el ADN de las células. Esto se realiza utilizando un tampón de lisis, una solución compuesta por desnaturalizantes de proteínas, como SDS y proteinasa K, la enzima responsable de la degradación del tejido.
Agregue de 200 a 500 microlitros de tampón de lisis a la muestra. Según el tamaño, 400 microlitros es un volumen adecuado para usar. Por supuesto, los componentes del tampón de lisis, así como la temperatura de incubación de 56 grados Celsius, sirven para maximizar la actividad de la proteína.
Debido a que la proteína ACE K solo puede degradar el tejido durante un tiempo limitado, se debe agregar más enzima periódicamente para continuar la reacción. Se añaden 20 microlitros de la proteína ACE K a una concentración de 10 miligramos por M a la muestra por la mañana y por la noche hasta que el tejido se disuelva completamente.
Cuando no se puede ver más tejido sólido, el ADN debe extraerse del tampón de restos celulares. Se utiliza fenol saturado para separar la muestra en fases acuosa y orgánica. La fase acuosa contiene el ADN.
Es importante utilizar fenol saturado con tampón porque la acidez del fenol normal no solo degrada el ADN, sino que también invierte la estratificación de las fases acuosa y orgánica. Tenga en cuenta que el fenol saturado con tampón se almacena en dos fases, siendo el fenol la capa inferior.
Añada un volumen igual de fenol saturado con tampón a la muestra e invierta el tubo varias veces. A continuación, coloque la muestra en la centrífuga y hágala girar a 14.000 RPM durante cinco minutos para inducir la separación de fases.
El ADN y el ARN se encontrarán en la fase acuosa superior, mientras que las proteínas, los lípidos y los polisacáridos se encuentran en la interfase y en la fase orgánica inferior. Retire cuidadosamente la capa acuosa sin perturbar la interfase y colóquela en un tubo nuevo. A menudo, después de la primera centrifugación, la interfase es suelta y difusa.
Se requieren extracciones utilizando pequeños volúmenes de agua. El protocolo para las extracciones inversas se encuentra en el texto que acompaña a este video. Repita estos pasos hasta que la interfase esté clara, lo cual generalmente se logra tras tres a cinco repeticiones; continúe agregando un volumen igual de fenol-cloroformo, alcohol isoamílico a la muestra de ADN.
Esto cumple el mismo propósito que el fenol solo, pero define mejor la interfase para maximizar el rendimiento de ADN. Repita este procedimiento una o dos veces hasta que la interfase esté clara y bien definida. Ahora que su muestra está libre de proteínas, debe eliminarse cualquier ARN contaminante.
Esto se logra mediante ARN. Se agrega un ARN de degradación A a la muestra a una concentración final de 100 microgramos por mililitro, y la muestra se incuba durante una hora a 37 grados Celsius. Ahora que el ARN está degradado, la enzima ARNA debe eliminarse.
Se repite el procedimiento de purificación del ADN como antes. Al usar primero fenol saturado con tampón y luego proceder a fenol-cloroformo-isoamil alcohol, se requerirán menos pasos de purificación, ya que ahora la única contaminación corresponde a la enzima ARNasa A y al ARN degradado. Ahora que la muestra contiene solo ADN, el ADN debe precipitarse de la solución; agregue una décima parte del volumen de acetato de sodio y un volumen de isopropanol.
Alternativamente, se pueden agregar dos volúmenes y medio de etanol, aunque en ese caso se requeriría un tubo más grande. Incube la muestra a menos 20 grados Celsius durante 30 minutos hasta una hora, o durante la noche si está trabajando más tarde. Dado que ahora está trabajando con ADN, asegúrese de mantener la muestra sobre hielo para que no se degrade.
Centrifugar la muestra a 14 000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para obtener el pellet del ADN precipitado. Retirar el sobrenadante teniendo cuidado de no desalojar el pellet, con el fin de eliminar las sales en exceso que podrían interferir en experimentos posteriores, como la secuenciación. Por ejemplo, añadir un mililitro de etanol al 70 % enfriado y resuspender suavemente la muestra.
Centrifugar la muestra nuevamente a 14.000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Retirar cuidadosamente el sobrenadante y dejar secar al aire cualquier exceso de etanol durante hasta cinco minutos. Es importante no secar en exceso la muestra.
Finalmente, el ADN se purifica y está listo para resuspenderse en el tampón de su elección. Aquí estamos utilizando agua destilada autoclaveada. Oh sí.
Almacene las muestras de ADN a menos 20 grados Celsius para su uso posterior. Una vez completada la extracción, debe evaluar la calidad y cantidad de su ADN. Esto se realiza mediante espectrometría utilizando el NanoDrop tres 30 nd, configure el tipo de medición en ácido nucleico, seleccione ADN 50 como cálculo e inicialice el instrumento con 1.5 microlitros de agua.
Limpie el pedestal y realice una medición en blanco utilizando 1,5 microlitros de diluyente. En este caso, agua destilada. Limpie el pedestal, cargue 1,5 microlitros de muestra y presione medir. Sí. Excelente.
Una proporción A260/A280 de 1,8 es ideal en este momento. Su ADN está listo para su uso en aplicaciones posteriores, que incluyen, entre otras, matriz, hibridación genómica comparativa, inmunoprecipitación de ADN metilado y secuenciación.
Los enlaces para estos protocolos se muestran aquí, si no son necesarios de inmediato. Almacene sus muestras a menos 20 grados Celsius para su uso posterior.
Descripción general
Este video demuestra un protocolo para extraer ADN de muestras de tejido fijado en formalina e incluido en parafina. El proceso incluye desparafinización, rehidratación y digestión para aislar el ADN destinado al análisis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Biología molecular
Antecedentes
- Las muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) se utilizan comúnmente en la investigación.
- La extracción de ADN a partir de estas muestras es fundamental para el análisis genético.
- La eliminación adecuada de la parafina es esencial para obtener un alto rendimiento de ADN.
- Pueden ser necesarios varios lavados para muestras de tejido más grandes.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la extracción de ADN a partir de tejidos incluidos en parafina (FFPE).
- Asegurar que los investigadores puedan obtener ADN de alta calidad para análisis posteriores.
- Destacar la importancia de manipular adecuadamente los productos químicos peligrosos.
Métodos Utilizados
- Desparafinización utilizando xileno.
- Rehidratación mediante una serie de etanol.
- Digestión del tejido con proteinasa K en tampón de lisis.
- Extracción de ADN utilizando fenol saturado con tampón y fenol-cloroformo.
Resultados principales
- La eliminación exitosa de parafina conduce a un mayor rendimiento de ADN.
- Una digestión eficaz del tejido permite la extracción completa de ADN.
- La contaminación con ARN puede minimizarse mediante pasos específicos de degradación.
- Las muestras finales de ADN pueden almacenarse para usos futuros.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para la extracción de ADN a partir de muestras de FFPE.
- La técnica adecuada garantiza un ADN de alta calidad adecuado para el análisis.
- Es fundamental tener conocimiento de los riesgos químicos durante el procedimiento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La recuperación de ADN de alta calidad a partir de archivos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE) permite el análisis genético y epigenético retrospectivo de la progresión de enfermedades, apoyando la validación de dianas y el descubrimiento de biomarcadores mediante el uso de muestras clínicas existentes. Este método aborda las limitaciones en la disponibilidad de muestras en la investigación traslacional al permitir el acceso a colecciones históricas de tejidos para su perfilado molecular. El ADN purificado a partir de material FFPE es compatible con aplicaciones posteriores como CGH en matriz, MeDIP y secuenciación, facilitando el análisis integrado de tejidos normales y enfermos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar aberraciones genéticas y epigenéticas en tejidos archivados para aclarar las vías asociadas a enfermedades y los objetivos terapéuticos.
- Valor operativo: Brinda acceso a conjuntos longitudinales de muestras para la comprobación de hipótesis sin necesidad de recolección prospectiva.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Produce ADN adecuado para ensayos cuantitativos como CGH por matriz y secuenciación, lo que permite el análisis comparativo de estados normales y patológicos.
- Valor operativo: El proceso estandarizado de extracción facilita material de entrada reproducible para el desarrollo de ensayos y campañas de cribado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Permite la generación de firmas genéticas y epigenéticas a partir de muestras FFPE relevantes para enfermedades, alineándose con estrategias traslacionales de biomarcadores.
- Valor operativo: Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir el análisis molecular de especímenes clínicos almacenados.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método de extracción de ADN posiciona el tejido FFPE como una entrada viable para los flujos de trabajo de biología de descubrimiento, permitiendo el análisis molecular antes de la identificación del candidato principal y la evaluación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al proporcionar ADN de tejidos archivados para perfiles genéticos y epigenéticos.
- Tamizaje: Proporciona ADN purificado compatible con aplicaciones posteriores, como PCR, CGH con matriz y secuenciación, para la evaluación del efecto de compuestos.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas mediante controles de calidad espectrofotométricos (por ejemplo, relación NanoDrop A260/A280) para garantizar la idoneidad de las muestras para el análisis.
- Investigación Traducional: Conecta especímenes clínicos archivados con análisis moleculares, apoyando la alineación de biomarcadores y la validación de sistemas relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad estandarizada para acceder a colecciones históricas de tejidos, reduciendo la dependencia de la obtención de muestras frescas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva al permitir la caracterización molecular de la progresión de enfermedades mediante cohortes de FFPE bien anotadas.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante pasos estandarizados de desparafinización, digestión y purificación aplicables a diversos tipos de tejidos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción de proyectos aprovechando datos retrospectivos para reducir los riesgos de los blancos antes de realizar inversiones prospectivas.
- Impacto en la cartera: Orienta la priorización ajustada al riesgo mediante la validación de blancos en conjuntos de muestras longitudinalmente relevantes desde el punto de vista clínico.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de sustancias químicas peligrosas como xileno y fenol, lo que exige el uso de campana extractora y capacitación en seguridad.
- Depende de instrumentación que incluye centrífugas capaces de alcanzar 14.000 RPM y mezcladores vortex para una separación de fases y mezcla eficientes.
- Necesita protocolos estandarizados entre los equipos para garantizar un rendimiento y calidad consistentes de ADN, especialmente con tamaños variables de muestras de tejido.
- Incluye consideraciones de adaptación para escalar desde núcleos individuales hasta muestras más grandes o múltiples núcleos por reacción.
- Comprende limitaciones prácticas, como la necesidad de múltiples extracciones con fenol para obtener interfaces limpias y eliminar contaminantes enzimáticos.
