Name: Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprende a generar y etiquetar células dendríticas de médula ósea murina con nanocristales Qdot para estudios de seguimiento por microscopía de fluorescencia. Este método permite visualizar la migración celular in vivo con señal estable.

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Este trabajo apoyado en parte por el NIH virtud de la subvención R15 CA137499-01 (FB) y un fondo de inicio de la Universidad de Ohio (FB).

1. La disección de los fémures y tibias del ratón y el cultivo de células de médula ósea <ol><li> Sacrificio de dos ratones por asfixia de CO 2 y diseccionar cuidadosamente tibias y fémures sin cortar los extremos de los huesos. </li><li> Limpiar los huesos de todos los tejidos adheridos mediante el uso de papel de seda. Tenga cuidado de no romper los huesos. </li><li> Esterilizar los huesos por inmersión en etanol al 70% durante 10 minutos en un 35 mm placa de Petri. A partir de este momento, el trabajo dentro de una campana de bioseguridad para evitar la contaminación de los cultivos celulares. </li><li> Recuperar los huesos del etanol y dejar secar al aire durante 5 minutos en una placa de Petri en el interior del gabinete de bioseguridad. </li><li> Corte el fémur por la mitad, y la tibia por su extremo más delgado. Infundir el interior del hueso con 1 ml de medio RPMI (sin suero, pero con los antibióticos) con una jeringa estéril en una placa de Petri estéril. </li><li> La suspensión de células se recogieron y se lavaron 2 veces en medio RPMI por centrifugación de 10 minutos en un tubo de 15 ml, se centrifuga a 1.100 rpm en una centrífuga refrigerada (4 ° C) con un rotor basculante. </li><li> Después del último lavado, resuspender las células en 2 ml de solución amortiguadora de lisis ACK e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente con el fin de eliminar las células rojas de la sangre. </li><li> Añadir 13 ml de RPMI con 10% de SFB, resuspender y lavar 2 veces en este medio con la misma configuración que se describe en 1.6. </li><li> Recuento de células, se ajustan a 2 x 10 5 células / ml con RPMI 10% FBS, y añadir rm-GM-CSF (20 ng / ml concentración final) 5. </li><li> Agregar 10 ml de esta suspensión a una calidad de estéril, microbiológicos, 10 cm plato de Petri, y la cultura en una incubadora de CO 2 (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Tres días después, añadir otro 10 ml de RPMI 10% FBS con 20 ng / l de rmgm-CSF a cada uno de los platos preparados. </li><li> Tres días después, 10 ml de suspensión celular se recuperan de cada placa de Petri, se centrifuga como en 1.6, se resuspendieron en el mismo volumen de RPMI 10% FBS con rmgm-CSF y regresó a la placa de Petri. Las células se cultivan durante 2 días más en la incubadora de CO 2. </li></ol> 2. Recogida y etiquetado de los países en desarrollo <ol><li> Después de 8 días en cultivo de células de baja adherencia son recuperados por lavado de las placas de Petri con medio fresco. Este protocolo hace alrededor de 4.2 x 10 8 países en desarrollo en nuestras manos. Las células pueden ser analizados para DC fenotipo por citometría de flujo. </li><li> Las células obtenidas son etiquetados con la Qtracker 655 Kit de etiquetado celular siguiendo estrictamente las instrucciones del fabricante. </li><li> Tenemos excelentes resultados etiquetado derivadas de médula ósea murina países en desarrollo con Qdots a una concentración de 10 nM. Para lograr esto, las alícuotas de los componentes Qtracker Celular Kit de etiquetado A y B se mezclan en volúmenes iguales, se incubaron 5 minutos a temperatura ambiente, e inmediatamente se diluye 1 / 100 en medio fresco con agitación durante 30 s. </li><li> Para la tinción de 5 x 10 6 países en desarrollo, mezcla de 5 l de cada componentes del equipo A y B en un tubo eppendorf y se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añadir 1 ml de RPMI 10% FBS incubar, y agitar durante 30 segundos. </li><li> Añadir 0,5 ml de suspensión celular que contiene 5 x 10 6 países en desarrollo, y se incuba a 37 ° C durante 60 min. </li><li> A continuación, lavar las células 2 veces en RPMI 10% FBS (1100 RPM). Las células pueden ser resuspendidas en RPMI a la cultura más o en PBS para la inyección en ratones de experimentación. </li></ol> 3. Evaluación de la DC etiquetado <ol><li> Etiquetado de células pueden ser evaluados por medio de microscopía de fluorescencia. Para lograr esto, una gota de suspensión celular se añade a un portaobjetos de microscopio, cubierta con un cubreobjetos, y se evaluaron con un microscopio de fluorescencia teniendo en cuenta que estos Qdots tienen espectros de emisión y excitación de 565nm 525nm y 405, respectivamente (Fig. 3 ) </li><li> En este punto, las células marcadas se pueden utilizar para inyectar animales, o la maduración puede ser inducida mediante la incubación de estas células durante 48 h (37 ° C, 5 CO 2) en presencia de LPS (100 ng / ml) y TNF (- 20 ng / ml). Fluorescentes de etiquetado no se ve afectada por la maduración de DC (Fig. 4). </li></ol> 4. Los resultados representativos: Por la presente se describe cómo preparar derivadas de médula ósea murina países en desarrollo y cómo se les etiqueta con Qdots fluorescentes. Fig. 1 resume el procedimiento para obtener la célula, mientras que la figura. 2 describe el procedimiento para la etiqueta del Qdots. Como se muestra en la figura. 3, casi todas las células están marcadas por este procedimiento, y esto no se ve afectada por la maduración de DC con factores inflamatorios (Fig. 4). Fig. 5 muestra que Qdot manchada de países en desarrollo (Fig.5a) se comportan similares a los no-células teñidas cuando son tratados con un cóctel inflamatoria. Ambas preparaciones de células similar regular al alza la expresión de moléculas coestimuladoras (Fig. 5b), y producen cantidades similares de IL-6 (Fig. 5c) y el óxido nítrico (Fig. 5d) a los estímulos de maduración. Esto concuerda con PreviOU datos publicados indican que la tinción Qdot no afecta a la capacidad de las DC para convertirse en células maduras capaces de inducir respuestas inmunes [6]. Estas células se pueden utilizar para la inyección de los animales de experimentación. Como se muestra en la figura. 6, 2 días después de la inyección intravenosa de los países en desarrollo etiquetados en ratones, que fueron capaces de detectar Qdot células teñidas en el bazo. Esto también está de acuerdo con los anteriores datos publicados muestran el uso de nanocristales Qdot para evaluar la migración de la CD en vivo [6], de imagen no invasivas y citometría de flujo. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo de generación de DC de la médula ósea. Por la presente nos muestran el proceso para obtener médula ósea procedentes de DC. Ambas tibias y fémures, se disecan y limpieza del tejido circundante. Puntas de hueso y se conservan en el interior de los huesos se vuelcan con el medio. Después de la eliminación de las células rojas de la sangre, las células de la médula ósea se cultivan durante 8 días en presencia de GM-CSF para diferenciarse en los países en desarrollo. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Diagrama de flujo del procedimiento de etiquetado. Alícuotas iguales de los componentes Qtracker Celular Kit de etiquetado A y B se mezclan en un tubo eppendorf. Las células dendríticas se obtienen a partir de cultivos de 8 días de médula ósea con GM-CSF y se mezcla con el tinte de etiquetado para los 60 min a 37 º C. Luego se lavan las células en los medios de comunicación para eliminar el exceso de partículas de etiquetado. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Microfotografía fluorescente de los países en desarrollo inmediatamente después de etiquetado. Una gota de células marcadas se depositó en un portaobjetos de vidrio y cubierta por un cubre. Luego, las muestras fueron evaluadas en un microscopio de fluorescencia y las imágenes fueron adquiridas a través de una cámara de 5,0 Micropublisher Color Digital CCD (Qimaging, Surrey, BC Canadá). <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Microfotografía fluorescente de los países en desarrollo después de 48 h de maduración in vitro. Los países en desarrollo la etiqueta se cultivaron durante 48 h con LPS (100 ng / ml) y TNF-α (20 ng / ml) en placas de vidrio en una incubadora de CO 2 (37 ° C, 5% de CO 2). Luego, las muestras fueron lavadas con PBS (5 min, 2X), se fija con acetona (15 min, 4 ° C) y de contraste con DAPI. Las células fueron evaluadas en un microscopio de fluorescencia que el anterior. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. La actividad biológica de los países en desarrollo Qdot maduro manchado. Los países en desarrollo etiquetados madurados in vitro que el anterior fueron analizadas por citometría de flujo (A) y (B). (A) Qdot células teñidas dar una señal fuerte en el FL3 (PerCP) del canal. Sombra histograma: control sin mancha. (B) Los países en desarrollo Qdot-teñidas y sin teñir, además, se tiñeron con anticuerpos específicos frente a la maduración de los marcadores CD86 y CD40, y controles de isotipo. Las células fueron analizadas en un citómetro de flujo FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA). Además, IL-6 (C) y el óxido nítrico (NO) se determinó en los sobrenadantes de madurez Qdot manchada de países en desarrollo y los controles. Los niveles de IL-6 y el óxido nítrico se determinó mediante un análisis de ELISA y el ensayo de Griess como hemos descrito previamente 7, 8. Todos los datos que aparecen en esta figura es representativa de dos o tres experimentos independientes que muestran resultados similares. Los datos fueron analizados por ANOVA utilizando el software GraphPad. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Detección de los centros de datos etiquetados en los tejidos disecados. Etiquetados DC maduras (1x10 6 células) fueron inyectados por vía intravenosa en ratones C57BL / 6. (A) Dos días después los ratones fueron sacrificados y se colectaron los bazos, congelados snap, incrustado en octubre, y 8 secciones M preparada con un criostato. Luego, las muestras fueron fijadas con acetona (15 min, 4 ° C) y de contraste con DAPI. Las células fueron evaluadas en un microscopio de fluorescencia como por encima de la figura 6a:. Magnificación de 40X, la figura 6b: un aumento de 100X, fig. Ampliación 6C, 400X.

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Murino mieloide) países en desarrollo han sido ampliamente utilizados para determinar la eficacia y la mejora de la DC, vacunas, investigar DC: las interacciones de las células T o el desarrollo de DC, y determinar su papel en varias enfermedades 9-11. Por la presente se muestra cómo se generan los países en desarrollo a partir de precursores recuperado de médulas óseas de tibia y fémur. Recuperamos los huesos sin cortar las puntas, lo que nos para esterilizarlos por inmersión en etanol al 70%, reduciendo así la probabilidad de contaminación. Para diferenciar los países en desarrollo a partir de células de médula ósea y sólo la usamos GM-CSF como se describió anteriormente 5. Aunque algunos también utilizan protocolos de IL-4, se ha informado de que esta citocina no es necesario cuando se trabaja con altos niveles de GM-CSF 12. De hecho, hemos demostrado que estos países en desarrollo son capaces de inducir respuestas inmunes 13. También, el cuidado debe ser tomado para recuperar sólo las células de baja adherencia a partir de cultivos de 8 días a lavar los platos Petri con medio ya que las células adjuntas muestran un fenotipo más monocitos-like. Aquí se muestra el etiquetado de los países en desarrollo con partículas fluorescentes Qdot. Esta etiqueta tiene algunas ventajas respecto a otros métodos. En primer lugar, las partículas Qdots se incorporan fácilmente a las células. En segundo lugar, la señal fluorescente es muy alto y no se altera por la maduración de las DC. En tercer lugar, la fluorescencia no se pierde cuando las células o los tejidos se fijan con solventes como la acetona, contrariamente a lo que sucede si GFP se utiliza para etiquetar los países en desarrollo 14, dando una mayor flexibilidad en el momento de elegir los protocolos de tinción. Finalmente, la señal fluorescente de alta dada por estas partículas permite la visualización de las células de los tejidos a pesar de autofluorescencia. Como se describió anteriormente 6, tinción Qdot no afectó la capacidad de maduración de estas células. Por la presente nos muestran que Qdot manchado de los países en desarrollo se comportan de forma similar a como no manchada de países en desarrollo, upregulating moléculas estimuladoras, y la producción de IL-6 y el óxido nítrico en respuesta a estímulos inflamatorios. Aunque los países en desarrollo son células especializadas en el desencadenamiento de la respuesta inmune, se ha demostrado para participar en procesos patológicos como el cáncer y la aterosclerosis 4, 15, 16. Han sido también afirmó que participar en el proceso angiogénico 17, 18, ​​incluso sugirió que estructuralmente que participan en el desarrollo de nuevos buques 19, 20. Por lo tanto, los métodos que permiten el seguimiento de DC en vivo, y la determinación de su localización geográfica en diferentes tejidos 4, 21, 22 son muy valiosos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Ratones C57BL / 6 </td><td> Jackson laboratorios </td><td></td><td> Las hembras, 6-8 semanas de edad </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-119 </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino fetal, calificado </td><td> Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-096 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010-049 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer de lisis ACK </td><td> Lonza Walkersville, Inc </td><td> 10-548E </td><td></td></tr><tr><td> Recombinante murino GM-CSF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 315-03 </td><td></td></tr><tr><td> Qtracker 655 Celular Kit de etiquetado </td><td> Invitrogen </td><td> Q25021MP </td><td></td></tr><tr><td> Lipopolisacárido </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-eblps </td><td></td></tr><tr><td> Recombinante murino TNF alfa </td><td> Peprotech </td><td> 315-01A </td><td></td></tr><tr><td> CD86 de anticuerpos </td><td> BD Biosciences </td><td> 553691 </td><td></td></tr><tr><td> CD40 de anticuerpos </td><td> BD Biosciences </td><td> 553791 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema reactivo de Griess </td><td> Promega </td><td> G2930 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 de captura de anticuerpo </td><td> eBioscience </td><td> 13-7061-81 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 la detección de anticuerpos </td><td> eBioscience </td><td> 13-7062-81 </td><td></td></tr></tbody></table>

generación y etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales qdot de estudios de seguimiento

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Las células dendríticas (DC) son células profesionales presentadoras de antígeno (CPA) que se encuentran en los tejidos periféricos y en los órganos inmunológicos, tales como el timo, la médula ósea, el bazo, los ganglios linfáticos y las placas de Peyer 1-3. Los países en desarrollo presentes en la muestra de los tejidos periféricos del organismo por la presencia de antígenos, que ocupan, procesar y presentar en su superficie en el contexto de las moléculas de histocompatibilidad (MHC). Entonces, cargado de antígenos DC migrar a los órganos inmunológicos en los que presentan el antígeno procesado a los linfocitos T desencadenar una respuesta inmunitaria específica. Una forma de evaluar las capacidades migratorias de los países en desarrollo se les etiqueta con tintes fluorescentes 4. Por la presente nos demuestran el uso de Qdot nanocristales fluorescentes para etiquetar derivadas de médula ósea murina DC. La ventaja de este etiquetado es que Qdot nanocristales poseen fluorescencia duradera estable y de largo que los hacen ideales para la detección de células marcadas en los tejidos recuperados. Para lograr esto, las primeras células se recuperará de médulas óseas murina y se cultivaron durante 8 días en la presencia de colonias de granulocitos macrófagos factor estimulante con el fin de inducir la diferenciación de DC. Estas células se denominan entonces con Qdots fluorescentes de corta incubación in vitro. Células teñidas pueden ser visualizados con un microscopio fluorescente. Las células se pueden inyectar en animales de experimentación, en este momento o puede convertirse en células maduras en la incubación in vitro con estímulos inflamatorios. En nuestras manos, la maduración de DC no determinó la pérdida de la señal fluorescente ni manchas Qdot afectar a las propiedades biológicas de los países en desarrollo. Tras la inyección, estas células se pueden identificar en los órganos inmunes por microscopía de fluorescencia después de la disección típica y los procedimientos de fijación.

Dendríticas las células de captación de antígenos y migran hacia los órganos inmunes para presentar antígenos procesados ​​a los linfocitos T. Qdot nanocristales etiquetado proporciona una señal fluorescente de larga duración y estables. Esto permite el seguimiento de las células dendríticas a los diferentes órganos por microscopía de fluorescencia.

Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

Las células dendríticas (CD) son células presentadoras de antígenos (CPA) profesionales que se encuentran en los tejidos periféricos y en órganos inmunológicos como el timo, el hueso...

El objetivo general de este procedimiento es preparar células dendríticas para estudios de imagen mediante cristales nanométricos Q dot. Esto se logra primero aislado células de la médula ósea de fémures y tibias de ratón. A continuación, se establecen cultivos de células de la médula ósea para facilitar la diferenciación celular en células dendríticas en presencia de GM CSF.Luego, las células dendríticas se recuperan de los cultivos de células de médula ósea tras ocho días. El paso final del procedimiento consiste en teñir las células con nanocristales fluorescentes Q. En última instancia, las células dendríticas intensamente teñidas pueden visualizarse mediante microscopía de fluorescencia.La principal ventaja de utilizar esta tecnología en comparación con otros métodos, como el uso de células dendríticas marcadas con GFP, es que los puntos cuánticos conservan su fluorescencia incluso después de la tinción con disolventes orgánicos como la acetona. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biólogos de células dendríticas, como las propiedades de migración de estas células en distintas enfermedades o en el contexto de diferentes patologías. El procedimiento de tinción será demostrado por María Ali, una estudiante de posgrado de mi laboratorio.Tras el sacrificio, diseccionar cuidadosamente la tibia y los fémures de dos ratones sin cortar los extremos óseos. Luego, utilizar papel de tejido para limpiar todos los tejidos adheridos de los huesos, teniendo cuidado de no romperlos. En una cabina de seguridad biológica.Llene un plato de Petri de 35 milímetros con etanol al 70% y luego sumerja los huesos en el etanol durante 10 minutos. Después de que los huesos hayan sido esterilizados, retírelos del etanol y déjelos secar al aire durante cinco minutos en un plato de Petri nuevo. Ahora, corte el fémur por la mitad y la tibia por su extremo más delgado.Infunda el interior de los huesos con un mililitro de medio RPMI utilizando una jeringa estéril. Recoja la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros y lávela dos veces con medio RPMI mediante una centrifugación de 10 minutos a 300 ×g a cuatro grados Celsius en una centrífuga con rotor de cestillos oscilantes. Después del último lavado, resuspenda las células en dos mililitros de tampón de lisis CK e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para eliminar los glóbulos rojos.A continuación, agregue 13 mililitros de RPMI más 10% de FBS y lave las células otras dos veces en este medio con los mismos parámetros de centrífuga que antes. Cuente las células y ajuste la concentración a dos veces 10 a la quinta células por mililitro. Con RPMI más 10% de FBS, agregue G-M-C-S-F murino recombinante hasta una concentración final de 20 nanogramos por mililitro.Luego, agregue 10 mililitros de esta suspensión a una placa de Petri estéril de calidad microbiológica de 10 centímetros y realice el cultivo. Incube la suspensión celular en un incubador de dióxido de carbono. Tres días después, agregue otros 10 mililitros de RPMI más 10 % de FBS con 20 nanogramos por mililitro de G-M-C-S-F murino recombinante a cada una de las placas preparadas.Tres días más tarde, recupere 10 mililitros de suspensión celular de cada placa de Petri, centrifugue las células en las mismas condiciones y resuspenda el sedimento en el mismo volumen de RPMI más 10% de FBS recuperado de las placas de Petri, y reponga con nueva G-M-C-S-F murina recombinante. Finalmente, devuelva la suspensión celular a cada placa de Petri original y cultive las células durante dos días adicionales en el incubador de dióxido de carbono. Después de ocho días en cultivo, recupere las células flotantes y las adherentes débilmente lavando las placas de Petri con medio fresco.Luego, marque las células recolectadas con el kit de etiquetado de células Q tracker 6 55 siguiendo estrictamente las instrucciones del fabricante para etiquetar cinco veces 10 a la sexta de las dc derivadas de médula ósea murina con nanocristales Q a una concentración de 10 nano molar. Primero, mezcle cinco microlitros de cada uno de los componentes del kit A y B en un tubo einor, e incube la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue un mililitro de RPMI más 10 %FBS, y vortexee el tubo durante 30 segundos.A continuación, agregue cinco veces 10 a la quinta. Dcs suspendidas en 0,5 mililitros de RPMI más 10 %FBS al tubo einor e incube las células en la solución D a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Luego lave las células dos veces en RPMI más 10 %FBS en las mismas condiciones que antes, y resuspenda el precipitado en RPMI.Esta figura muestra un ejemplo de una microfotografía fluorescente de dcs. Inmediatamente después de la marcación, se depositó una gota de células marcadas sobre un portaobjetos y se cubrió con un cubreobjetos. Luego, las muestras se evaluaron utilizando un microscopio fluorescente.En esta figura, puede observarse una microfotografía fluorescente de DCs después de 48 horas, etiquetada tras la maduración in vitro. Las DCs se cultivaron durante 48 horas con 100 nanogramos por mililitro de LPS y 20 nanogramos por mililitro de TNF alfa en cámaras de cultivo sobre portaobjetos, en un incubador de dióxido de carbono. Luego, las muestras se lavaron con PBS, se fijaron con acetona, se contratinjeron con DAPI y se evaluaron mediante microscopía fluorescente.Los DC marcados madurados in vitro se analizaron mediante citometría de flujo. Las células teñidas con puntos cuánticos (Q dot) muestran una señal intensa en el canal FL3. Los DC teñidos y no teñidos con Q dot se tiñeron adicionalmente con anticuerpos específicos contra los marcadores de maduración CD86 y CD40, así como con controles de isotipo. Las células se analizaron posteriormente mediante citometría de flujo. Además, se determinaron los niveles de IL-6 y óxido nítrico en los sobrenadantes de los DC maduros teñidos con Q dot y de los controles.Aquí se muestra una figura representativa de DCS marcadas en un tejido disecado. Se inyectaron DC maduras por vía intravenosa en ratones C57 Black Six. Tres días después, los ratones fueron sacrificados y se recolectaron los bazo.Se congelaron rápidamente y se incluyeron en OCT, y se prepararon secciones de ocho micrómetros utilizando un criostato. Luego, las muestras se fijaron con acetona, se contratinjeron con DPI y se evaluaron mediante microscopía fluorescente. Tras seguir estos procedimientos.Pueden realizarse otros métodos, como la presentación de antígenos o la maduración con diferentes estímulos, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como la migración de las células dendríticas en respuesta a distintos estímulos de maduración.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La presentación de antígenos en los órganos linfoides secundarios por las células dendríticas es fundamental para el inicio de la célula T mediada por la respuesta inmune adaptativa. Aquí se demuestra la cultura de la médula ósea procedentes de células dendríticas murinas, la activación, y el etiquetado de dos fotones de imágenes.

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

Este video describe un protocolo para la generación de células dendríticas--células presentadoras de antígenos clave que activan las células T-- a partir de la médula ósea de un ratón adulto.

Generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea: un método para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón

El seguimiento de las células utilizando MRI ha ganado la atención notable en los últimos años. Este protocolo describe el etiquetado de las células dendríticas con flúor...

De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic

Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Después de la preparación de un anticuerpo monoclonal modificado-Cu 64 la unión a un receptor de células T murino transgénico, las células T son radiomarcado in vivo, se analizaron para viabilidad, la funcionalidad, la estabilidad etiquetado y apoptosis, y adoptivamente transferidas en ratones con una vía aérea hipersensibilidad de tipo retardado reacción para formación de imágenes no invasiva mediante tomografía de emisión de positrones / tomografía computarizada (PET / CT).

Murina de linfocitos Etiquetado por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Anticuerpo objetivo de receptores de<em&gt; En Vivo</em&gt; Tráfico de células mediante PET / CT

Aquí proporcionamos un método para la identificación y aislamiento de grandes cantidades de GM-CSF por células mieloides con clasificación de celda de alta velocidad. Pueden identificarse cinco poblaciones distintas (progenitores mieloides comunes, progenitores de granulocitos/macrófagos, monocitos, macrófagos derivados de monocitos y DCs derivados de monocitos) basado en la expresión Ly6C y CD115.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

En este artículo, nos proporcionan que un protocolo detallado para la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en médula ósea murina derivados de macrófagos y células dendríticas. El método se basa en la transducción de la médula ósea progenitores con retrovirales construcciones seguidas de diferenciación en macrófagos y dendríticas de las células en vitro.

Expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

Aprende a generar y etiquetar células dendríticas de médula ósea murina con nanocristales Qdot para estudios de seguimiento por microscopía de fluorescencia. Este método permite visualizar la migración celular in vivo con señal estable.

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