Trichuris muris infección: un modelo de tipo 2 inmunidad y la inflamación en el intestino

El objetivo general de este procedimiento es establecer y mantener un modelo natural de infección por hain. Primero, los ratones se infectan con huevos de tra curus mirrors mediante gavaje oral. Veintiún días después, los animales infectados son sacrificados y se obtienen muestras de sangre, ganglios linfáticos mesentéricos, pellets fecales, colon y seeker.

Utilizando estas muestras, se puede analizar la respuesta inmunitaria generada contra trucos. Se pueden analizar espejos. Las muestras de suero pueden analizarse mediante lisado para detectar anticuerpos específicos contra TRA.

La restimulación in vitro de células de ganglios linfáticos puede realizarse para analizar las respuestas inmunitarias celulares. Los pellets fecales pueden utilizarse para la evaluación del contenido proteico y el análisis de la expresión génica puede realizarse mediante análisis de QPCR del colon. Finalmente, la punta del ciego puede usarse para histología, mientras que el resto del ciego puede utilizarse para determinar la carga parasitaria en ratones infectados.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren si un ratón es resistente o susceptible a la infección por trais MOUs, y se puede caracterizar la respuesta inmunitaria generada contra el parásito. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como qué factores controlan la activación de las células T helper, así como qué proteínas son necesarias para la diferenciación de células TH2. Los huevos de Trauss MOUs pueden propagarse en ratones inmunodeficientes o en cepas genéticamente susceptibles, como KR, 35 días después de la infección, para recolectar huevos de ratones sacrificados.

Exponga la superficie ventral del animal y enjuague el abdomen del ratón con etanol utilizando pinzas y tijeras estériles. Sujete la piel abdominal y realice una pequeña incisión. Exponga el contenido abdominal, identifique el ciego y el colon proximal, y luego extráigalos.

Transfiera los órganos a una placa de Petri de 10 centímetros que contenga DMEM suplementado con penicilina y estreptomicina. Luego, corte el ciego y el colon proximal para abrirlos, exponiendo así la luz y los parásitos con ayuda de pinzas. Coloque los órganos abiertos en un vaso de precipitados que contenga PBS y agite suavemente para eliminar las heces.

Una vez que se haya lavado el ciego, transfiéralo a una placa de Petri nueva y utilice pinzas curvas suaves para extraer cuidadosamente los gusanos. Transfiera todos los gusanos de cada ratón a un pocillo de una placa de seis pocillos que contenga cinco mililitros de DMEM suplementado con antibiótico. Coloque la placa de seis pocillos con una toalla de papel húmeda dentro de un recipiente hermético y incube a 37 grados Celsius durante cuatro horas para permitir que los gusanos pongan huevos.

Tras esta incubación, utilice pinzas para retirar los gusanos del pocillo original y divídalos en dos nuevos pocillos que contengan DMEM. Dividir los gusanos de esta manera maximizará la recuperación de huevos utilizando una pipeta. Recoja el medio restante que contiene antígeno secretado y huevos del pocillo original y transfiera este medio a un tubo Falcon de 15 mililitros.

Centrifugar el tubo a 3000 RPM durante cinco minutos. Luego retirar y guardar el sobrenadante que contiene el antígeno de cuatro horas y Reese's, y colocar el pellet que contiene el huevo en agua estéril. Colocar la placa de seis pocillos que contiene los gusanos a 37 grados Celsius nuevamente e incubarla durante la noche; al día siguiente por la mañana.

Tras descartar los gusanos, recolecte el contenido de los pocillos como se mostró anteriormente y centrifugue el sobrenadante para aislar los huevos. Guarde el sobrenadante que contiene el antígeno de incubación nocturna y resuspenda los huevos en agua. Como antes, combine estos huevos con los obtenidos de la incubación de cuatro horas.

Filtre los huevos a través de un colador de 70 micrones para eliminar cualquier gusano residual. Luego, transfiera los huevos a un matraz cuadrado de 75 centímetros. Cubra el matraz con papel de aluminio para protegerlo de la luz y almacene los huevos durante seis semanas a temperatura ambiente.

Esto permitirá que los huevos maduren y embrionen después de seis semanas. Lave los huevos, agite con agua nueva y cuente los huevos viables. Se muestra aquí.

Como ejemplo de un huevo embrionado viable y un huevo no viable, Reese dobla la concentración de Exeter de 50 por 50 microlitros. En este punto, los huevos pueden almacenarse a cuatro grados Celsius antes de infectar a los ratones. Asegúrese de volver a suspender completamente la solución que contiene los huevos.

Transfiera la cantidad deseada de inóculo a un tubo de tapa roscada de 14 mililitros e invierta el tubo para mezclar. Aspire 200 microlitros de huevos en una aguja de alimentación del tamaño adecuado para el tamaño del animal, acoplada a una jeringa de un mililitro. Sujete al ratón por la nuca y administre los huevos mediante gavaje oral.

Devuelva el ratón infectado a su jaula y permita que la infección progrese durante 21 días. Después de 21 días, utilice una jeringa no heparinizada para obtener la sangre de los ratones infectados mediante punción cardíaca. Tras la eutanasia con dióxido de carbono, las muestras de sangre pueden almacenarse a cuatro grados Celsius.

Para el aislamiento de suero y análisis de IgG e IgE específicas contra tra mediante ELISA. Exponga la cavidad abdominal del ratón como se describió anteriormente. Luego use pinzas para extraer el ciego con tijeras u otra pareja de pinzas.

Desplace el intestino delgado hacia la derecha, exponiendo los ganglios linfáticos mesentéricos. Retire cuidadosamente los ganglios linfáticos teniendo cuidado de no cortar los intestinos y colóquelos en un tubo Falcon de 15 mililitros que contenga dos mililitros de medio. Las células de los ganglios linfáticos pueden ser cultivadas posteriormente in vitro con el sobrenadante de antígeno S de cuatro horas proveniente de los cultivos de gusanos, para analizar la respuesta inmune celular frente al parásito.

Una vez que se hayan extraído los ganglios linfáticos, extirpe el ciego y el colon como se describió anteriormente, utilizando pinzas, libere los pellets fecales del colon distal y colóquelos en el tubo de oxígeno de dos mililitros; los pellets pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius y analizarse para determinar el contenido proteico mediante blot de western utilizando tijeras. Corte aproximadamente un centímetro del colon proximal y colóquelo en un tubo que contenga ARN. Posteriormente, almacénelo a cuatro grados Celsius.

Corte aproximadamente cinco milímetros del extremo del ciego sujetando el extremo del ciego con pinzas. Use una jeringa de tres mililitros y una aguja de calibre 22 para lavar la muestra con PBS. Luego, transfiera la muestra a un tubo tipo frasco de cinco mililitros con tapa hermética que contenga paraformaldehído al 4%.

La muestra del ciego fijada con paraformaldehído puede almacenarse a cuatro grados Celsius y utilizarse para análisis histológico. Coloque el resto del ciego en una placa de Petri y congélelo a menos veinte grados Celsius para matar los gusanos. Para facilitar la enumeración de los gusanos, descongele el ciego y colóquelo en una placa de Petri que contenga aproximadamente cinco mililitros de agua utilizando tijeras.

Corte el ciego longitudinalmente para exponer la luz y agítelo para recoger las heces en un recipiente. Coloque el ciego limpio en una nueva placa de Petri que contenga agua y utilice pinzas curvas suaves para raspar las células epiteliales intestinales. Transfiera el ciego a otra placa de Petri con agua y desgarre el tejido en pequeños fragmentos.

Observe las heces, las células epiteliales intestinales y el tejido del ciego bajo un microscopio estereoscópico, cuente los gusanos, retírelos a medida que los cuenta y colóquelos en un recipiente nuevo. Así es como deben verse los gusanos en el ciego antes y después del aislamiento, como se muestra aquí. Tras la infección, los ratones tragus mirrors black seis son capaces de controlar los parásitos, mientras que los ratones a KR desarrollan cargas parasitarias elevadas.

Los ratones A KR igualmente susceptibles desarrollan títulos de IgG específica contra TRA significativamente más altos que los ratones black six, según se determinó mediante ELISA sérica. En este experimento, el análisis por inmunotransferencia reveló que la cantidad de la proteína específica de células caliciformes, realm beta, aumentó en las heces de los ratones black six, pero no en los ratones A KR, tras la infección. El análisis histológico del ciego distal muestra hiperplasia de las células caliciformes y producción de moco en ratones black six resistentes infectados con TRAs MOUs, pero no en los ratones A KR susceptibles.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo propagar huevos de trismo, infectar ratones experimentales y extraer los tejidos intestinales, el meso, los ganglios linfáticos entéricos y la sangre para el análisis de la infección en ratones susceptibles o resistentes.