Un enfoque rápido para imágenes de fluorescencia de alta resolución en rodajas de cerebro semi-gruesa

El objetivo general de este procedimiento es visualizar de manera más sencilla neuronas fluorescentes dentro de secciones gruesas de cerebro. Esto se logra primero incrustando el cerebro en un soporte de gelatina. El segundo paso del procedimiento consiste en seccionar el cerebro en láminas gruesas sobre el microtomo comprimido.

El tercer paso del procedimiento consiste en aclarar ópticamente las secciones cerebrales en un gradiente de glicerol. El paso final del procedimiento es montar las secciones cerebrales clarificadas sobre portaobjetos para la obtención de imágenes fluorescentes. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran una expresión de proteínas reporteras fluorescentes con alta resolución en neuronas dentro de secciones cerebrales gruesas, mediante microscopía epifluorescente o confocal.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la sección delgada, la microscopía fluorescente en serie o la imagenología multifotónica es que es mucho más rápida, requiere menos trabajo manual y no necesita técnicas de microscopía costosas o sofisticadas. Para comenzar, recupere el tejido cerebral de ratón que ha sido fijado mediante perfusión cardíaca con NC dos y que ha sido posfijado durante una a dos horas a cuatro grados Celsius. A continuación, prepare una solución de agarosa al 2 % de alta resistencia y bajo punto de gelificación en PBS y caliente en el microondas hasta que se disuelva.

Transfiera el agros fundido a un tubo de ensayo y colóquelo en un bloque térmico de 40 grados Celsius para equilibrar la temperatura mientras el agros se equilibra; pegue el tejido cerebral fijado sobre el émbolo de la jeringa de muestra. Con pegamento Sano Aate, sumerja el tejido montado en una solución de PBS con sacarosa saturada para recubrir la superficie del cerebro y luego introduzca el émbolo dentro de su carcasa. Pipetee el agros tibio dentro del émbolo, cubriendo completamente el tejido cerebral y asegurándose de no introducir burbujas de aire.

Finalmente, sujete la jeringa de la muestra con un bloque refrigerante frío durante aproximadamente un minuto. Para colocar los aros, ensamble la jeringa de la muestra que contiene el tejido cerebral embebido en la base comprimida. Alinee el borde de la cuchilla cuidadosamente con la salida de la jeringa de la muestra y luego llene el tanque de tampón con PBS.

Gire el micrómetro. Una vez que el grosor del corte esté ajustado, empuje el tejido cerebral embebido fuera de la jeringa de muestra. Para generar el primer corte, presione el botón de inicio en la unidad de control.

Repita el proceso de avanzar el tejido incluido y presionar el botón de inicio para generar el número deseado de secciones. Recolecte las secciones con una pipeta de transferencia y transfiéralas a un vial de vidrio para inhalación lleno con PBS. Retire con pipeta la mayor parte del PBS de las secciones recolectadas y reemplace con una solución de glicerol al 10 % en PBS. Agite suavemente el vial a cuatro grados Celsius en un agitador rotatorio de mesa hasta que las secciones se hundan.

Continúe con la clarificación gradual repitiendo el proceso de decantación y rellenado con soluciones de glicerol al 25, 50 y luego al 75 %. Aspire con pipeta la solución de glicerol al 75 % y sustitúyala por glicerol al 90 %. Tenga cuidado de no introducir burbujas y equilibre a cuatro grados Celsius con agitación suave.

Ahora que las secciones han sido completamente clarificadas, ya no se hundirán, sino que mostrarán una flotabilidad neutra. Corte el adhesivo doble cara en forma de rectángulo abierto con un borde de dos a tres milímetros para que se ajuste al área visible de una portaobjetos microscópica de 25 por 75 milímetros utilizando un par de pinzas. Coloque las secciones cerebrales dentro del borde sobre la portaobjetos.

Baje suavemente el cubreobjetos sobre la cinta adhesiva. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire y aplique presión para crear un sello; aspire cualquier exceso de glicerol y luego selle los bordes del cubreobjetos aplicando esmalte transparente. Una vez que el sello esté seco, la preparación puede guardarse en una caja de portaobjetos a cuatro grados Celsius o usarse para imágenes.

Utilice inmediatamente la microscopía de fluorescencia epiescopia. El patrón de expresión de un vector viral que expresa GFP mejorado puede observarse en una sección coronal de 200 micrómetros de grosor de tejido cerebral de ratón. Aquí, el área resaltada de la imagen de fluorescencia epiescopia se muestra a alta resolución mediante microscopía confocal para revelar neuronas corticales individuales de la capa cinco.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes cerebrales gruesos fijados para obtener imágenes fluorescentes rápidas y de alta resolución.