Los hidrogeles de alginato para la cultura del órgano en tres dimensiones de los ovarios y oviductos
June 20th, 2011
Cultivo de células normales en sus tres dimensiones contexto representa un método alternativo para estudiar los primeros eventos necesarios para la transformación celular y tumorigénesis. Este método se utiliza para producir los ovarios normales y las células del oviducto para estudiar los eventos tempranos en la formación de cáncer de ovario.
Este procedimiento delinea la propagación de células ováricas normales y epiteliales dúctiles como un cultivo de órganos tridimensional. Primero, diseccione la almohadilla de grasa UCT del ovario y parte del útero de un ratón. A continuación, retire la bursa y diseccione las membranas dúctiles con un par de pinzas y corte cada ovario o UCT en dos a cuatro piezas, denominadas organoides.
Finalmente encapsular el organoide en una gota de alginato sobre un trozo de fibra de malla. A medida que OSC y TEC se cultivan en medios definidos, conservan las características normales de la célula en su arquitectura tridimensional nativa. La inmunohistoquímica en secciones de tejido, el análisis de ARN y el análisis de proteínas pueden proporcionar información sobre el impacto de OSC y TEC en el cáncer de ovario.
La principal ventaja de esta técnica, en comparación con el cultivo celular inmortalizado bidimensional tradicional, es que las células pueden crecer en contacto con la matriz extracelular subyacente y las células estromales sin inmortalidad genética que podría alterar las vías celulares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de ovario, como la definición de eventos tempranos en la formación del cáncer y la determinación de qué tipo de célula surgen los cánceres de ovario serosos. Aunque este método puede proporcionar información sobre el cáncer de ovario, también se puede aplicar a otros sistemas, como el cultivo de folículos ováricos y el cultivo de ojales beta pancreáticos.
Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la extirpación de las membranas de la bursa y la uc sin dañar los ovarios y la UCT es un desafío. Primero, prepare una solución al 0,5% de alginato en PBS estéril y caliente a 37 grados Celsius mezclado por inversión o balanceo. A continuación, extraiga el alginato en una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 25 y mantenga una temperatura de 37 grados centígrados.
A continuación, prepare una solución de cloruro de calcio de 10 milimolares para reticular el alginato tras la encapsulación del tejido y caliéntela a 37 grados centígrados. Además, prepare un mililitro de medio de cultivo por pocillo en una placa de 24 pocillos para cada experimento que incluya varios medicamentos, péptidos o virus en el medio de cultivo. Al diseccionar los órganos del animal, retire cualquier grasa o tejido residual.
Retire suavemente la membrana de las fresas que rodea el ovario y corte el ovario en cuatro pedazos dividiendo el órgano para desenrollar suavemente el tejido del oviducto. Separe las membranas de conexión y extienda los extremos del tubo en direcciones opuestas. Uso de fórceps.
Antes de cortar, coloque una sola gota de alginato de aproximadamente dos microlitros sobre una fibra de malla esterilizada. Con pinzas estériles, introduzca un trozo de órgano en la gota de alginato y centre la gota para invertir la gota que contiene el organoide. Voltee la fibra de la malla y permita que la gravedad fuerce el alginato a formar una gota colgante en el borde de una placa de Petri de 10 centímetros que contiene una solución de cloruro de calcio de 10 milimolares.
Golpee las pinzas para que la gota caiga en la solución. Incubar durante dos minutos. Retirar con una cuchara estéril que contenga poros para liberar 10 milimolares adicionales de cloruro de calcio y transferir al medio de cultivo el cultivo durante un período de tiempo definido.
Para la solubilización del gel de alginato, incubar los cultivos en 3,4 miligramos por mililitro. La alginato liasa disuelta en ovitz es L 15. Presione a 37 grados centígrados durante 30 minutos o hasta que el gel se disuelva por completo.
A continuación, retire el tejido de la alginato liasa. Ahora, para recolectar el OSE, incubar el organoide con 500 unidades de colagenasa en ovitz ISS. L 15 medios durante una hora vórtice en pulsos de dos segundos a potencia media durante un minuto, seguido de un segundo.
Pulsa durante un minuto. Deje que las piezas del órgano caigan al fondo del tubo de microcentrífuga y pipetee el supernat en una centrífuga de tubo de microcentrífuga estéril fresca durante tres minutos a 3000 RPM para peletizar el epitelio de la superficie ovárica. Finalmente, para recolectar el epitelio tubárico, corte el tubo a lo largo y colóquelo en plástico de cultivo de tejidos durante tres a cinco días.
Las células se arrastrarán fuera del estroma de las trompas y crecerán en el plástico del cultivo de tejidos. Recoja la perla encapsulada en alginato del medio de cultivo en el punto de tiempo seleccionado para volver a cruzar. Une el alginato para endurecer el gel colocando el cultivo en una solución estéril de cloruro de calcio de 10 milimolares durante dos minutos.
Ahora, fije el órgano encapsulado en alginato asegurándose de que el gel permanezca sólido y encapsule completamente el tejido durante la fijación. Se pueden cultivar tipos de células, como la OSC, que no crecen bien en superficies de plástico. Utilizando este método ya facilitar la investigación de los procesos celulares normales o los eventos más tempranos en la formación del cáncer.
Bajo el microscopio, la bursa y la almohadilla de grasa circundante se extrajeron y procesaron para incubar organoides encapsulados en alginato. En medio de cultivo. El OSC reparó la superficie herida por la incisión con el bisturí en función del tiempo y la distancia.
El análisis inmunohistoquímico con un anticuerpo de citoqueratina 8 indica que los ovarios cortados por la mitad encapsulan el ovario de manera más completa en comparación con los ovarios cortados en cuartos u octavos. La arquitectura de los tejidos, la morfología celular y las tasas específicas de crecimiento celular se controlan fácilmente mediante secciones de parafina. Por ejemplo, se observa una sola capa de epitelio de la superficie ovárica después del cultivo en MEM libre de suero durante siete días.
Mientras que la adición de cinco microgramos por mililitro, insulina durante siete días induce una hiperproliferación del epitelio de la superficie ovárica y la formación de múltiples capas de células. Aquí, la inmunofluorescencia de la proteína fluorescente verde se visualiza a través del gel de alginato con microscopía estándar después de la transfección de CDNA. Si bien el cultivo de órganos de alginato proporciona el crecimiento y el análisis del epitelio de la superficie ovárica y los folículos primarios, debe tenerse en cuenta que los folículos secundarios maduros no sobreviven en este sistema de cultivo.
Las alteraciones en proteínas o ARN se pueden analizar de todo el órgano o de tipos celulares específicos mediante degradación enzimática. El tratamiento de organoides ováricos cultivados con colagenasa deja intacto el estroma subyacente al tiempo que permite el enriquecimiento del epitelio de la superficie ovárica en la célula obtenida después del tratamiento. Esta técnica se puede realizar en una o dos horas si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la esterilidad en todo momento. Después de este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales, como la inmunohistoquímica, la transferencia occidental y las matrices de transcripción, para responder a preguntas adicionales, como cómo la morfología celular y la arquitectura de los tejidos contribuyen a los eventos transformadores tempranos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el cultivo tridimensional de alginato de ovario y oviducto.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visión general
Este estudio presenta un método para propagar células epiteliales normales ováricas y de oviducto en un cultivo de órgano tridimensional. Este enfoque permite a los investigadores investigar eventos tempranos en la formación del cáncer de ovario mientras se mantiene la arquitectura nativa de las células.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Oncología
- Técnicas de cultivo de órganos
Antecedentes
- Las células normales pueden cultivarse en un contexto tridimensional.
- Este método ayuda a estudiar la transformación celular y la tumorigénesis.
- El cáncer de ovario es un área significativa de investigación debido a su complejidad.
- Entender los eventos tempranos en la formación del cáncer es crucial para desarrollar terapias.
Propósito del estudio
- Criar células ováricas y de oviducto normales en un cultivo tridimensional.
- Estudiar los eventos tempranos que conducen al cáncer de ovario.
- Retener las características celulares normales durante el cultivo.
Métodos utilizados
- Disección de ovarios de ratón y depósito de grasa del UCT.
- Creación de organoides a partir de tejidos disecados.
- Encapsulación de organoides en gotas de alginato.
- Uso de inmunohistoquímica, ARN y análisis de proteínas para obtener información.
Resultados principales
- Se retienen las características celulares normales en el cultivo tridimensional.
- Se pueden obtener conocimientos sobre el impacto de OSC y TEC en el cáncer de ovario.
- Los análisis de inmunohistoquímica y moleculares proporcionan datos valiosos.
- Este método ofrece una nueva perspectiva para estudiar el cáncer de ovario.
Conclusiones
- El método de cultivo tridimensional es eficaz para estudiar células ováricas.
- Permite investigar eventos de formación temprana del cáncer.
- Este enfoque puede mejorar la comprensión de la biología del cáncer de ovario.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Three-dimensional alginate hydrogel organ culture enables disease-relevant modeling of ovarian and oviductal tissues, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in oncology discovery. This system preserves native tissue architecture and cell interactions, facilitating predictive confidence in studies of early cancer initiation and biomarker development. The approach enhances translational continuity by allowing direct interrogation of primary cells from genetically engineered models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of early transformative events in ovarian cancer using primary, non-immortalized cells.
- Supports mechanistic de-risking by maintaining native extracellular matrix and stromal interactions.
- Facilitates functional validation of candidate targets in a physiologically relevant context.
- Permits use of knockout and transgenic mouse models for pathway clarification.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for quantitative analysis of protein and RNA outputs from organ cultures.
- Supports reproducible preparation of multiple organoid cultures from a single animal, increasing experimental throughput.
- Enables standardized introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules for functional screening.
- Allows assessment of tissue-specific responses to candidate compounds or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems for biomarker discovery and validation.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation using primary tissue models.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling early disease processes in vitro.
- Permits analysis of tissue architecture and cellular morphology relevant to human disease.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, target validation, and mechanistic studies in a three-dimensional, physiologically relevant system.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway interrogation in primary ovarian and oviductal tissues.
- Screening: Provides assay-ready organoid cultures for quantitative and reproducible analysis.
- Analytics: Delivers protein, RNA, and morphological readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges early discovery with preclinical validation through disease-relevant tissue models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to other tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early cancer research.
- Operational Value: Standardizes tissue culture and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection and three-dimensional culture techniques.
- Needs access to sterile instrumentation, alginate handling, and analytical platforms for protein and RNA analysis.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility across experiments and models.
- Adaptation to other organ systems may require protocol optimization for tissue-specific viability.
- Limited survival of mature secondary follicles may restrict certain applications, as supported by source data.
