Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

El objetivo general de este procedimiento es preparar las células dendríticas para estudios de imagen utilizando nanocristales de punto Q. Esto se logra aislando primero las células de la médula ósea de la médula, los fémures y las tibias. A continuación, se establecen cultivos de células de médula ósea para facilitar la diferenciación celular en células dendríticas en presencia de LCR transgénico.

Luego, las células dendríticas se recuperan de los cultivos de células de médula ósea después de ocho días. El paso final del procedimiento es teñir las células con nanocristales fluorescentes de Q. En última instancia, las células dendríticas teñidas con brillo se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia.

La principal ventaja de usar esta tecnología en comparación con otros métodos, como el uso de células dendríticas con etiqueta GFP, es que los nanocristales de punto Q conservan su fluorescencia incluso después de teñirse con solventes orgánicos como la acetona. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los biólogos de células dendríticas, como las propiedades de migración de estas células en diferentes enfermedades o en el contexto de diferentes enfermedades. La demostración del procedimiento de tinción estará a cargo de Maria Ali, una estudiante graduada de mi laboratorio.

Después del sacrificio, diseccione cuidadosamente la tibia y los fémures de dos ratones sin cortar los extremos óseos. Luego use papel de seda para limpiar todos los pañuelos adheridos de los huesos, teniendo cuidado de no romperlos. En una capucha de bioseguridad.

Llene una placa de Petri de 35 milímetros con etanol al 70% y luego sumerja los huesos en el etanol durante 10 minutos. Después de que los huesos hayan sido esterilizados, recupérelos del etanol y déjelos secar al aire durante cinco minutos en una nueva placa de Petri. Ahora, corta el fémur por la mitad y la tibia por su punta más delgada.

Infundir el interior de los huesos con un mililitro de medio RPMI usando una jeringa estéril. Recoja la suspensión de la celda en un tubo de 15 mililitros y lávela dos veces con medio RPMI mediante una centrifugación de 10 minutos a 300 veces G a cuatro grados Celsius en una centrífuga con un rotor de cubo oscilante. Después del último lavado, resus suspender las células en dos mililitros de una lisis de CK, tamponar e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente para eliminar los glóbulos rojos.

A continuación, agregue 13 mililitros de RPMI más 10% de FBS y lave las celdas dos veces más en este medio con la misma configuración de centrífuga que antes. Cuente las celdas y ajuste la concentración a dos veces 10 por la quinta celda por mililitro. Con RPMI más 10%FBS, agregue el mubrino recombinante G-M-C-S-F hasta una concentración final de 20 nanogramos por mililitro.

A continuación, añada 10 mililitros de esta suspensión a una placa de Petri estéril de 10 centímetros de calidad microbiológica y cultive. La suspensión celular en una incubadora de dióxido de carbono. Tres días después, agregue otros 10 mililitros de RPMI más 10% de FBS con 20 nanogramos por mililitro de G-M-C-S-F murino recombinante a cada una de las placas preparadas.

Tres días más tarde, recupere 10 mililitros de suspensión celular de cada placa de Petri, centrifugue las celdas en las mismas condiciones y resuspenda el pellet en el mismo volumen de RPMI más 10% FBS que se recuperó de las placas de Petri y reponga con nuevo G-M-C-S-F murino recombinante. Finalmente, devuelva la suspensión celular a cada placa de Petri original y cultive las células durante dos días adicionales en la incubadora de dióxido de carbono. Después de ocho días en cultivo, recupere las células flotantes y poco adherentes lavando las placas de Petri con medio fresco.

A continuación, etiquete las células recogidas con el kit de etiquetado de células Q tracker 6 55 siguiendo estrictamente las instrucciones del fabricante de etiquetar cinco veces 10 a la sexta de las CD derivadas de la médula ósea murina con nanocristales Q nano a una concentración de 10 nano molares. Primero mezcle cinco microlitros de cada uno de los componentes del kit A y B en un tubo einor, e incube la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego agregue un mililitro de RPMI más 10% FBS y agite el tubo durante 30 segundos.

A continuación, suma cinco por 10 al quinto. Dcs suspendidos en 0,5 mililitros de RPMI más 10%FBS al tubo de einor e incubar las células en la solución D a 37 grados Celsius durante 60 minutos. A continuación, lavar las células dos veces en RPMI más 10%FBS en las mismas condiciones que antes, y volver a suspender el pellet en RPMI.

Esta figura muestra un ejemplo de una microfotografía fluorescente de dcs. Inmediatamente después del etiquetado, una gota de células marcadas se depositó en un portaobjetos de vidrio y se cubrió con un cubreobjetos. A continuación, las muestras se evaluaron con un microscopio fluorescente.

En esta figura, se puede ver etiquetada una microfotografía fluorescente de dcs después de 48 horas, maduración in vitro. Los Dcs se cultivaron durante 48 horas con 100 nanogramos por mililitro, LPS y 20 nanogramos por mililitro, TNF alfa en cámaras de cultivo de portaobjetos en una incubadora de dióxido de carbono. A continuación, las muestras se lavaron con PBS fijado con acetona, se contratinción con DPI y se evaluaron con un microscopio fluorescente.

Las dcs marcadas maduras in vitro se analizaron mediante citometría de flujo, las células teñidas con puntos Q dan una señal fuerte en el FL de tres canales Q con tinción y sin teñir. Además, las DCs se tiñeron con anticuerpos específicos contra los marcadores de maduración, CD 86 y CD 40, y las células de control del isotipo se analizaron mediante citometría de flujo. Además, se determinaron los niveles de IL seis y óxido nítrico en sobrenadantes de DCS y controles de tinción Q madura.

Aquí se muestra una figura representativa de EDC marcada en un tejido disecado marcado. Los dcs maduros se inyectaron por vía intravenosa en ratones C 57 black six. Tres días después, se sacrificaron los ratones y se recogieron los bazos.

Se prepararon congelados a presión embebidos en OCT y secciones de ocho micras utilizando un criostato. A continuación, las muestras se fijaron con acetona, se contratinieron con DPI y se evaluaron con un microscopio fluorescente. Siguiendo estos procedimientos.

Se pueden realizar otros métodos, como el posicionamiento de antígenos o la maduración con diferentes estímulos, con el fin de responder a preguntas adicionales, como la migración de células dendríticas en respuesta a diferentes estímulos de maduración.