A tiempo real Técnica de Impedancia Eléctrica base para medir la invasión de monocapa de células endoteliales de las células cancerosas
1 de abril de 2011
En este artículo se describe una In vitro Técnica para las células cancerosas invasoras de vigilancia a través de una monocapa de células endoteliales. Los datos se adquiere en tiempo real como una función de los cambios en la impedancia en la superficie de los electrodos en la parte inferior así.
Este video demuestra un método para monitorear la invasión de una monocapa de células endoteliales por células cancerosas utilizando una técnica basada en impedancia eléctrica en tiempo real. Primero, se siembran células endoteliales de vena umbilical humana, denominadas VE, en placas EPL de 16 pocillos recubiertos con electrodos de oro en el fondo de los pocillos. Luego, se añaden células cancerosas para formar una monocapa confluente, las cuales se adhieren a las células VE e invaden la monocapa de VE, alterando las uniones entre las células endoteliales. A continuación, se obtienen mediciones de impedancia, que dependen del área total del fondo del pocillo cubierta por células.
La magnitud de la invasión puede determinarse entonces en función de los cambios en la impedancia eléctrica. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los ensayos con cámara de vacío y METROGEL, es que las interacciones entre células endoteliales y células tumorales imitan más fielmente el proceso metastásico in vivo, y los datos se obtienen en tiempo real y son más fácilmente cuantificables, a diferencia del análisis de punto final utilizado en otros métodos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la invasión de células cancerosas.
También puede aplicarse a otros sistemas, como investigar las interacciones entre células en el sistema inmunitario. Además, la fase inicial del experimento, en la que observamos el crecimiento de células UX, puede utilizarse para evaluar la proliferación celular de cualquier línea celular sin pasos adicionales de invasión, lo que demuestra que el procedimiento será útil. Rahim, estudiante de posgrado de mi laboratorio. Todos los pasos de este protocolo deben realizarse bajo condiciones estériles en una cabina de cultivo de tejidos.
El sistema Xcel utilizado para este experimento se mantiene permanentemente en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius, exclusivamente dedicado a este instrumento desde su primer uso. El instrumento debe dejarse en el incubador durante al menos 16 horas para que se equilibre con el nuevo entorno de temperatura y humedad. A continuación, prepare el Thence EPL 16 recubriéndolo con gelatina al 0,1% durante una hora a 37 grados Celsius.
Una vez que la placa haya sido recubierta, lávela una vez con PBS. Luego añada 100 microlitros del medio e gm dos reconstituido para realizar una lectura en blanco. Para medir la impedancia de fondo en ausencia de células.
Coloque el EPL en el sistema de agente de Excel en la computadora. Abra el software del agente de Excel haciendo clic en el icono del software RTCA en el escritorio dentro de la ventana del software. Haga clic en la pestaña de diseño y seleccione los pozos que contienen las muestras.
Para programar la frecuencia de adquisición de datos en tiempo real. Haga clic en la pestaña de programación y luego haga clic en el icono de agregar un paso. Barridos indica el número de lecturas e intervalos indica el intervalo de tiempo entre lecturas. Estos valores se establecen automáticamente en uno y 1.00 minuto, respectivamente.
Esto programa el sistema para realizar una lectura de fondo. Haga clic en agregar un paso e ingrese 300 en el cuadro de barridos y 10 minutos en el cuadro de intervalos. Esto programará el instrumento para realizar mediciones de impedancia durante hasta 50 horas.
Para comenzar el experimento, haga clic en el icono de iniciar un paso. Se medirá la impedancia de fondo de cada pocillo después de que se haya realizado la medición de fondo. La ventana muestra el mensaje.
Listo para el siguiente paso, haga clic. Siguiente paso para comenzar. En este momento, se pueden añadir células y se puede monitorear la formación de una monocapa como se describe.
En la siguiente sección, las células endoteliales de vena umbilical humana o VE utilizadas aquí se cultivan en medio EGM dos reconstituido con el kit complementario EGM dos que contiene suplementos de factores de crecimiento y 5 %FBS. Las células deben mantenerse en un incubador a 37 grados Celsius en presencia de 5 %dióxido de carbono. El día del experimento, verifique la confluencia de las células HUB E bajo un microscopio; las células deben tener un número bajo de pases, preferiblemente no más de seis y menos del 75 %confluentes, para generar una monocapa uniforme. Recolecte las células mediante tripsinización. Una vez que las células se hayan desprendido del frasco, elimine todos los rastros de tripsina mediante centrifugación a 200 ×g. Tras la centrifugación, lave las células una vez con PBS.
Luego, volver a suspender las células y el medio e GM dos reconstituido a una concentración de 2,5 × 10⁵ células por mililitro. Una vez que las células estén resuspendidas, retire el EPL calibrado de fondo del sistema EXOGEN y agregue 100 microlitros de la suspensión de HX a los 100 microlitros del medio E GM dos ya presentes en la placa. Coloque inmediatamente el EPL en el analizador de células del sistema Excel.
Comience a adquirir lecturas de impedancia haciendo clic en el botón de inicio en la ventana del software. Permita que las células endoteliales crezcan. El sistema continuará tomando lecturas de impedancia cada 10 minutos.
Las UVE muestran un aplanamiento característico transitorio del índice celular entre cuatro y seis horas después de la siembra, seguido de otra estabilización entre las 16 y 18 horas. Por lo tanto, es importante dejar que las células formen una monocapa confluente durante al menos 18 horas. Una vez formada la monocapa, es momento de añadir las células invasoras en preparación para el ensayo de invasión.
Prepare las células tumorales invasoras. En este caso se utilizan células de osteosarcoma. Comience por recolectar las células mediante tripsina.
Elimine todos los rastros de tripsina centrifugando las células a 200 G y lavándolas una vez con PPS. Tras el lavado, suspenda las células a una densidad final de uno por diez a la quinta células por mililitro en el medio utilizado para cultivar las células tumorales, como el medio RPMI o DMEA que contiene 10 %FBS. Pausar el experimento haciendo clic en el icono de paso de pausa en la ventana del software.
Retire el EPL y aspire el medio EGM-2 del monocapa vacío. Añada 100 microlitros de la suspensión de células tumorales que contenga uno por 10 a la cuarta células. Por lo general, una proporción de uno a 2,5 células tumorales por células endoteliales funciona mejor para el ensayo.
Sin embargo, la proporción puede optimizarse para líneas celulares individuales. Coloque el EPL de nuevo en el sistema de agente Excel dentro del incubador. Haga clic en el paso continuar para seguir tomando lecturas de impedancia a intervalos de 10 minutos.
Monitoree la invasión en tiempo real durante las próximas seis a doce horas. Una disminución en el índice de células resultará de la retracción de las uniones endoteliales y la penetración por células tumorales invasoras. Cuando el experimento haya terminado, utilice el software exergen para normalizar los resultados respecto al momento de adición de las células tumorales invasoras.
El software exergen permite la normalización a cualquier punto temporal en que las VEX fueron cultivadas en el sistema exergen, como se muestra en este video, y se añadieron células K7M2 o células K12 tras la formación de la monocapa. Como se observa aquí, se produce una disminución pronunciada del índice celular en cuestión de horas tras la introducción de las células K7M2. K7M2 es una línea celular de osteosarcoma altamente metastásica.
Estas células expresan altos niveles de la proteína enlazadora del citoesqueleto ene, lo que explica las propiedades invasivas de la línea celular. Las células K 12, por otro lado, son menos metastásicas y no pueden penetrar la monocapa endotelial con la misma eficiencia que las células K seven M two. Esto se representa mediante una disminución menos pronunciada del índice celular, como se muestra aquí.
El control mostrado aquí representa la impedancia de la monocapa de uvea. En ausencia de células cancerosas, los experimentos se realizaron por triplicado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la invasión en tiempo real mediante la generación de una monocapa de células endoteliales y la exposición de la monocapa a células cancerosas.
Los pasos iniciales del experimento que implican la formación de monocapas de HU XL se pueden utilizar para evaluar la proliferación celular mediante impedancia.Two.
Descripción general
Este artículo describe una técnica basada en impedancia eléctrica en tiempo real para monitorear la invasión de células cancerosas a través de una monocapa de células endoteliales. El método permite la cuantificación de interacciones celulares que imitan los procesos metastásicos in vivo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Investigación del Cáncer
- Biología de las Células Endoteliales
Antecedentes
- Comprender la invasión de células cancerosas es fundamental para desarrollar estrategias terapéuticas.
- Los métodos tradicionales suelen basarse en análisis de punto final, lo que puede ser menos informativo.
- Esta técnica proporciona datos en tiempo real, mejorando la comprensión de las interacciones celulares.
- Además, puede adaptarse para estudiar otras interacciones celulares, como las del sistema inmunitario.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la monitorización en tiempo real de la invasión de células cancerosas.
- Proporcionar información sobre las interacciones entre células endoteliales y células tumorales.
- Mejorar la cuantificación de la invasión celular en comparación con los métodos existentes.
Métodos Utilizados
- Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) se cultivan para formar una monocapa.
- Se introducen células cancerosas para monitorear su invasión mediante cambios de impedancia.
- Se toman lecturas de impedancia a intervalos regulares para evaluar las interacciones celulares.
- El experimento se realiza en condiciones estériles para garantizar la precisión.
Resultados principales
- La monitorización en tiempo real de la impedancia rastrea eficazmente la invasión de células cancerosas.
- Los cambios en la impedancia se correlacionan con el grado de alteración de las uniones endoteliales.
- El método permite la optimización de las proporciones celulares para diferentes ensayos.
- Los datos obtenidos proporcionan información sobre la dinámica de la invasión celular.
Conclusiones
- Esta técnica ofrece una representación más precisa de la invasión de células cancerosas.
- La adquisición de datos en tiempo real mejora la comprensión de los procesos metastásicos.
- El método puede aplicarse a diversos estudios de interacción celular más allá del cáncer.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta técnica de impedancia eléctrica en tiempo real permite a los equipos de I+D de biotecnología farmacéutica evaluar cuantitativamente la invasión de células cancerosas a través de monocapas endoteliales con relevancia fisiológica. Al capturar cambios dinámicos y libres de marcadores en la impedancia que se correlacionan con la alteración de las uniones celulares y la penetración de células tumorales, el método apoya la desvinculación mecanicista de dianas antimetastásicas. Proporciona una confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al distinguir fenotipos invasivos frente a no invasivos en un formato escalable y reproducible.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de interacciones tumor-endotheliales en tiempo real que imitan la diseminación metastásica in vivo.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas a través de lecturas basadas en impedancia que reflejan la integridad de las uniones endoteliales y la invasividad de las células tumorales.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al distinguir líneas de osteosarcoma altamente metastásicas (por ejemplo, K7M2) de las de bajo potencial metastásico (por ejemplo, K12) según la magnitud de la disminución de la impedancia.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera salidas cuantitativas estandarizadas de índice celular adecuadas para cribado de alto contenido de compuestos que dirigen vías de invasión.
- Reproducibilidad: Permite mediciones de impedancia consistentes entre réplicas cuando las monocapas endoteliales se equilibran durante ≥18 horas antes de la adición de células tumorales.
- Escalabilidad: Compatible con matrices de electrodos de 16 pocillos, lo que permite pruebas paralelas de condiciones y optimización de reactivos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela el paso de invasión endotelial de la metástasis, un cuello de botella crítico para la supervivencia de las células tumorales circulantes y su extravasación.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con el trabajo preclínico al proporcionar una lectura cuantificable y en tiempo real de la dinámica de invasión, aplicable a estudios de correlación con biomarcadores.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Apoya las decisiones de continuar o no continuar al vincular los cambios de impedancia con la invasividad funcional, reduciendo la dependencia de ensayos en puntos finales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, donde métricas de invasión en tiempo real informan sobre relaciones tempranas entre estructura y actividad, así como estudios del mecanismo de acción.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las interacciones endoteliales-tumorales al proporcionar datos de impedancia sin marcadores y en tiempo real que reflejan la adhesión celular, la expansión y la remodelación de uniones.
- Selección: Ofrece líneas base de impedancia reproducibles y listas para ensayos, así como curvas dinámicas de invasión, que permiten la selección de bibliotecas de compuestos frente a fenotipos de invasión.
- Análisis: Genera valores del índice celular adimensionales y cinéticas temporales de invasión que permiten la comparación cuantitativa de condiciones y la normalización respecto a los puntos temporales de inicio de la invasión.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica mediante la modelización de una etapa metastásica clave susceptible de intervención terapéutica y de modelado farmacocinético-farmacodinámico.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma basada en impedancia reutilizable para estudiar diversas interacciones célula-célula, incluida la adhesión inmunoendotelial, más allá de la oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la modelización de la metástasis.
- Valor operativo: Proporciona estandarización, monitoreo en tiempo real y cuantificación sin marcadores, mejorando el rendimiento frente a ensayos de punto final como la cámara de Boyden.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir decisiones tempranas basadas en datos sobre continuar o no, lo que reduce el riesgo de fracaso biológico en etapas tardías.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos antiinvasión mediante lecturas fenotípicas cuantificables y vinculadas a mecanismos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, instrumentación basada en impedancia (por ejemplo, xCELLigence) y técnica estéril para la formación reproducible de monocapas.
- Depende de placas con matriz de electrodos de oro (EPLs) y sistemas analizadores de impedancia con control ambiental (37 °C, 5 % CO₂) para la estabilidad de la señal.
- Necesita estandarización entre equipos en cuanto a la densidad de siembra de células endoteliales, número de pase (<6) y tiempo de equilibración previo a la invasión (≥18 horas) para garantizar la comparabilidad de los datos.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a células inmunitarias u otros tipos celulares, incluyendo la optimización de las relaciones efector-objetivo y la compatibilidad del medio.
- Limitación práctica: La interpretación de la señal asume que los cambios de impedancia reflejan principalmente la cobertura celular y la morfología; deben controlarse factores de confusión como la conductividad del medio o el ensuciamiento de los electrodos.
