Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

El objetivo general del siguiente experimento es seguir la absorción de mitocondrias en el VAE como un medio para estudiar la autofagia de las mitocondrias, un proceso conocido como mitofagia. Esto se logra mediante la expresión en células de levadura, un biosensor de pH de fluorescencia de doble emisión codificado genéticamente y dirigido mitocondrialmente llamado Mt Rosea que marca las mitocondrias con fluorescencia roja y verde. Como segundo paso, las células de levadura se someten a la inanición de nitrógeno para inducir la autofagia.

A continuación, observamos las células mediante microscopía de fluorescencia o microscopía de barrido láser confocal para visualizar la absorción de mitocondrias en el VA. Se obtienen resultados que muestran la acumulación de fluorescencia roja pero no verde en los AV de las células carentes de nitrógeno. Indicativo de la puntuación de autofagia de las células de una población permite determinar el grado de mitofagia.

El uso de rosea para monitorear la absorción de mitocondrias en la vacuola de las células de levadura puede proporcionar información mecanicista sobre el proceso de mii. El enfoque se puede adaptar para monitorizar la autofagia de otros compartimentos celulares, como el núcleo que demuestra el procedimiento, será dalibor alica, investigador postdoctoral de nuestro laboratorio. En este protocolo utilizamos la cepa de tipo salvaje BY 4 7 41, y una cepa mutante de deleción delta A TG tres, derivada del mismo fondo genético para visualizar la localización de las mitocondrias.

En estas cepas, se marcan con un indicador fluorescente. Rosea Rosea es un biosensor de emisión de doble color que comprende una proteína fluorescente roja relativamente estable al pH y una proteína fluorescente verde sensible al pH. La secuencia diana mitocondrial se utiliza para dirigir el biosensor Rosea a la matriz mitocondrial.

Este reportero ha sido bautizado como Mt.Rosea: a pH alto, el biosensor emite fluorescencia tanto roja como verde. Sin embargo, a pH bajo solo emite fluorescencia roja. La cepa de tipo salvaje es un control para indicar los niveles de autofagia que normalmente se esperan como un control negativo.

Una cepa nula para la expresión de un gen esencial de autofagia es adecuada. Dado que una cepa de este tipo no puede entregar mitocondrias a la vacuola, se utilizan procedimientos estándar para transformar las cepas de levadura con el plásmido que lleva las placas de crecimiento indicadoras de rosala objetivo mitocondrial durante dos a cuatro días a 28 a 30 grados Celsius hasta la aparición de colonias de aproximadamente dos a tres milímetros de diámetro para cultivar células para la inducción de la autofagia. Inocular para cada cepa, una sola colonia de levadura en 10 mililitros de crecimiento. Medio que contiene una fuente de carbono no fermentable.

En este caso, etanol y los suplementos atróficos de buey adecuados. Se cultivan cultivos duplicados para cada cepa, lo que da como resultado un total de cuatro cultivos. Incubar los cultivos de levadura durante aproximadamente 48 horas a 28 a 30 grados Celsius con agitación orbital, momento en el que los cultivos deben estar en la fase logarítmica media de crecimiento.

Al final del período de incubación, transfiera dos muestras de un mililitro de cada cultivo a 1,7 mililitros. Los tubos de centrífuga de plástico con tapa a presión granulan suavemente las celdas por centrifugación a baja velocidad. Después de la centrifugación, retire con cuidado y deseche el sobrenadante de cada tubo sin alterar la pastilla de la célula.

Lavar las células con un mililitro de agua destilada estéril por resuspensión, seguida de centrifugación. Repita el lavado dos veces más para eliminar el medio residual. Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en 100 microlitros de crecimiento, medio o inanición de nitrógeno.

El medio de inanición de nitrógeno medio contiene la fuente de carbono etanol, pero carece de suplementos de nitrógeno e inducirá la autofagia en las células. A continuación, vuelva a inocular las células resuspendidas en 10 mililitros de crecimiento fresco. Medio o 10 mililitros de inanición de nitrógeno. Medio.

Incubar los cultivos con agitación orbital durante seis a 12 horas después de la inducción de la autofagia. Es útil confirmar la entrega de Mt Rosea a los vae bajo el microscopio de fluorescencia. El vae se puede localizar marcando con un colorante fluorescente azul a base de cumerina, como siete aminoácidos cuatro clorometilcumerina, L arginina mi cmac arg para abreviar.

No es necesario realizar el etiquetado con cmac ARG de forma rutinaria, pero se recomienda para aquellos que no están familiarizados con la ubicación y la apariencia de la vacuola en la levadura. Para comenzar el procedimiento de etiquetado de la vacuola, transfiera muestras de un mililitro de cada cultivo a tubos de centrífuga de plástico de 1,7 mililitros separados. A continuación, añada cmac arg a cada tubo.

Incubar los tubos a 28 a 30 grados centígrados con agitación orbital durante 30 minutos. Después de 30 minutos, granule las células por centrifugación, deseche el sobrenadante, lave las células con un mililitro de agua destilada estéril en suspensión, seguido de centrifugación. Lave las células dos veces más con agua destilada estéril.

Este paso elimina el medio residual y el exceso de matriz cmac arg. Después del tercer lavado, resus suspender las células en 100 microlitros de agua destilada estéril. Las células ya están listas para ser montadas para la obtención de imágenes mediante microscopía de fluorescencia.

A la hora de llevar a cabo este protocolo, es muy importante utilizar cultivos de levadura recién transformados para asegurarse de obtener células T con mitocondrias altamente fluorescentes. Para preparar células de levadura vivas para la obtención de imágenes por microscopía fluorescente, primero se derriten dos miligramos de aeros de bajo punto de fusión en alícuotas separadas de un mililitro de medio de crecimiento y medio de inanición de nitrógeno incubando a 70 grados Celsius durante una hora, el aros fundido se mantiene a 70 grados Celsius. Para montar las células, coloque 20 microlitros de aros fundidos en un microscopio de vidrio marcado de 76 por 26 milímetros.

Deslice inmediatamente 10 microlitros de la suspensión de celda lavada sobre el lecho aros. Cubra la cama aros con un cubreobjetos de vidrio de 22 por 22 milímetros. Las células se extenderán por la superficie del agro debajo del cubreobjetos.

A continuación, selle cuidadosamente los bordes del cubreobjetos con una fina película de esmalte de uñas. Esto evitará la deshidratación y el movimiento del cubreobjetos Durante la obtención de imágenes, cuando el esmalte de uñas está completamente seco, los portaobjetos están listos para ser vistos por las células de microscopía de fluorescencia montadas. El uso de esta técnica se puede observar hasta una hora después del montaje sin ningún efecto adverso aparente en las células.

Dado que las células de levadura son relativamente pequeñas, necesitará un microscopio de fluorescencia de buena calidad equipado con filtros de emisión de excitación adecuados para la visualización separada de la emisión de GFP y la emisión de RFP y una lente de objetivo de inmersión en agua de 60x con una apertura numérica de 1,2. Resultados típicos obtenidos utilizando MT Rosea expresada en células de tipo salvaje y utilizando escaneo láser confocal. La microscopía se muestra aquí en condiciones sin falta de energía con etanol como fuente de carbono, mientras que las células tipo exhiben una distribución celular típica de mitocondrias en la periferia de las células de levadura que muestran fluorescencia roja y verde.

La emisión de fluorescencia roja y verde no se detecta en la vacuola. Cuando MT. Las células que expresan rosea de tipo salvaje se someten a inanición de nitrógeno durante seis horas y más. Presentan, además de la fluorescencia roja y verde correspondiente a las mitocondrias, la acumulación de fluorescencia roja pero no verde en el va.

Esta señal ular es indicativa de autofagia. La absorción autofágica de las mitocondrias ular. La localización de la rosada se puede confirmar por separado utilizando CMAC arg.

Por el contrario, las células de control negativas mitofágicas que expresan MT. La rosada observada antes de la inanición y después de seis horas y más de inanición no muestra acumulación de fluorescencia roja en la vacuola. Si bien el marcaje mitocondrial sigue siendo sólido para evaluar el nivel de autofagia en las cepas mutantes de tipo salvaje y A TG tres, se observaron más de 200 células por cepa para la acumulación de fluorescencia roja en el ole antes de la inducción de la autofagia y en puntos de tiempo seleccionados. Después de la inducción de la autofagia, el trazado de la proporción de células que muestran acumulación ular revela que el grado de absorción ular aumenta con el tiempo en las células de tipo salvaje. pero no en delta ATG, tres células mutantes que no pueden entregar mitocondrias a la vacuola después de su desarrollo. Esta técnica abre el camino para que los investigadores en el campo de la autofagia exploren la entrega de mitocondrias y otros orgánulos, como el núcleo, al VA y las diversas condiciones de crecimiento en estas células.