Name: Calorimetría de titulación isotérmica para la medición de macromoléculas-ligando de afinidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprende calorimetría de titulación isotérmica para estudiar interacciones ligando-macromolécula en bioquímica. Este método determina entalpía y entropía de unión en una sola experimentación con resultados reproducibles.

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Este trabajo fue apoyado por NSF subvención MCB-0817827.

Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una técnica bien establecida que pueda determinar todos los parámetros termodinámicos (afinidad, la entalpía y la estequiometría) de una interacción de unión en un solo experimento. 1 ITC trabaja en la titulación un reactivo en un segundo reactivo en condiciones isotérmicas. La señal es el calor liberado o absorbido en la interacción (unión) de los dos reactivos. Una serie de inyecciones se realizan y la señal de calor se aproxima a cero como el reactivo limitante se satura. Ajuste de la isoterma da los parámetros termodinámicos. Varias revisiones están disponibles que describen la instrumentación, así como los cálculos de la recogida y análisis de datos. 2,3 Mientras calorímetros están disponibles (en particular el ITC 200 con pequeños volúmenes), aquí se describe un protocolo general para la VP-ITC fabricados por MicroCal (ahora parte de GE Healthcare). 1. Preparación de muestras <ol><li> Con el fin de preparar la macromolécula y el ligando en el buffer, algunos problemas que deben abordarse. Ajuste preciso necesario mantener las concentraciones adecuadas de la macromolécula, las especies que normalmente va en la celda de muestra de la CCI, y ligando, la especie en la jeringa. Debido a que algunas proteínas se agregan a la alta concentración necesarios para la especie en la jeringa de inyección, con más frecuencia de la proteína se carga en la celda de muestra. La concentración de macromoléculas óptima se determina a partir de "c", el producto de la afinidad previsto del sistema, que puede estimarse utilizando métodos ortogonales antes de usar el CCI, y la concentración total de macromoléculas, donde c = K a * [M]. Los valores óptimos de la gama de c 10 a 1000, 1 a pesar de que es posible obtener datos precisos para la débil unión a los sistemas bajo condiciones experimentales específicas con c-valores por debajo del límite inferior. 4 De este modo, la concentración de macromoléculas se debe determinar con esta gama de c valores en mente (es decir, para una K a de 10 6 M -1, la concentración de macromoléculas de 10 a 1000 M se debe utilizar). El conocimiento previo de la afinidad de unión del sistema puede ayudar a minimizar la proteína utilizada para la ITC mediante un mejor diseño del experimento de ITC. La concentración del ligando debe ser lo suficientemente grande (7-25 veces más concentrado que el K d para el sitio de unión del ligando más débil), de modo que la saturación se produce en el primer tercio a la mitad de la titulación. Ajuste preciso de los datos también requiere la saturación de la señal. Para los sistemas con mayor afinidad de unión, una concentración de ligando baja se debe utilizar para evitar la saturación muy temprano en la titulación, lo que dará encaja inexacta. Una vez que el calor de control de dilución (es decir, la valoración del ligando en el buffer) se ha restado a la valoración, la entalpía de saturación debe acercarse a cero. </li><li> Debido a las impurezas de moléculas pequeñas pueden dar lugar a señales de artefactos en la medición del ITC, que es lo mejor, si es posible, que la macromolécula y el ligando de manera exhaustiva dializó contra tampón. Por otra parte, la cromatografía de columna, la desalinización columnas de centrifugado, o tampón filtros centrífugos de intercambio (por ejemplo, Centricons) se puede utilizar para cambiar el búfer de la macromolécula. Si el ligando es una molécula pequeña, se puede preparar con el tampón de diálisis después de la macromolécula ha sido dializados o por diálisis contra las membranas de diálisis con cortes adecuados para las pequeñas moléculas (es decir, 100-500 Da un Spectra / Por Float-A-Lyzer ). Las diferencias en la composición de amortiguación entre el ligando y soluciones macromolécula puede llevar a la señal de los artefactos del calor de la dilución de las impurezas en las muestras. Después de la preparación, asegúrese de que el pH del partido de amortiguamiento, macromolécula y el ligando (± 0,05 unidades de pH) como artefactos en la entalpía pueden surgir debido a amortiguar los efectos de protonación. 5 Asegúrese de que la preparación suficiente de cada especie. Para los experimentos por triplicado y un control de la dilución, la cantidad de material necesario dependerá de la ITC utiliza. Sin embargo, para la mayoría de los instrumentos del CCI que han de aproximadamente 2 ml células volumen de la muestra, por lo menos 7.6 ml de solución de macromoléculas serán necesarios, y se puede preparar convenientemente en 15 ml tubos falcon. De 300 jeringas de inyección l, 1.2 ml de la solución debe ser adecuada, y se puede preparar, ya sea en tubos Falcon o tubos de microcentrífuga. </li><li> El polvo y otras partículas, puede causar artefactos en la línea de base del termograma ITC. Es imperativo que se retiraran antes de ejecutar el experimento. Después de la preparación de soluciones madre de la muestra, las muestras deben ser centrifugadas en tubos de microcentrífuga durante cinco minutos en 8000 a 14.000 RPM a las partículas de sedimento en la solución. Eliminar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento, y colocarlo en un nuevo halcón / microcentrífuga tubo. Si reductores son necesarios para mantener la reducción de cisteínas, use concentraciones bajas y alimentos frescos de β-mercaptoethanol, TCEP (tris (2-carboxi) fosfina) o ditiotreitol para minimizar los artefactos debido a la oxidación reductor. Además, la presencia de disolventes orgánicos en la memoria intermedia (común para algunos ligandos de moléculas pequeñas que pueden necesitar metanol o DMSO con el fin de ser soluble) puede causar artefactos de la señal. Si los solventes orgánicos son necesarios para el ligando, entonces la solución macromolécula también debe contener la misma concentración para evitar cualquier señal de derivados del calor de dilución del disolvente orgánico. Ligeras diferencias en la composición de amortiguación entre el ligando y macromolécula debido a co-solventes, sales o pH son posibles durante la preparación de las muestras. Lo mejor es comprobar la dilución del ligando en el tampón de la muestra o la muestra de amortiguación en la macromolécula para asegurar que las señales de calor que surgen de las diferencias en el contenido del búfer de no hacer que los datos surgidos exclusivamente como consecuencia de los artefactos. </li><li> Comprobar la concentración de la macromolécula y el ligando cuidadosamente utilizando las técnicas adecuadas a su sistema (por ejemplo, mediciones de absorbancia, HPLC, ensayos colorimétricos, ensayos de BCA para las proteínas, etc) para grabar su concentración exacta. Las diferencias en la concentración real y la concentración usada para ajustarse a la isoterma puede provocar errores en la estequiometría, la entalpía y la afinidad de unión determina a partir de la experiencia. Es común que para desgasificar las muestras para evitar artefactos de la señal debido a las burbujas de aire o la liberación de los gases disueltos durante la titulación, particularmente a altas temperaturas. </li></ol> 2. Configuración del experimento <ol><li> Asegúrese de que la celda de muestra y una jeringa de inyección se limpian de acuerdo con el protocolo del fabricante antes de la carga de la macromolécula y el ligando. Enjuague la celda de muestra dos o tres veces con 1,8 ml de agua destilada con la jeringa Hamilton (tenga cuidado con la jeringa de Hamilton como el cañón se rompe con facilidad o la inclinación de aguja). A continuación enjuagar la celda varias veces con 1,8 ml de solución tampón. Cargar la celda de muestra con 1,8 ml de solución de macromoléculas, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas. </li><li> Llenar la celda de referencia con agua destilada. Para la mayoría de los amortiguadores, el agua destilada es buena para usar como solución de referencia. Sin embargo, para tampones con fuerzas iónicas particularmente alta o la osmolaridad, es mejor usar el buffer como referencia. </li><li> Eliminar las burbujas de aire de las células y muestra con la jeringa Hamilton. Suavemente mueva la aguja de la jeringa hacia arriba y hacia abajo de los lados de la célula golpear las burbujas que se puede estar en la parte inferior de la celda y se adjunta al pozo para la parte superior de la célula. Elimine cualquier exceso de volumen de la muestra y las células de referencia. </li><li> Conecte una jeringa de plástico para el puerto de llenado de la jeringa de inyección con tubo. Enjuague la jeringa con agua destilada. Siga por un buffer de enjuague. Asegúrese de que la jeringa es totalmente evacuado por el aire a través del sistema. Colocar la aguja de la jeringa en la solución de ligando y ligando dibujar la solución en la jeringa hasta que la jeringa entera está llena. Seguir dibujando un pequeño volumen en exceso (aproximadamente 50 l o más) en el puerto y el tubo conectado. Cierre inmediatamente el puerto de llenado de la jeringa y retire la jeringa y tubos de plástico. Purga y llenado de la jeringa dos veces más para eliminar las burbujas de la jeringa. Retire la jeringa de la solución de ligando y limpie la cara con una Kimwipe para eliminar cualquier gota, teniendo cuidado de no tocar la punta de la jeringa a la Kimwipe, ya que puede eliminar el volumen de la jeringa. Además, tenga cuidado de no golpear o frasco la jeringa ya que esto también puede causar la pérdida de volumen de la punta de la jeringa. Coloque la jeringa en la celda de muestra. </li><li> Configurar los parámetros para el funcionamiento de la ITC. Para los sistemas de unión con las señales de fuerte calor, un gran número de inyecciones de bajo volumen se dan más puntos de datos para el montaje (por ejemplo, 75 inyecciones de 3 l). Para los sistemas que tienen señales débiles de calor, un pequeño número de inyecciones de gran volumen son preferibles (por ejemplo, 33 inyecciones de 8 l). Por lo general, menos inyecciones con volúmenes de inyección superiores se utilizan. Puede tomar varias titulaciones para optimizar las condiciones que son las mejores para su sistema. Es importante tener en cuenta que la entalpía de unión puede ser exotérmica o endotérmica, dependiendo del sistema en estudio. Desafortunadamente, algunos sistemas tienen las señales de baja el calor, haciendo que el calor de reacción difícil de determinar. Los problemas con estos sistemas potencialmente puede ser superado por el aumento de la concentración de la macromolécula, el cambio de la temperatura del experimento (dependiendo de la capacidad de calor del sistema de unión), y / o la alteración del pH o la fuerza iónica del buffer. </li><li> También considere el espacio de tiempo entre cada inyección. Es imprescindible que después de cada inyección de ligando, el sistema se da tiempo para equilibrar el calor y la señal vuelve a la línea de base antes de la inyección se produzca la próxima. Para la mayoría de los sistemas de tres a cinco millasnutos debe ser adecuada. El tiempo entre las inyecciones se deben incrementar para sistemas en los que el equilibrio no se produce dentro de los cinco minutos. </li><li> Porque habrá algo de mezcla entre la macromolécula y soluciones ligando en la jeringa una vez que se inserta en la celda de la muestra, la primera inyección le dará resultados falsos. Lo mejor es usar pequeñas cantidades (por ejemplo, 2 l) durante los primeros uno o dos inyecciones (por lo que después se puede descartar) y mantener las inyecciones posteriores a los valores deseados. </li><li> Elegir la temperatura del experimento (con 25 ° C es el más común, aunque las temperaturas entre 2 y 80 ° C se puede utilizar). Lo mejor es elegir una temperatura que coincide con otros experimentos (cinética de unión, etc) realizadas en el sistema ligando macromolécula. El ITC se puede configurar para que se equilibre a una temperatura diferente de la temperatura del experimento. Si el experimento se va a realizar a una temperatura superior a 10 ° C, protegido de la temperatura ambiente, entonces es mejor para ajustar la temperatura de equilibrio para el instrumento dentro de los 5 ° C de la temperatura experimental. Esto disminuirá el tiempo que el instrumento se necesita para alcanzar la temperatura del experimento. La velocidad de agitación de la jeringa también debe tenerse en cuenta. Agitación es necesaria para la mezcla adecuada de los ligandos y macromoléculas durante la titulación, pero algunas proteínas son desestabilizadas por la agitación rápida. Para estos casos, la velocidad de agitación debe ser fijado en una tasa relativamente baja. Una vez que todos los parámetros experimentales se han establecido, entonces el experimento se puede iniciar. </li><li> Una vez que el experimento ha terminado, el ITC puede ser limpiado de acuerdo con el protocolo del fabricante. La solución en la celda de la muestra al final del experimento se puede mantener si los experimentos adicionales en la mezcla compleja macromolécula-ligando se desean. </li><li> Repetir las valoraciones por lo menos una o dos veces más para obtener datos reproducibles. Ejecutar un control en el ligando se valora en el buffer de la célula de muestra para determinar el calor de dilución para el ligando. Para algunos sistemas donde hay información de enlace de cooperación, adicional sobre el proceso de enlace se puede obtener mediante la inyección de la macromolécula en el ligando. Las orientaciones diferentes de inyección puede dar información adicional, que puede ser útil para el ajuste global. 6 </li></ol> 3. Análisis de los datos <ol><li> Ajuste de los datos se pueden realizar fácilmente el uso de macros en cualquier programa de ajuste de datos (normalmente suministrado por el fabricante junto con el instrumento). Cargar el archivo de datos. Compruebe el termograma primas para detectar cualquier signo de burbujas de aire u otros artefactos en la señal. Si hay algún artefactos (tales como picos en la línea de base o los picos cuando no había ninguna inyección en ese momento del tiempo), entonces en cuenta estos puntos de datos, ya que debe ser eliminado. A continuación, cargar los datos de dilución del ligando de control, y restar los datos de disolución de la unión del ligando isoterma. En este momento, eliminar todos los puntos de datos falsos, incluyendo los primeros uno o dos puntos de datos de la titulación donde se producen los artefactos de dilución (consulte el paso 7). </li><li> Seleccione el modelo de datos adecuado (un sitio de unión, dos / múltiples sitios de unión, unión cooperativa, etc) que se utiliza para ajustar los datos. Los datos pueden estar en forma con los supuestos iniciales de los parámetros de ajuste, la estequiometría (n), la entalpía (ΔH) y afinidad (K a). Si el conocimiento previo de la afinidad de unión, o de otros parámetros, se conoce a partir de experimentos ortogonal, entonces estos valores se pueden introducir. Esto ayuda a evitar el ajuste de quedar atrapados en mínimos locales durante el montaje. Una vez que los datos han sido aptos para la primera valoración, repita los pasos 15 y 16 para el resto de las isotermas. Por otra parte, los datos pueden estar en forma todo el mundo mediante programas como SEDPHAT 6. SEDPHAT puede ser particularmente útil en el ajuste global de bases de datos binarios complejas (es decir, las moléculas de A + B) en combinación con conjuntos de datos complejos ternarios (moléculas de A + B + C). Por ejemplo, en unión de la molécula de C a un complejo de AB, que no siempre está claro si podría haber alguna señal debido a la unión de C a A o de B a A (si A no está totalmente saturado). </li><li> Para asegurarse de que los datos no son artefactos del ITC, la afinidad de unión y estequiometría obtenida en el CCI debe ser comparado con un método ortogonal 7,8. Además, el valor de la entalpía del ITC se puede comparar con la entalpía de una parcela de van't Hoff. 9 También puede resultar útil usar diferentes concentraciones de los ligandos o macromolécula como el valor absoluto de la señal de calor debería incrementarse con la creciente concentración de macromoléculas. Los artefactos tienen más probabilidades de surgir si los topes en la célula y la jeringa no se corresponden. Otra posibilidad para los artefactos surge a partir de muestras impuras. </li><li> Le recomendamos que el usuario comienza con simples valoraciones complejo binario para los cuales hay información previa disponible en K d y stoichiometry. Entonces, si se unen ligandos adicionales, el usuario puede intentar titulaciones ternario más complicado compleja, variando las concentraciones de ligando, y tal vez cambiar la jeringa y componentes de la célula. Una comparación de entalpías de ambos caminos a la formación de complejos ternarios deben ser aditivas como la entalpía es una función de estado. 10 Una vez más, SEDPHAT 6 es probable que sea muy útil aquí. </li></ol> 4. Los resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un ejemplo representativo de una titulación de buen comportamiento de la unión del cofactor NADPH a E. coli cromosómica de la dihidrofolato reductasa (ecDHFR). Grupo (A) muestra el termograma primas; (B), la isoterma de unión de la forma termograma integrado con el modelo de un sitio en el software de origen, y (C) el ajuste de la isoterma usando el modelo de un sitio de unión a lo largo de SEDPHAT con los residuos en forma. Desde el software de origen, utilizando el modelo de un sitio de unión, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 M, ΔH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, y ΔG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Los ataques de los datos mediante Sedphat pagar una n de 0,94 ± 0,01, un d K de 0.195 ± 0.013 ΔM, un ΔH de -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS de -13,39 kcal / mol y ΔG de -9.15 kcal / mol.

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ITC se ha utilizado ampliamente en el estudio de las interacciones ligando macromolécula, 11 con los estudios que analizan la proteína-ligando, 12 DNA-ligando 13 y el ARN-macromolécula estudios 14. ITC, incluso se puede ejecutar con materiales sólidos, tales como nanopartículas, que forman suspensiones uniformes. 15 Además, los sistemas ternarios, donde ya es uno ligando unido a la macromolécula y un segundo ligando es ajustada, se puede utilizar para determinar la termodinámica de, por ejemplo, la unión de sustrato a un sistema de enzima-cofactor. 7 Los estudios también se puede realizar de moléculas con afinidad de unión muy alta que normalmente superan el límite de detección de la ITC mediante la realización de ensayos de unión competitiva con los más débiles unir ligandos. 16 Información sobre la débil unión ligandos también se puede obtener mediante ensayos de la competencia. 17 El papel del agua en la unión puede ser explorado por el CCI, 18, ​​junto con la dependencia de la entalpía en la reorganización del disolvente. 19 Recientemente, la termodinámica de cambio en la conformación de las variantes de DnaK se midieron tras la unión de ADP y ATP. 20 proteína-proteína de asociación puede ser estudiado por el CCI, dando información sobre los complejos hetero 21, así como en homo-asociación. 22 Efectos de la temperatura en la entalpía de unión dará la capacidad calorífica del enlace de eventos. 2 El número de protones absorbida o liberada tras la unión también se puede determinar a partir de experimentos realizados en los tampones con diferentes entalpías de ionización. 5 Si estudios adicionales ITC se realizan en diferentes valores de pH, el pKa del grupo que participan potencialmente se puede determinar 23. En resumen, las mediciones precisas de la concentración de la macromolécula y el ligando son imprescindibles para un experimento de ITC buena. Concentraciones de las muestras también deben estar dentro de un rango adecuado para obtener datos fiables. Se debe tener cuidado con el buffer de impurezas pequeñas moléculas y los desajustes de pH hará que los artefactos en el termograma.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> 1,7 ml de tubos de microcentrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 ml tubos Falcon </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49B </td></tr><tr><td> 2,5 ml jeringa Hamilton </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

calorimetría de titulación isotérmica para la medición de macromoléculas-ligando de afinidad

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una herramienta útil para la comprensión de la imagen termodinámica completa de una reacción de unión. En las ciencias biológicas, interacciones macromoleculares son esenciales en la comprensión de la maquinaria de la célula. Condiciones experimentales, tales como la amortiguación y la temperatura, se puede adaptar a un sistema particular de unión se está estudiando. Sin embargo, una cuidadosa planificación es necesario, ya que ciertos ligandos y los rangos de concentración de macromoléculas son necesarios para obtener datos útiles. Las concentraciones de la macromolécula y el ligando necesidad de determinar con precisión para obtener resultados fiables. La atención también hay que tener en la preparación de las muestras en forma de impurezas puede afectar significativamente el experimento. Cuando los experimentos CCI, junto con los controles, se llevan a cabo correctamente, la información útil de unión, como la estequiometría, afinidad y entalpía, se obtienen. Al llevar a cabo experimentos adicionales en el marco de amortiguación o condiciones diferentes de temperatura, información más detallada se puede obtener sobre el sistema. Un protocolo para la configuración básica de un experimento ITC se da.

Un protocolo general para el uso de la calorimetría de titulación isotérmica para controlar la termodinámica vinculante para los sistemas biológicos con moderada afinidad de unión se presenta.

Calorimetría de titulación isotérmica para la medición de macromoléculas-ligando de afinidad

La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una herramienta útil para comprender el panorama termodinámico completo de una reacción de unión. En el ámbito biológico...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una técnica general para estudiar la unión entre un ligando y una macromolécula utilizando calorimetría de titulación isotérmica, o ITC. Esto se logra primero preparando soluciones de ligando y macromolécula libres de impurezas y compatibles tanto en composición del tampón como en pH. Luego se determinan las concentraciones finales de las soluciones de ligando y macromolécula.A continuación, se configuran los par&aacute;metros experimentales del ITC seguidos de la recopilaci&oacute;n de datos. El paso final del procedimiento consiste en analizar y ajustar los datos. Finalmente, se obtienen resultados que muestran las interacciones entre el ligando y la macromol&eacute;cula mediante el an&aacute;lisis gr&aacute;fico de los datos de titulaci&oacute;n para determinar los par&aacute;metros de uni&oacute;n y los par&aacute;metros termodin&aacute;micos.La principal ventaja de esta técnica de unión frente a métodos existentes como las titulaciones por absorción y fluorescencia es que la entalpía y, por lo tanto, la entropía de unión, pueden determinarse a partir del mismo experimento. La preparación de la muestra comienza con la determinación de las concentraciones adecuadas tanto para el macromolécula como para el ligando. Un paso crítico para obtener ajustes precisos de ITC es la información que debe considerarse al calcular estas concentraciones, la cual puede encontrarse en el procedimiento escrito.En esta demostración, se investiga la unión del cofactor NADPH a la enzima dihidrofolato reductasa cromosómica de E. coli. Primero, reconstituya la macromolécula liofilizada en tampón hasta la concentración deseada, luego disuelva el ligando en el volumen necesario de tampón. A continuación, verifique que los valores de pH de las muestras de la macromolécula y del ligando se encuentren dentro de ±0,05 unidades de pH respecto al tampón y entre sí; centrifugue ambas soluciones, la de dihidrofolato reductasa cromosómica y la de NADPH, en tubos de microcentrífuga durante cinco minutos.Entre 8.000 y 14.000 rpm, esto sedimentará cualquier partícula presente en la solución, la cual puede causar artefactos en la línea base del termograma de ITC. Tras la centrifugación, verifique cuidadosamente las concentraciones de las soluciones del macromolécula y del ligando mediante espectroscopía UV-Vis y registre sus concentraciones exactas.Luego prepare el volumen adecuado de cada solución para ITC diluyendo las soluciones stock preparadas del macromolécula y del ligando hasta las concentraciones experimentales necesarias. Finalmente, desgasifique las muestras para evitar artefactos de señal debidos a burbujas de aire o a la liberación de gases disueltos durante la titulación, antes de cargar la macromolécula y el ligando en el ITC. Limpie la celda de muestra y la jeringa de inyección según el protocolo del fabricante.Luego, enjuague la celda de muestra dos o tres veces con 1,8 mililitros de agua destilada utilizando una jeringa Hamilton. Tenga cuidado al manipular la jeringa, ya que la punta larga se dobla fácilmente. A continuación, enjuague la celda de muestra varias veces con el mismo volumen de tampón.Una vez que la celda de muestra esté limpia, cargue 1.8 mililitros de la solución del macromolécula en la celda. Tenga cuidado de evitar la formación de burbujas; en el momento en que la solución asome por el vástago de la celda, detenga la adición de muestra. Retire cualquier burbuja de aire utilizando la jeringa Hamilton, moviendo suavemente la aguja hacia arriba y hacia abajo por los lados de la celda para desalojar las burbujas presentes.Retire la jeringa y elimine cualquier exceso de volumen del pozo en la parte superior de la celda. A continuación, llene la celda de referencia con agua destilada. Luego, conecte una jeringa de plástico al puerto de llenado de la jeringa de inyección mediante un tubo.Abra el puerto de llenado en la consola del visor VP 2000. Enjuague la jeringa de inyección con agua destilada, seguido de un enjuague con tampón. Asegúrese de que la jeringa de inyección quede completamente evacuada al aspirar aire a través del sistema.Coloque la aguja de la jeringa de inyección en la solución del ligando y aspire la solución hacia la jeringa hasta llenarla completamente. Continúe aspirando un pequeño volumen excesivo a través del puerto y desconecte el tubo tras cerrar inmediatamente el puerto de llenado. Desconecte el tubo y deseche el contenido de la jeringa de plástico; luego rellene y vacíe la jeringa de inyección dos veces para eliminar cualquier burbuja presente en la jeringa.Retire la jeringa de inyección de la solución de ligando y limpie con una toallita química cualquier gota en el lateral. Tenga cuidado de no tocar la punta de la jeringa con la toallita química ni golpear la jeringa, ya que esto podría provocar una pérdida de volumen de la jeringa. A continuación, coloque cuidadosamente la jeringa de inyección en la celda de muestra.Configure los parámetros para realizar la calorimetría isotérmica usando el programa V VP viewer 2000 proporcionado por Micro Cal para sistemas de unión. Con señales térmicas intensas, como el sistema de DIHIDROFOLATO reductasa cromosómica N-A-D-P-H, un gran número de inyecciones de bajo volumen proporcionará más puntos de datos para el ajuste. Por el contrario, para sistemas con señales térmicas débiles, es preferible utilizar un pequeño número de inyecciones de gran volumen.Para las primeras una o dos inyecciones, ajuste el volumen de inyección a dos microlitros. Estas inyecciones finalmente se descartarán, ya que podrían dar resultados espurios debido a la mezcla entre las soluciones del ligando y la macromolécula. Al ingresar el tiempo entre inyecciones, permita varios minutos para que el sistema alcance el equilibrio y la señal térmica regrese a la línea base.Luego, elija la temperatura del experimento e introduzca la velocidad de agitación de la jeringa necesaria para una mezcla adecuada del ligando y la macromolécula durante la titulación tras configurar los parámetros experimentales e inicie el experimento. Una vez finalizado el experimento, la señal de calor final debe estar cerca de la saturación. Limpie el ITC según el protocolo del fabricante y repita las titulaciones al menos una o dos veces más para obtener datos reproducibles.Finalmente, realice un control en el que el ligando se titule en el tampón dentro de la celda de muestra para determinar el calor de dilución del ligando. El ajuste de los datos se puede realizar fácilmente utilizando macros en cualquier programa de ajuste de datos. Aquí se utiliza Origin 7, suministrado por Micro Cal, para demostrar el ajuste de datos. Para comenzar, cargue el primer archivo de datos.Revise el termograma crudo en busca de signos de burbujas de aire u otros artefactos en la señal, en caso de que existan artefactos como picos en la línea base o picos en ausencia de un punto de inyección. Anote estos puntos de datos, ya que deben eliminarse. A continuación, cargue los datos del control de dilución del ligando y réstelos del isoterma de unión en este momento.Elimine todos los puntos de datos espurios, incluidos los primeros puntos de datos de la titulación donde normalmente ocurren artefactos de dilución. Luego seleccione el modelo de ajuste de datos. Una vez seleccionado el modelo, los datos pueden ajustarse ingresando manualmente valores iniciales estimados de los parámetros de ajuste, incluyendo estequiometría, entalpía y afinidad de unión.Sin embargo, si se conoce de antemano algún parámetro a partir de experimentos ortogonales, estos valores deben introducirse, ya que ayudarán a evitar que los datos queden atrapados en mínimos locales durante el ajuste. Una vez que se hayan ajustado los datos de la primera titulación, repita los pasos del análisis de datos para el resto de las isotermas. Alternativamente, los datos pueden ajustarse globalmente utilizando un programa como said fat; para iniciar un ajuste global, guarde los datos en Origin como un archivo con extensión .dat.Luego importe los datos en dicha grasa. Elija un modelo para el ajuste y ajuste globalmente los datos, alternando entre las opciones de ajuste simplex y Mark HAR Leven, hasta que el valor global de chi-cuadrado haya alcanzado un mínimo. El procedimiento representativo de ITC demostrado en este video monitorea la unión de N-A-D-P-H a la dihidrofolato reductasa cromosómica de e coli.La unión exotérmica de N-A-D-P-H a la dihidrofolato reductasa es evidente en el termograma crudo, ya que se libera calor. La disminución de las señales térmicas tras cada inyección sucesiva indica la saturación de la unión, que ocurre en la primera mitad de la titulación. La pureza de los componentes y la buena coincidencia de los tampones se observa en la porción saturada de la gráfica, donde solo hay señales térmicas mínimas derivadas del calor de dilución del ligando. Los datos se ajustaron a un modelo de un solo sitio utilizando el software Origin para revelar el isotermo de unión. A continuación, se ajustaron dos conjuntos de datos a un modelo de un solo sitio utilizando dicho ajuste. Los valores pequeños y el patrón aleatorio de los residuos indican que los parámetros termodinámicos son razonables. Estos parámetros también se validan mediante comparación con valores de la literatura obtenidos por métodos ortogonales.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la unión de ligandos a macromoléculas utilizando un ITC-VP de MicroCal, preparando adecuadamente las soluciones, configurando los parámetros experimentales y analizando los datos.

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