Name: Transferencia génica para la insuficiencia cardiaca isquémica en un modelo preclínico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a realizar transferencia génica para insuficiencia cardiaca isquémica utilizando un modelo porcino de infarto de miocardio. Este método simple y reproducible permite evaluar diversas terapias génicas cardíacas.

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Este trabajo es apoyado por la Fundación Leducq través de la red Caerus (RJH), por el NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 y P20HL100396 (RJH). DL recibió el apoyo de la Fundación Alemana de Investigación. Nos gustaría dar las gracias a Lauren Leonardson por su asistencia técnica en este proyecto.

1. La creación de infarto de miocardio <ol><li> Mujer cerdos Yorkshire (20 kg) de animales industrias de biotecnología (Doylestown, Pensilvania) se pre-medicado con Telazol (tiletamina / zolazepam) (8,0 mg / kg) y buprenorfina (0,6 mg). </li><li> Los animales son intubados y ventilados con oxígeno al 100%. La anestesia general se mantiene con Propofol (5-8mg/kg/hr) durante todo el procedimiento. </li><li> El sitio femoral se prepara con 70% de alcohol isopropílico seguido de povidona yodada. La punción percutánea permite el acceso a la arteria y la colocación de la vaina. Después de la inserción de la vaina, 3000-5000 UI de heparina se administra IV para mantener un tiempo de coagulación activado de 250-300 segundos. </li><li> Un bolo de amiodarona (75 mg) se administra por vía intramuscular. La inyección intravenosa de una bolsa de 1000 ml de solución salina con amiodarona (75 mg), atropina (2 mg) y acetato de potasio (20 mEq) se inicia y se mantiene con una tasa de 150 ml / h durante todo el procedimiento. </li><li> A 7 P. palo de hockey catéter (Cordis, Miami, FL) se avanza a la arteria coronaria izquierda y una angiografía coronaria se realiza. Una guía de 0,014 pulgadas (Abbott, Park, IL) se introduce en la arteria descendente anterior coronaria (LAD). Un niño de 8 mm de largo, 4.0 mm VOYAGER sobre el alambre-balón (Abbott, Park, IL) se avanza y se ubica en la DA proximal, y el globo se infla para coronaria 3 atm. La oclusión de la DA es confirmada por angiografía. </li><li> Con electrocardiograma continuo y el control hemodinámico, la oclusión se mantiene durante 90 minutos. Arritmias ventriculares malignas en ocasiones puede ocurrir dentro de los primeros 40 minutos, en cuyo caso la entrega inmediata de los impactos directos de corriente de 200 J a 300 J se administran. Por lo general, hay dos marcos de tiempo máximo de arritmia, entre un 2 y 10 minutos y el otro entre 25 y 35 minutos después del inflado del balón. Observación minuciosa y la desfibrilación inmediata son la clave para la creación de infarto de miocardio con éxito, ya que hay más de un 95% de incidencia de entrar en la fibrilación ventricular dentro de los plazos indicados. Si la desfibrilación inmediata y adecuada se lleva a cabo, la tasa de supervivencia es muy alta. Si la presión arterial cae por debajo de 80 mmHg, el volumen de carga se realiza con una rápida infusión de solución salina por vía intravenosa. </li><li> El globo se desinfla y todos los dispositivos se eliminan. </li><li> La remoción de la vaina de la arteria femoral, la anestesia es retenido, y el animal se controla durante la recuperación. Solución salina por vía intravenosa con amiodarona, atropina y la infusión de acetato de potasio, se reduce a 50 ml / hr y se da durante la noche. Una inyección intramuscular de Nitroglycerline y Furoscemide se administra. Entonces el animal se le permite recuperar y cuidado de la monitorización del ECG se mantiene durante al menos 3 horas. </li><li> La aspirina (200 mg) PO se administra durante cinco días. </li></ol> Las complicaciones más frecuentes durante y después del procedimiento de infarto de miocardio son la creación de disección coronaria, hematoma sitio de la punción, arritmia e insuficiencia cardiaca. A perfeccionar la técnica y la supervisión minuciosa es necesaria para prevenir y tratar estas complicaciones. 2. Virus de la inyección <ol><li> Los animales se preparan como se indica en la creación de miocardio infarto steps1-3. La misma dosis de heparina se debe dar para prevenir la trombosis durante la inyección del virus. </li><li> Un catéter 5Fr palo de hockey (Cordis, Miami, FL) se avanza a la arteria coronaria izquierda. Después de la angiografía, dos de los cables de guía de 0,014 pulgadas están avanzadas, una en la LAD y uno en la arteria coronaria circunfleja (LCX) para fijar la posición del catéter. </li><li> Sangre arterial (-20 ml) se extrae de la sonda. Para evitar la isquemia durante la infusión, la mitad de la sangre diluida se utiliza para la solución. El virus se mezcla con la sangre de 10 ml y se diluyó a 20 ml de solución salina. Los restantes 10 ml también se diluye a 20 ml y se utiliza entregar virus residual en la luz del catéter. </li><li> Nitroglicerina por vía intravenosa (20 mg / min) se inicia a través de la vena de la oreja. </li><li> La punta del catéter se coloca en la porción proximal de las vías principales a la izquierda. La presión a través del catéter se controla para asegurar que el catéter no se acuña. </li><li> La sangre del virus mixtos (15 ml) se inyecta a través del catéter de más de 15 minutos usando una bomba de infusión en la arteria coronaria izquierda. Después de 15 minutos, la jeringa se cambia a color, y la infusión se continuó durante 10 minutos. </li><li> Un alambre y un catéter se fija a la arteria coronaria derecha del mismo modo que la arteria coronaria izquierda. </li><li> El restante 5 ml de sangre mezclada con el virus se inyecta en la arteria coronaria derecha durante 5 minutos seguido de 10 minutos de descarga. </li></ol> 3. Representante de casos La figura 1 muestra la ventriculografía izquierda en un mes después de la creación del infarto de miocardio. El movimiento de la pared ventricular izquierda es significativamente afectada con una fracción de eyección (FE) de laEl 31%. La figura 2 muestra las secciones transversales del ventrículo izquierdo en un mes. Una gran cicatriz desde la base hasta el vértice de la pared anterior se ve. El EF promedio de 1 mes después de infarto de miocardio en este modelo es del 36% y el volumen diastólico final promedio es de 83 ml, mientras que el promedio de las de los animales del mismo tamaño, sin un infarto de miocardio es del 68% y 42 ml, respectivamente. La Figura 3 muestra la expresión de beta-gal en el área de la zona del ventrículo izquierdo borde de 1 mes después de la inyección de virus adeno-asociado (2 x 10 12 partículas de DNAsa Resistente rAAV1 CMV Lac-Z). Una mayor expresión se encuentra en la zona de la inyección del virus. <img src="/files/ftp_upload/2778/2778fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Fracción de la figura 1. Eyección de ventriculografía izquierda un mes después de la creación de miocardio infarto. Ventrículo izquierdo se dilata a 92,5 ml y movimiento de la pared anterior se ve afectada de manera significativa. <img src="/files/ftp_upload/2778/2778fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Las secciones transversales del ventrículo izquierdo, 1 mes después del infarto de miocardio creación, manchado por el cloruro de trifenil tetrazolio para delinear la zona de la cicatriz. Una gran cicatriz desde la base hasta el vértice de la pared anterior se ve. <img src="/files/ftp_upload/2778/2778fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Beta-gal expresión inducida por virus adeno-asociado (2 x 10 12 partículas DNAsa resistentes de rAAV1 CMV Lac-Z). Una mayor expresión se encuentra en el área de la zona fronteriza entre el infarto y el tejido normal, un mes después de la inyección intracoronaria de virus. Imagen inferior derecha muestra el control negativo, donde se inyectó una solución salina normal sólo en las arterias coronarias con el mismo protocolo.

<ol><li>Perez de Prado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-chest+experimental+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).</li>
<li>Angeli, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+remodeling+after+myocardial+infarction%3A+characterization+of+a+swine+model+on+beta-blocker+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy.</a> Comp Med. 59, 272-279 (2009).</li>
<li>Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &amp, Sidi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+myocardial+stunning+randomly%2C+with+either+propofol+or+isoflurane+following+transient+coronary+occlusion+and+reperfusion+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Card+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs.</a> Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).</li>
<li>Jaski, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+upregulation+by+percutaneous+administration+of+gene+therapy+in+cardiac+disease+%28CUPID+Trial%29%2C+a+first-in-human+phase+1%2F2+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Card+Fail%22%5BJournal%5D)">Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial.</a> J Card Fail. 15, 171-181 (2009).</li>
</ol>

Todos los autores no tienen asociaciones comerciales que pudieran representar un conflicto de intereses en relación con el manuscrito.

Entre las diversas causas de la insuficiencia cardíaca, isquemia es por mucho el más frecuente en la etiología. Para superar esta grave enfermedad, diversos enfoques terapéuticos se están desarrollando. Cuidadosas evaluaciones de los tratamientos se requieren antes de que estas terapias prometedoras se puede aplicar a las clínicas. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo de insuficiencia cardíaca isquémica, que representa las condiciones clínicas de los pacientes es fundamental para el desarrollo de las terapias d...

<table><tbody><tr><td>Telazol</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>0856-9050-49</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323-270-20</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>Amiodarona</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323-616-03</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de atropina</td><td>Med-Pharmex</td><td>54925-063-10</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de potasio</td><td>American Regent Inc.</td><td>2053-25</td><td></td></tr><tr><td>Nitroglicerina</td><td>American Regent Inc.</td><td>4810-25</td><td></td></tr><tr><td>Salix (Furosemida)</td><td>Intervet Inc.</td><td>710461</td><td></td></tr><tr><td>Catéter tipo palo de hockey de 5 Fr</td><td>Cordis</td><td>556-278-0L</td><td></td></tr><tr><td>Catéter tipo palo de hockey de 7 Fr</td><td>Cordis</td><td>778-278-00</td><td></td></tr><tr><td>Alambre coronario</td><td>Abbott Laboratories</td><td>1044588</td><td></td></tr><tr><td>Globo coronario</td><td>Abbott Laboratories</td><td>1009447-08</td><td></td></tr><tr><td>Introducer de 8 Fr</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>RSS801</td><td></td></tr></tbody></table>

transferencia génica para la insuficiencia cardiaca isquémica en un modelo preclínico

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Varias tecnologías emergentes se están desarrollando para los pacientes con insuficiencia cardíaca. Bien establecidas las evaluaciones preclínicas son necesarios para determinar su eficacia y seguridad. La terapia génica con vectores virales es uno de los enfoques más prometedores para el tratamiento de las enfermedades cardíacas. Entrega viral de varios genes diferentes, cambiando el portador del gen tiene un potencial terapéutico incalculable. En este video, el proceso completo de un modelo animal de la creación de la insuficiencia cardíaca seguida de la transferencia de genes se presenta con un modelo porcino. En primer lugar, el infarto de miocardio es creado por la oclusión de la descendente anterior izquierda proximal arterias coronarias. Resultados corazón de remodelación en la insuficiencia cardíaca crónica. Único en nuestro modelo es una cicatriz bastante grande que refleje verdaderamente los pacientes con insuficiencia cardíaca grave que requieren una terapia agresiva para lograr resultados positivos. Después de la creación de miocardio infarto y el desarrollo de tejido cicatricial, una inyección intracoronaria de virus se demuestra con la infusión de nitroglicerina simultánea. Nuestro método de inyección proporciona una transferencia de gen simple y eficiente con una mayor expresión de los genes. Esta combinación de un infarto de miocardio modelo de cerdos con el virus de la entrega intracoronaria ha demostrado ser una metodología consistente y reproducible, lo que ayuda no sólo para probar el efecto de los genes individuales, sino también comparar la eficacia de muchos genes como candidatos terapéuticos.

Un método de transferencia génica para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca isquémica se describe usando un modelo porcino de infarto de miocardio. Nuestro método simple y reproducible que nos permite evaluar fácilmente la eficacia de la transferencia de genes diferentes con una forma muy sencilla y reproducible.

Transferencia génica para la insuficiencia cardiaca isquémica en un modelo preclínico

Se están desarrollando diversas tecnologías emergentes para pacientes con insuficiencia cardíaca. Son necesarias evaluaciones preclínicas bien establecidas para determinar...

Terapia génica. El uso de vectores virales es uno de los enfoques más prometedores para tratar enfermedades cardíacas. En este video se presentan los procedimientos para crear un modelo de insuficiencia cardíaca isquémica, así como la entrega génica mediante vectores virales.El primer paso consiste en crear un infarto de miocardio en un modelo porcino. Para ello, se introduce un alambre coronario en la arteria coronaria, seguido de un balón de oclusión. Mediante acceso endovascular, se inflará el balón para ocluir completamente la arteria coronaria.Como resultado, se crea un infarto extenso en la zona anterior, y los cerdos desarrollarán insuficiencia cardíaca crónica. El siguiente paso es la inyección del virus. Los vectores virales se inyectan lentamente en la arteria coronaria.Será transportado por el torrente sanguíneo y distribuido en el miocardio. El virus entrará en los cardiomiocitos, luego en el núcleo, y enviará señales para crear proteínas. Las proteínas expresadas fortalecerán el rendimiento cardíaco y aumentarán la función general.En este video, presentamos los procedimientos para la terapia génica de la insuficiencia cardíaca isquémica utilizando un modelo porcino. Primero, mostraremos cómo crear una lesión miocárdica en el ápice, y luego procederemos a demostrar la administración intracoronaria de un vector viral. Utilizamos este procedimiento para evaluar la eficacia y la seguridad de diversas transferencias génicas.Entonces comencemos. Para iniciar el procedimiento, se induce la anestesia en el cerdo utilizando telazol. Se establece una vía intravenosa en la vena de la oreja y luego se intuba al cerdo.Coloque al cerdo en posición recostada dorsalmente. Utilice propofol para la anestesia general durante el experimento. Para mantener la presión arterial, limpie el área de la ingle con alcohol seguido de yodo.Cubra el sitio con una sábana estéril y prepare todo de forma estéril. Puncione la arteria femoral con una aguja de calibre 18 utilizando el método de Seldinger. Cuando observe flujo retrógrado pulsátil, inserte el alambre y luego coloque la vaina; tras la inserción de la vaina, inyecte heparina para prevenir la formación de trombos durante el experimento.A continuación, prepare una bolsa salina con 75 miligramos de amiodarona, 20 miliequivalentes de potasio y 20 miligramos de atropina, y utilice una velocidad de 150 mililitros por hora. Se administra una inyección intramuscular de 75 miligramos de amiodarona en este momento. Introduzca el catéter guía en el ostio de la arteria coronaria izquierda y realice un angiograma para evaluar las anatomías coronarias.Introduzca cuidadosamente el alambre en la arteria coronaria descendente anterior izquierda. A continuación, avance el balón sobre el alambre hacia la arteria coronaria. Realice un angiograma para verificar la posición del balón.Se debe realizar otra angiografía desde un ángulo diferente para verificar la posición del balón. Luego, inflar gradualmente el balón hasta tres ATM. Realizar otra angiografía para confirmar la oclusión de la arteria.Monitoree al cerdo mediante la presión arterial y la electrocardiografía. En ocasiones, el cerdo entrará en fibrilación ventricular. Desfibrile al cerdo con una descarga de corriente directa lo antes posible.Si el intento falla, comprima el tórax hasta que los cargadores del cardioversor estén listos y administre otro choque. Observe durante 90 minutos e infle el balón. Una vez que la presión arterial y la arritmia se hayan estabilizado, retire la vaina y recupere el cerdo.Administre una inyección intramuscular de nitroglicerina y furosemida, así como sueros durante la noche que contengan amiodarona. Prepárese con mascarilla quirúrgica, gafas, bata y guantes. El cerdo se prepara de la misma manera que para la creación de infarto de miocardio.Introduzca un alambre coronario en la arteria coronaria descendente anterior izquierda y otro en la arteria coronaria circunfleja izquierda. Coloque un catéter en el ostium. Extraiga 20 mililitros de sangre arterial utilizando 10 mililitros para la inyección del virus y el resto para el lavado.Mezcle el virus con 10 mililitros de sangre y dilúyalo hasta 20 mililitros con solución salina. Luego, diluya la sangre restante con solución salina hasta 20 mililitros y divídala en dos jeringas. Conecte la jeringa que contiene la sangre mezclada con el virus al catéter y prepárese para la infusión.Se inicia una inyección intravenosa de 20 microgramos por minuto de nitroglicerina a través de la vena auricular, realizando la angiografía para verificar la posición del catéter. Luego, se comienza la inyección del virus con una velocidad de un mililitro por minuto cuando se han inyectado 15 mililitros en la arteria coronaria izquierda. Se cambia la jeringa para el lavado y se utiliza la misma velocidad de inyección. Tras la inyección en la arteria coronaria izquierda, se realizará el mismo procedimiento en la arteria coronaria derecha utilizando los cinco mililitros restantes de sangre que contienen el virus.Un mes después de la creación del infarto de miocardio, el P desarrollará insuficiencia cardíaca con movimiento parietal alterado y corazón dilatado. La fracción de eyección promedio un mes después del infarto de miocardio en este modelo es del 36 % y es significativamente más baja que en cerdos del mismo tamaño sin infarto de miocardio. El volumen diastólico final promedio es de 83 mililitros, mientras que el promedio de un control es de 42 mililitros.DP DT también fue significativamente más bajo en los cerdos con infarto de miocardio. Estas son secciones transversales del ventrículo izquierdo. A un mes después del infarto de miocardio, se observa una cicatriz extensa desde la base hasta el ápice de la pared interior.Esta imagen muestra la expresión gálea. Un mes después de la transferencia génica mediante un virus asociado al diente, se encontró una expresión significativa en la zona inyectada con el virus. Acabamos de mostrarle cómo crear un efecto miocárdico en un cerdo, así como la inyección del virus de la corona.Esta combinación de modelo de fallo I y entrega de genes es un método sencillo y reproducible para probar diversos tipos de terapias génicas en enfermedades de evolución progresiva. Gracias por vernos y por acompañarnos en sus futuros experimentos P.

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Nuevas estrategias terapéuticas en medicina regenerativa cardiaca requieren extensos y detallados estudios en modelos animales preclínicos grandes antes que pueden ser considerados para el uso en seres humanos. Aquí, demostramos una técnica de inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica en conejos, que es valiosa para la hipótesis que prueba la eficacia de estas nuevas terapias.

Inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica y entrega de celular en un modelo preclínico grande

Aquí presentamos un protocolo para la manipulación de genes específicos cardiacos en ratones. Bajo anestesia, los corazones de ratón fueron externalizados a través del cuarto espacio intercostal. Posteriormente, adenovirus codificación genes específicos fueron inyectados con una jeringa en el miocardio, seguido por la medida de expresión de la proteína vía proyección de imagen en vivo y Western blot análisis.

Un método sencillo y eficaz para la manipulación In Vivo de Gene cardiaco específico por inyección intramiocárdica en ratones

Aquí presentamos un protocolo para la inducción de la criocauterización ventricular izquierdo seguido de la implantación de un parche de músculo cardiaco, derivado de los cardiomiocitos células iPS humanas en un modelo del conejillo de Indias.

Implantación de parches hiPSC derivado de músculo cardiaco después de lesión del miocardio en un modelo del conejillo de Indias

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Buscamos establecer un modelo porcino de insuficiencia cardíaca inducida por la obstrucción de la arteria circunfleja izquierda y un ritmo rápido para probar el efecto y la seguridad de la administración intramiocardial de células madre para terapias basadas en células.

Establecer un modelo porcino de infarto de infarto post-miocardio insuficiencia cardíaca para el tratamiento de células madre

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Presentamos un modelo de cardiopatía isquémica utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos, junto con un método para la evaluación cuantitativa del daño tisular causado por la isquemia. Este modelo puede proporcionar una plataforma útil para la detección de fármacos y la investigación adicional sobre enfermedades cardíacas isquémicas.

Modelo de cardiopatía isquémica y comparación basada en vídeo de la contracción de cardiomiocitos utilizando cardiomiocitos derivados de hiPSC

Este protocolo tiene como objetivo trasplantar un parche bioimpreso 3D en el epicardio de ratones infartos modelando insuficiencia cardíaca. Incluye detalles sobre la anestesia, la abertura quirúrgica del pecho, la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y la aplicación de un parche bioimpreso en la zona infarta del corazón.

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La terapia génica miocárdica para la cardiopatía isquémica es muy prometedora para futuras terapias. Aquí, presentamos un modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico.

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