Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

El objetivo general de este procedimiento es preparar células dendríticas para estudios de imagen mediante cristales nanométricos Q dot. Esto se logra primero aislado células de la médula ósea de fémures y tibias de ratón. A continuación, se establecen cultivos de células de la médula ósea para facilitar la diferenciación celular en células dendríticas en presencia de GM CSF.

Luego, las células dendríticas se recuperan de los cultivos de células de médula ósea tras ocho días. El paso final del procedimiento consiste en teñir las células con nanocristales fluorescentes Q. En última instancia, las células dendríticas intensamente teñidas pueden visualizarse mediante microscopía de fluorescencia.

La principal ventaja de utilizar esta tecnología en comparación con otros métodos, como el uso de células dendríticas marcadas con GFP, es que los puntos cuánticos conservan su fluorescencia incluso después de la tinción con disolventes orgánicos como la acetona. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biólogos de células dendríticas, como las propiedades de migración de estas células en distintas enfermedades o en el contexto de diferentes patologías. El procedimiento de tinción será demostrado por María Ali, una estudiante de posgrado de mi laboratorio.

Tras el sacrificio, diseccionar cuidadosamente la tibia y los fémures de dos ratones sin cortar los extremos óseos. Luego, utilizar papel de tejido para limpiar todos los tejidos adheridos de los huesos, teniendo cuidado de no romperlos. En una cabina de seguridad biológica.

Llene un plato de Petri de 35 milímetros con etanol al 70% y luego sumerja los huesos en el etanol durante 10 minutos. Después de que los huesos hayan sido esterilizados, retírelos del etanol y déjelos secar al aire durante cinco minutos en un plato de Petri nuevo. Ahora, corte el fémur por la mitad y la tibia por su extremo más delgado.

Infunda el interior de los huesos con un mililitro de medio RPMI utilizando una jeringa estéril. Recoja la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros y lávela dos veces con medio RPMI mediante una centrifugación de 10 minutos a 300 ×g a cuatro grados Celsius en una centrífuga con rotor de cestillos oscilantes. Después del último lavado, resuspenda las células en dos mililitros de tampón de lisis CK e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para eliminar los glóbulos rojos.

A continuación, agregue 13 mililitros de RPMI más 10% de FBS y lave las células otras dos veces en este medio con los mismos parámetros de centrífuga que antes. Cuente las células y ajuste la concentración a dos veces 10 a la quinta células por mililitro. Con RPMI más 10% de FBS, agregue G-M-C-S-F murino recombinante hasta una concentración final de 20 nanogramos por mililitro.

Luego, agregue 10 mililitros de esta suspensión a una placa de Petri estéril de calidad microbiológica de 10 centímetros y realice el cultivo. Incube la suspensión celular en un incubador de dióxido de carbono. Tres días después, agregue otros 10 mililitros de RPMI más 10 % de FBS con 20 nanogramos por mililitro de G-M-C-S-F murino recombinante a cada una de las placas preparadas.

Tres días más tarde, recupere 10 mililitros de suspensión celular de cada placa de Petri, centrifugue las células en las mismas condiciones y resuspenda el sedimento en el mismo volumen de RPMI más 10% de FBS recuperado de las placas de Petri, y reponga con nueva G-M-C-S-F murina recombinante. Finalmente, devuelva la suspensión celular a cada placa de Petri original y cultive las células durante dos días adicionales en el incubador de dióxido de carbono. Después de ocho días en cultivo, recupere las células flotantes y las adherentes débilmente lavando las placas de Petri con medio fresco.

Luego, marque las células recolectadas con el kit de etiquetado de células Q tracker 6 55 siguiendo estrictamente las instrucciones del fabricante para etiquetar cinco veces 10 a la sexta de las dc derivadas de médula ósea murina con nanocristales Q a una concentración de 10 nano molar. Primero, mezcle cinco microlitros de cada uno de los componentes del kit A y B en un tubo einor, e incube la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue un mililitro de RPMI más 10 %FBS, y vortexee el tubo durante 30 segundos.

A continuación, agregue cinco veces 10 a la quinta. Dcs suspendidas en 0,5 mililitros de RPMI más 10 %FBS al tubo einor e incube las células en la solución D a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Luego lave las células dos veces en RPMI más 10 %FBS en las mismas condiciones que antes, y resuspenda el precipitado en RPMI.

Esta figura muestra un ejemplo de una microfotografía fluorescente de dcs. Inmediatamente después de la marcación, se depositó una gota de células marcadas sobre un portaobjetos y se cubrió con un cubreobjetos. Luego, las muestras se evaluaron utilizando un microscopio fluorescente.

En esta figura, puede observarse una microfotografía fluorescente de DCs después de 48 horas, etiquetada tras la maduración in vitro. Las DCs se cultivaron durante 48 horas con 100 nanogramos por mililitro de LPS y 20 nanogramos por mililitro de TNF alfa en cámaras de cultivo sobre portaobjetos, en un incubador de dióxido de carbono. Luego, las muestras se lavaron con PBS, se fijaron con acetona, se contratinjeron con DAPI y se evaluaron mediante microscopía fluorescente.

Los DC marcados madurados in vitro se analizaron mediante citometría de flujo. Las células teñidas con puntos cuánticos (Q dot) muestran una señal intensa en el canal FL3. Los DC teñidos y no teñidos con Q dot se tiñeron adicionalmente con anticuerpos específicos contra los marcadores de maduración CD86 y CD40, así como con controles de isotipo. Las células se analizaron posteriormente mediante citometría de flujo. Además, se determinaron los niveles de IL-6 y óxido nítrico en los sobrenadantes de los DC maduros teñidos con Q dot y de los controles.

Aquí se muestra una figura representativa de DCS marcadas en un tejido disecado. Se inyectaron DC maduras por vía intravenosa en ratones C57 Black Six. Tres días después, los ratones fueron sacrificados y se recolectaron los bazo.

Se congelaron rápidamente y se incluyeron en OCT, y se prepararon secciones de ocho micrómetros utilizando un criostato. Luego, las muestras se fijaron con acetona, se contratinjeron con DPI y se evaluaron mediante microscopía fluorescente. Tras seguir estos procedimientos.

Pueden realizarse otros métodos, como la presentación de antígenos o la maduración con diferentes estímulos, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como la migración de las células dendríticas en respuesta a distintos estímulos de maduración.