A tiempo real Técnica de Impedancia Eléctrica base para medir la invasión de monocapa de células endoteliales de las células cancerosas

En este artículo se describe una

Este video muestra un método para monitorear la invasión de una monocapa de células endoteliales por células cancerosas utilizando una técnica basada en impedancia eléctrica en tiempo real. En primer lugar, las células endoteliales de la vena umbilical humana, denominadas VE, se asientan en 16 pocillos EPL recubiertos con electrodos de oro en el fondo del pozo. Para generar una monocapa confluente, se agregan células cancerosas, que se adhieren a la VE e invaden la monocapa de HVAC, interrumpiendo las uniones de las células endoteliales. Luego se adquieren las lecturas de impedancia, que dependen del área total del fondo del pozo cubierto por células.

El alcance de la invasión se puede determinar en función de los cambios en la impedancia eléctrica. La principal ventaja de esta técnica o de los métodos existentes, como los ensayos de cámara vacía y METROGEL, es que las interacciones entre las células endoteliales y las células tumorales se asemejan más al proceso metastásico in vivo, y los datos se obtienen en tiempo real y son más fácilmente cuantificables, a diferencia del análisis de puntos finales de otros métodos. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la invasión de células cancerosas.

También se puede aplicar a otros sistemas, como la investigación de las interacciones celulares en el sistema inmunológico. Además, la fase inicial del experimento, en la que observamos el crecimiento de las células UX, se puede utilizar para evaluar la proliferación celular de cualquier línea celular sin más pasos de invasión, lo que demuestra que el procedimiento será un estudiante graduado de mi laboratorio. Todos los pasos de este protocolo deben realizarse en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos.

El sistema Xcel utilizado para este experimento se mantiene permanentemente en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados, dedicada exclusivamente a este instrumento en su primer uso. El instrumento debe dejarse en la incubadora durante al menos 16 horas para que se equilibre con el nuevo ambiente de temperatura y humedad. A continuación, prepare Tthen EPL 16 cubriéndolo con gelatina al 0,1% durante una hora a 37 grados centígrados.

Una vez que se haya cubierto la placa, lávela una vez con PBS. Luego agregue 100 microlitros de medio reconstituido e gm dos para realizar una lectura en blanco. Para medir la impedancia de fondo en ausencia de células.

Coloque el EPL en el sistema de agentes de Excel en la computadora. Abra el software del agente de Excel haciendo clic en el icono del software RTCA en el escritorio en la ventana del software. Haga clic en la pestaña de diseño y seleccione los pocillos que contienen muestras.

Para programar la frecuencia de adquisición de datos en tiempo real. Haga clic en la pestaña de programación, luego haga clic en el icono de agregar un paso, los barridos indican el número de lecturas y los intervalos indican el intervalo de tiempo entre lecturas. Estos se establecen automáticamente en uno y 1.00 minutos respectivamente.

Esto programa el sistema para realizar una lectura en segundo plano. Haga clic en agregar un paso e ingrese 300 en el cuadro de barridos y 10 minutos en el cuadro de intervalos. Esto programará el instrumento para realizar mediciones de impedancia durante un máximo de 50 horas.

Para comenzar el experimento, haga clic en el icono de iniciar un paso. La impedancia de fondo de cada pozo se medirá después de que se haya realizado la medición de fondo. La ventana muestra el mensaje.

Listo para el siguiente paso, haga clic. Siguiente paso para comenzar. En este momento, se pueden agregar células y se puede monitorear la formación de una monocapa como se describe.

En la siguiente sección, la vena umbilical humana, las células endoteliales o VE utilizadas aquí se cultivan en EGM dos medios reconstituidos con el kit EGM de dos balas que contiene suplementos de factores de crecimiento, y las células FBS al 5% deben mantenerse en una incubadora a 37 grados Celsius en presencia de dióxido de carbono al 5%. El día del experimento, verifique la cofluidez de HUB E Bajo un microscopio, las células deben tener un número de paso bajo, preferiblemente no más de seis y menos de 75%Con fluente para generar un tono, monocapa recolecta las células por tripsina. Una vez que las células se hayan desprendido del matraz, se eliminarán todos los restos de tripsina mediante centrifugación a 200 G. Después del centrifugado, lavar las células una vez con PBS.

A continuación, resuspender las células y reconstituir e GM dos medios a una concentración de 2,5 veces 10 a la quinta célula por mililitro. Una vez que se resuspenden las celdas, retire el EPL calibrado en segundo plano del sistema EXOGEN y agregue 100 microlitros de la suspensión HX a los 100 microlitros de E GM dos medios que ya están en la placa. Coloque inmediatamente el EPL en el analizador de celdas del sistema Excel.

Comience a adquirir lecturas de impedancia haciendo clic en el botón de inicio de paso en la ventana del software. Permitir que las células endoteliales crezcan. El sistema continuará tomando lecturas de impedancia cada 10 minutos.

Las uvas muestran un aplanamiento transitorio característico del índice celular de cuatro a seis horas después de la siembra, seguido de otra estabilización después de 16 a 18 horas. Por lo tanto, es importante dejar que las células formen una monocapa confluente durante al menos 18 horas. Una vez que se ha formado una monocapa, es hora de agregar las células invasoras en preparación para el ensayo de invasión.

Preparar las células tumorales invasoras. En este caso, se utilizan células de osteosarcoma. Comience por recolectar las células con tripsina.

Eliminar todos los restos de tripsina girando las células a 200 g y lavando una vez con PPS. Después del lavado de reus, suspenda las células mientras la densidad final es de una por 10 a la quinta célula por mililitro en el medio utilizado para cultivar las células tumorales como el medio RPMI o DMEA que contiene 10% de FBS. Para pausar el experimento, haga clic en el icono de paso de pausa en la ventana del software.

Retire el EPL y aspire el medio EGM two de la monocapa de la aspiradora. Agregue 100 microlitros de suspensión de células tumorales que contengan una vez 10 a las cuartas células. Por lo general, una proporción de una a 2,5 células tumorales por células endoteliales funciona mejor para el ensayo.

Sin embargo, la proporción se puede optimizar para líneas celulares individuales. Vuelva a colocar el EPL en el sistema de agentes de Excel en la incubadora. Haga clic en el paso continuar para continuar tomando lecturas de impedancia a intervalos de 10 minutos.

Monitoree la invasión en tiempo real durante las próximas seis a 12 horas. Una caída en el índice celular será el resultado de la retracción de las uniones endoteliales y la penetración de las células tumorales invasoras. Una vez finalizado el experimento, utilice el software exergen para normalizar los resultados al momento de la adición de las células tumorales invasoras.

El software de exergen permite la normalización a cualquier punto de tiempo VEX que se cultivó en el sistema de exergen, como se muestra en este video, y se agregaron K siete M dos celdas o K 12 celdas después de la formación de la monocapa. Como se muestra aquí, se produce una disminución pronunciada en el índice de células a las pocas horas de la introducción de K siete M dos células. K seven M two es una línea celular de osteosarcoma altamente metastásico.

Estas células expresan altos niveles de la proteína enlazadora del citoesqueleto ene, que explica las propiedades invasivas de la línea celular. Las células K 12, por otro lado, son menos metastásicas y no pueden penetrar en la monocapa endotelial tan eficientemente como las células K 7 M dos. Esto está representado por una disminución menos profunda en el índice de celdas, como se muestra aquí.

El control que se muestra aquí representa la impedancia de la monocapa uve. En ausencia de células cancerosas, los experimentos se realizaron por triplicado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la invasión en tiempo real mediante la generación de una monocapa de células endoteliales y desafiar la monocapa con células cancerosas.

Los pasos iniciales del experimento que involucra la formación de monocapas HU XL se pueden utilizar para evaluar la proliferación celular por impedancia. Dos.