Vibratome seccionamiento para la Preservación de Mejora de la citoarquitectura del órgano de Corti mamíferos

El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes del órgano de Corti con la máxima preservación de la arquitectura celular. Esto se logra mediante la sección, disección y fijación de oídos internos con un vibrátomo para obtener secciones gruesas, minimizando al mismo tiempo el número de superficies cortadas por cóclea. Las secciones obtenidas con el vibrátomo luego se tiñen mediante inmunohistoquímica, lo que permite la identificación de diversos tipos celulares y estructuras celulares en el órgano de Corti.

A continuación, se montan los cortes y se obtienen imágenes mediante microscopía confocal para lograr imágenes de alta resolución que definan las posiciones en Z a lo largo de cada sección gruesa de Vibram. Los resultados obtenidos permiten la microscopía confocal de las células y estructuras del órgano de Corti con una alteración mínima debida al proceso de corte. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la inclusión en parafina y la criosección, es que se minimiza el daño físico a la cóclea, lo que permite una mejor preservación de la arquitectura celular del órgano de Corti. Para aislar el oído interno, primero se decapita un ratón adulto sacrificado utilizando una cuchilla de afeitar.

Abra el cráneo a lo largo de la línea media y luego retire el cerebro para exponer cada oído usando pinzas cuidadosamente, extraiga ambos oídos internos. Sumerja los oídos internos en un tubo criogénico con paraformaldehído fresco al 4%, y agítelo suavemente durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, lave el fijador con tres cambios de solución salina tamponada con fosfato al 1x, descalcifique el tejido adulto incubándolo en EDTA al 10% a cuatro grados Celsius durante cinco días.

Lave y almacene los oídos internos en PBS 1X hasta que estén listos para su procesamiento. Prepare agarosa de bajo punto de fusión al 4% añadiendo la agarosa a PBS 1X y calentando en el microondas hasta que la agarosa esté en solución. Mantenga la agarosa fundida en un baño de agua a 55 grados Celsius hasta que esté lista para usar.

Retire el oído interno del PBS usando pinzas y colóquelo en la parte inferior de un molde desprendible. Elimine con pipeta cualquier líquido restante y luego llene el molde con mol aros, cubriendo completamente el oído interno para generar secciones transversales a través del órgano de Corti. Coloque el oído interno de manera que se vea lateralmente con el canal semicircular lateral.

Ángulo visible, el oído interno de modo que la línea formada por la región más posterior de la cóclea forme un ángulo de 45 grados respecto al plano previsto de corte. Una vez que el agros haya solidificado, retire el molde de plástico. Utilice una cuchilla de afeitar para recortar el exceso de agros y formar un cubo.

Asegurándose de dejar suficientes aros circundantes para mantener el tejido bien soportado. Durante el corte, fije la base del cubo de agros a la superficie de corte del vibrátomo utilizando pegamento instantáneo, seccione en un grosor de 40 a 100 micrones y recoja las láminas en un recipiente con PBS al uno por uno con 0,1 % de Triton X-100. Utilice pinzas.

Disecar los aros separándolos de las secciones de tejido. Transferir las secciones a un recipiente con PBS fresco 1X que contenga 0,1 % de Triton X-100, utilizando una punta de pipeta con una abertura amplia, y continuar con la tinción con anticuerpos en una placa para cultivo de tejidos. Una vez finalizada la tinción con anticuerpos, las secciones de tejido se montan sobre un portaobjetos para microscopio.

Para evitar aplastar las secciones de tejido gruesas, coloque una capa de grasa al vacío en forma de cuadrado alrededor de la sección para crear espacio entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Transfiera la sección de tejido a un portaobjetos para microscopio. Presione firmemente los bordes del cubreobjetos para crear un sello.

Alternativamente, coloque mediante pipeta un punto de un microlitro de resina de cromatografía de aros con tamaño de malla conocido en cada una de las cuatro esquinas donde descansará la cubreobjetos, coloque la cubreobjetos y selle los bordes con esmalte de uñas antes de obtener la primera imagen en un microscopio confocal Zack a través de una sección transversal de un órgano de Corti. En esta imagen, las células ciliadas internas, las células ciliadas internas adyacentes, las células ciliadas externas y las células de Dieters son visibles. Al realizar tinción nuclear, las células pilares son visibles mediante tinción con anticuerpo S-100 y aparecen de color amarillo. A medida que el Zack avanza a través de la sección en pasos de tres micrones, se puede contar el número de células pilares observando la aparición y desaparición de sus núcleos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo seccionar el oído interno mediante vibram, realizar inmunohistoquímica en estos cortes y luego obtener imágenes mediante microscopía confocal. Este procedimiento sencillo, que es generalizable a cualquier anticuerpo, garantiza la máxima preservación de la organización celular del órgano de Corti.