Name: Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Keşfedin, tümörlerde nanopartikül alımını değerlendirmek için canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, kuş embriyosu modelinde yüksek çözünürlüklü gerçek zamanlı analiz sağlar ve kanser araştırmalarında hızlı sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada CCSRI Hibe # 700.537 ve CIHR Hibe JDL ve NIH / NCI hibe # CA120711-01A1 ve AZ CA120711-01A1 # 84.535 tarafından desteklenmiştir. Tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım yönetmelik ve yönergeler doğrultusunda gerçekleştirilen ve California San Diego, Hayvan Bakım Üniversitesi&#39;nde Komitesi kullanın ve Western Ontario Üniversitesi&#39;nde kullanın.

1. Kuş embriyo CAM içine tümör Aşılama <ol><li> Kabuk az döllenmiş tavuk embriyolar 8 açıklandığı gibi hazırlayın. </li><li> Embriyonik gelişim Gün 9, 1 ml şırınga üzerine bağlı 18-gauge iğne kullanılarak bir mikro enjektör montajı. 5-6 inç Tygon boru (1 / 32 "iç çapı, 3 / 32" dış çapı, 1 / 32 "duvar kalınlığı) bir parça kesin ve tüp içine iğne konik dikkatlice yerleştirin. Tüp yaklaşık 4-5 cm iğne ucu kadar uzanır (Şekil 1a). </li><li> Hücre süspansiyonu ile şırınga ve tüp doldurun. Daha sonra, boru sonunda mikroenjeksiyon cam iğne takın ve dikkatli bir şekilde herhangi bir hava kabarcıkları. </li><li> Gün ışığı ile CAM (Şekil 1c) içinde bolus olarak 10,000-100,000 kanser hücreleri bir diseksiyon kapsamında 9 embriyolar (Şekil 1b) enjekte edilir. Hücreleri enjekte yavaş yavaş ve dikkatli bir iğne CAM içinde görünür bir bolus oluşturmak için hücreleri için doğru yerde olduğundan emin olun. Hücreler CAM yüzeye damla Kimwipe veya diğer aplikatör kullanılarak temizlenebilir. </li><li> % 60 nem ve 38 ° C'de nemlendirilmiş inkübatör embriyo dönün ve tümör izin büyümeye ve vascularize (7 güne kadar). </li></ol> 2. Nanoparçacıkların hazırlanması <ol><li> Tavuk embriyo içine enjeksiyon için floresan etiketli CPMV nanopartiküller hazırlamak için; viral nanopartiküller (herhangi kaldırmak için kullanarak ve bir dakika boyunca santrifüj önce 100 mg / ml Vortex karışımı bir konsantrasyon, PBS, pH 7.4 8 olarak sentezlenmiş sulandırmak toplar. Sonikasyon konjugatları ve agregasyon derecesi bağlı olarak yararlı olabilir 4 saklandığında floresan etiketli CPMVs stokları en az 1 yıl boyunca stabildir ° C karanlıkta bir çift koyarak stokları periyodik olarak kontrol edin bir cam slayt üzerine düşer ve floresan kontrol Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) parçacıklar konjugasyon sonra değişmediğini belirlemek için kullanılır. </li><li> Kısaca, viral nanoparçacıkların bir mikrogram (2 ul nihai hacmi) bakır kaplı ızgaraları eklenebilir. Sonra, bir eşit miktarda elektron mikroskobu (Philips EM 410) az 1 dakika süreyle% 2 oranında uranil asetat ekleyin. </li></ol> 3. Floresan etiketli viral nanoparçacıkların İntravenöz enjeksiyon <ol><li> 16 Gün, yukarıda açıklandığı gibi mikro enjektör montajı. Şırıngaya boru (&gt; 200 mcL) ile viral nanoparçacık istenilen hacmi çizin. Herhangi bir hava kabarcığı dikkatlice çıkarın. Mikroenjeksiyon cam boru sonunda iğne takın. Iğne kadar uzun ve mümkün olduğunca konik (Şekil 2a) olduğundan emin olun. Iğne çok künt ise, ektoderm ile delmek için mümkün olmayacaktır ve gemi nüfuz başarısız olur. Iğne çok keskin ise doku nüfuz ederken, ucu çökecek. </li><li> İstediğiniz siteye distal tümör taşıyan embriyo haline intravenöz (Şekil 3d) görüntülenebilmekte 1 mg / ml flöresein dekstran (MW 70.000 Da, Invitrogen) 100 ul enjekte edilir. Başarılı CAM ven kanülasyonu enjeksiyon akış yolu kan temizleme (Şekil 2b) tarafından açıktır. Enjeksiyon sonrası vasküler sızıntı 1 saat değerlendirin. </li><li> İstediğiniz siteye distal vasküler sızıntı tümörleri içeren embriyolar halinde intravenöz CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) veya pegile CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) 1 mg / ml solüsyon enjekte 50 ul görüntülenebilmekte. </li><li> Görüntü hemen tümörler ve enjeksiyondan sonra bir Yokogawa dönen disk, Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD kamera ile donatılmış bir Zeiss Examiner Z1 dik bir mikroskop kullanılarak her saat. </li></ol> 4. Gerçek zamanlı intravital görüntüleme <ol><li> Embriyo görüntüleme birimi bir araya getirmek için, vakum gres embriyo görüntüleme ünitesi kapağın alt görüntüleme liman çevresinde ince bir tabaka halinde uygulayın ve liman üzerine 18 mm cam lamel uyacak. </li><li> Lamel görüntüleme için istediğiniz alanı kapsayacak böyle embriyo yerleştirin. Lamel yavaşça embriyo ile temas edinceye kadar kapağı düşük ve daha sonra birim üzerine kapağı vidalı bir yerde tutun (Şekil 2c). </li><li> Embriyo içeren çanak dışında embriyo görüntüleme ünitesi içine 37 ° C sıcak su ekleyin ve sonra 37 dengelenmiş içinde çevre odasına ° C ile dik bir konfokal mikroskop sahneye tüm birim </li><li> İplik disk konfokal floresan mikroskobu (Şekil 2e) altında embriyo içeren Pozisyon görüntüleme ünitesi. Görüntüleme ünitesi yakalanan üç boyutlu Z yığınları ve zaman atlamalı görüntüleri için izin, yer embriyo tutun ve görüş alanı yakalama görüntüleri ise sabit tutmak. Biz kazanmak ve Perkin Elmer (eski Doğaçlama) Volocity yazılım paketi (Şekil 3a) kullanarak üç boyutlu zaman atlamalı görüntüleri analiz. Tümörün üç boyutlu bir yığın yüksek çözünürlüklü ve detaile görselleştirmek için çevreleyen damar kazanmakd belirli bir zaman noktalarında yapısal analizler. Tümör damarsal ayrıntılı yapısal değişiklikler eşlemek için normal süre noktaları üç boyutlu yığınlar edinin. Görüntü tümörler her enjeksiyondan sonra saat. </li><li> Hesaplayarak ortalama Alexa Fluor (AF), tümör ya da böyle bir Volocity olarak stroma (non-tümör alan) kullanarak görüntü kantitatif yazılımı (Perkin Elmer) seçilen bölgeler içinde 647 sinyal alımını viral nanoparçacıkların Asitli. Stroma oranı tümör stroma ortalama AF 647 sinyal üzerinde tümörün ortalama AF 647 sinyal bölünmesi ile hesaplandı. Tümör / stroma oranı 1'den yüksek bir nanoparçacık tümörün alındığını olduğunu gösterir. </li></ol> 5. Temsilcisi sonuçları: Örneğin burada anlatılan, biz günde 9 tavuk embriyolar (Şekil 1b) CAM içinde yaklaşık 1 mm boyutunda bir bolus oluşturmak için HT-29 kolon kanseri hücreleri enjekte etti. Aşılama sonra, embriyolar yeterli tümör büyümesi ve vaskülarizasyon (Şekil 1c) izin nemlendirilmiş bir inkübatör 7 gün süreyle kültüre edildi. Embriyolar tümör vaskülarizasyon onaylamak düşük molekül ağırlıklı dekstran ile intravenöz enjekte edildi ve tümörler Zeiss AxioExaminer Z1 dik mikroskobu (Şekil 2d) altında görüntülendi. CPMV-AF 647 veya CPMV-PEG-AF 647 nanopartiküller intravenöz uygulamadan sonra (Şekil 3a ve b), yüksek çözünürlükte gerçek zamanlı konfokal görüntüleme (Şekil 2e) CPMV ve CPMV-PEG hızla tüm damarsal etiketli nanopartiküller saptandı, ancak tümör CPMV-PEG alımı (Şekil 3a) 12 saat sonra, CPMV daha yaklaşık 3 kat daha yüksek oldu. Nanoparçacıkların nispi tümör alımı, görüntü analiz yazılımı (Perkin Elmer Volocity) kullanılarak tespit edildi. Tümör içinde ve dışında ilgi Bölgeler seçildi (stromal bölmesi) ve her birinin ortalama floresan yoğunluğu tespit edilmiştir. Veri tümör / stroma oranı olarak ifade edilir. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 bir kuş embriyo CAM içine tümörlerin Mikroenjeksiyon. Belirtildiği gibi (a) mikroenjeksiyon cihaz bileşenleri bir araya. (B) 9 gün Kuş embriyolar CAM tüm yüzeyini kapsayacak şekilde yayıldı tümör ile aşılanmış olmak için hazırız. (C) 16 gün, tümör çapı 1 cm (kesikli çizgi) kadar büyüdü ve nanopartiküller ile enjeksiyon için hazır olacak. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Nanopartikül enjeksiyon ve intravital görüntüleme. Gösteren bir diseksiyon mikroskop altında enjeksiyon (a), (temizleyerek görülen CAM damar içine enjekte edilir ve (b) mikroenjektör iğne kan akımı enjekte nanopartiküller damar içine eklenir (ok ile gösterilir) ve hazır mikroenjektör iğne ucu kan). (C) Görüntüleme birimi lamel CAM ile doğrudan arabirim ile kuş embriyo içeren. (D) nanoparçacık enjeksiyon öncesinde, tümör vaskülarizasyon floresein dekstran enjeksiyondan sonra intravital görüntüleme ile değerlendirildi. (E) Görüntüleme Ünitesi, 37 ° C sıcaklığa ayarlı muhafaza kümesi içinde dik bir konfokal mikroskop sahnede yer embriyo içeren <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 insan tümörlerinde nanoparçacık alımı intravital görselleştirme. Tümörler (a) CPMV-AF647, (b) CPMV-PEG-AF647 enjeksiyonundan 7 saat sonra görüntülenir. d) sonraki analiz için kuş embriyo tümör eksizyonu.

<ol><li>Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).</li>
<li>Judenhofer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+PET-MRI%3A+a+new+approach+for+functional+and+morphological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging.</a> Nat Med. 14, 459-465 (2008).</li>
<li>Weissleder, R., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+the+era+of+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging in the era of molecular oncology.</a> Nature. 452, 580-589 (2008).</li>
<li>Chambers, A. F., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+for+experimental+metastatic+ability+of+heterologous+tumor+cells+in+the+chick+embryo+after+DNA-mediated+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer.</a> Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).</li>
<li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rat+glioma+growth%2C+invasion%2C+and+vascularization+in+a+novel+chick+embryo+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model.</a> Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).</li>
<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibition+of+tumor+cell+intravasation+and+subsequent+metastasis+via+regulation+of+in+vivo+tumor+cell+motility+by+the+tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151.</a> Cancer cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nature medicine. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Leong, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Chatterji, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+addresses+on+an+addressable+virus+nanoblock%3B+uniquely+reactive+Lys+residues+on+cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus.</a> Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).</li>
<li>Brunel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+viral+nanoparticles+for+biomedicine%3A+the+impact+of+PEG+chain+length+on+VNP+cell+interactions+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo.</a> Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMV+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Kuş embriyo chorioallantoic membran (CAM), vasküler dinamikler ve insan tümörlerinde farmakokinetiği değerlendirmek için kullanışlı bir modeldir. CAM yapısı ve konumu, yüksek kalitede görüntü elde etme sağlar ve invaziv cerrahi prosedürler olmaksızın birçok türde kanser xenografts barındırmaktadır. Ayrıca, kanser tümörü xenografts, tümör dokusu nanoparçacıkların birikimi değerlendirmek için hızlı, ucuz ve yarı-yüksek verimlilik anlamına gelir sunan, 7 gün içinde vaskülarize haline chorioallantoic membran yerleştirilir. CAM kabuk az tavuk embriyoların implante kanser xenografts tümör damarsal nanoparçacık alımı ile ilgili bir dik Epifloresans veya konfokal mikroskop, bağlamsal ve zamansal bilgiler yüksek çözünürlüklü optik erişilebilir olduğundan kolayca elde edilebilir. Bu modelde Kanser xenografts az 200 m derinlikte kalarak büyük tümörlerde, CAM üzerinde yanal büyümek eğilimindedir. Standart Epifloresans mikroskopları tüm tümör kitlesi etkin bir şekilde nüfuz eder, çünkü bu, onları özellikle iyi intravital görüntüleme için uygun hale getirir. Buna karşılık, fare içinde yüzeyel veya ortotopik siteleri ya implante tümörler zor non-invaziv teknikleri ile bu tümörler içinde derin nanopartiküller doğru lokalize etmek, üç boyutlu olarak çoğalırlar. Biz geniş bir yelpazede nanoparçacık formülasyonların in vivo analizi için uygun olduğu için bu model için potansiyel vurgulayarak, kuantum noktaları, lipozomlar ve demir oksit, insan tümör xenografts bir dizi nanopartiküller alımını değerlendirmek için bu model kullanılır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı / Ekipman </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Döllenmiş leghorn yumurta </td><td> Frey `ın Kuluçkahane, Jacobs </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dremel döner aracı </td><td> Dremel </td><td></td><td> Herhangi bir model kullanılabilir </td></tr><tr><td> Hiçbir Dremel kesme tekerlekleri. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Sporcu çıkım </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td> Sporcu inkübatör </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td></td><td></td><td> % 70 (hacim / hacim) </td></tr><tr><td> Polistiren tekneler tartmak </td><td> VWR </td><td> 12577-01 </td><td></td></tr><tr><td> Kare Petri kutularına </td><td> Simport, VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td> Rubbermaid kauçuk konteyner kapaklı </td><td> Guillevin </td><td> RH3-228-00-BLU </td><td> delik tarafı içine delinmiş </td></tr><tr><td> Dikey pipet çektirmesi </td><td> David Kopf Aletleri </td><td> modeli 720 </td><td> Ayarlar: 16.3 (ısıtıcı) ve 2.3 (solenoid) </td></tr><tr><td> Sodyum borosilikat camdan kılcal tüpler </td><td> Sutter Enstrüman </td><td> BF100-58-10 </td><td> (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm, 10 cm uzunluk) </td></tr><tr><td> 1X Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartalı Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH: 7.4 </td></tr><tr><td> Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) (1X), sıvı </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tripsin, EDTA 4NA% 0,05 (1X), sıvı </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 12483-020 </td><td> Inaktive Isı </td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> Hausser Bilimsel, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf modeli 5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td> İnce nokta forseps </td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon R-3603 tüp </td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> 50 ft (1/32-inch iç çapı, dış çap, 3/32-inch 1/32-inch duvar kalınlığı </td></tr><tr><td> Enjeksiyonları 18-gauge iğne için derialtı iğneler </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> 100 Kutu </td></tr><tr><td> Enjeksiyon için 1 ml şırınga </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 100 Kutu </td></tr><tr><td> Fiber-optik mikroskop aydınlatıcı </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> V. unguiculata tohumları (California siyah-gözü 5) </td><td> Burpee </td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td> Kapalı büyüme ışıkları </td><td> Sunlite, Gardener&#39;ın Kaynağı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metil-PEO4 NHS ester </td><td> Delmek </td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> MPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 </td><td> NANOCS </td><td> PEG1-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 karboksilik asit (succinimidyl ester) </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Yeşil 488 succinimidyl ester * 6-izomeri * </td><td> Invitrogen </td><td> O-6149 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Dibazik monohydrogen fosfat </td><td> Sigma </td><td> 379980 </td><td> KH2PO4 (phopshate tampon) </td></tr><tr><td> Mono dihidrojen fosfat </td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4 (phopshate tampon) </td></tr><tr><td> Superose 6 boyut-dışlanma sütun </td><td> GE sağlık yaşam bilimleri </td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> Akta Explorer 100 Kromatografi </td><td> GE Amersham Pharmacia </td><td> WS-AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> Akta yüksek akış kiti </td><td> GE sağlık yaşam bilimleri </td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrasantrifüjdeki </td&gt; <td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GB 28 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 342204 </td><td> Salıncak kova </td></tr><tr><td> 50.2 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 337901 </td><td> Sabit açılı </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri </td><td> Millipore </td><td> UFC910008 </td><td> 100 kDa kesti </td></tr><tr><td> Gradient eski </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> dekstran, floresein, 70.000 MW, anyonik </td><td> Invitrogen </td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td> İplik disk konfokal floresan mikroskop </td><td> Nisabı; Yokogawa CSU, 10, Yokogawa </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Epifloresans geniş alan mikroskobu </td><td> Nisabı; Zeiss Axio Examiner, Zeiss </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD kamera </td><td> Nisabı; Hamamatsu </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop için sıcaklık muhafaza ünitesi </td><td> Hassas Plastik </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Vakum gres </td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td> Dairesel cam yok lamelleri. 1 (18 mm) </td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity yazılım </td><td> Perkin Elmer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Civciv embriyo muhafaza </td><td></td><td> özel imal </td><td></td></tr><tr><td> Hassas makas </td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td> Formalin </td><td> Bioshop </td><td> FOR201.500 </td><td> Fumehood olarak kullanın </td></tr><tr><td> Optimal Kesme </td><td> Fisher; Doku Tek </td><td> 1437365 </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık (OCT) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plastik kalıpları </td><td> Balıkçı </td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond Yapıştırıcı Slaytlar </td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI ile altın Prolong </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Kriyostat için tek kanatlı </td><td> Balıkçı </td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td> Kriyostat </td><td> Leica CM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

intravital görüntüleme gerçek zamanlı tümörler nanopartikül alımı değerlendirme

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Mevcut teknolojiler gibi ultrason, MR, PET ve CT gibi tümör görüntüleme için uygun bir xenograftlarının modeli yararını vurgulayarak, mikroskobik düzeyde 1,2,3 tümörleri nanoparçacık alımını değerlendirilmesi için yüksek çözünürlüklü görüntüler veremezken Ayrıntılı alımı analizleri yapmak için hangi. Burada, değiştirilmiş bir kabuk, tavuk embriyo modeli insan tümör xenografts nanoparçacık alımını değerlendirmek için, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme kullanın. Tavuk embriyo modeli özellikle in vivo analizlerde, insan tümörlerinin büyümesini destekleyen, nispeten ucuz ve 4,5 anesthetization veya cerrahi gerektirmez, çünkü bunlar için iyi uygundur . Chorioallantoic membran (CAM) 6 içine implante Tümör hücreleri, 7 gün içinde tamamen vaskülare xenografts oluşturur . Ortaya çıkan tümörler, ya ev sahibi veya tümör sistemleri üzerinde çok az etkisi ile 72 saate kadar korunabilir non-invaziv, gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü görüntüleme tarafından görüntülenmiştir. Tümör distal uygulanan boyutları ve formülasyonları geniş bir yelpazesi ile Nanopartiküller görüntülenebilmekte ve kan yoluyla akışı gibi sayısal olabilir, sızdıran tümör damarsal extravasate ve tümör yerinde biriken. Biz burada, yakın-kızılötesi floresan boyalar ve / veya polietilen glikol (PEG) polimerler 7, 8, 9,10,11 süslenmiş Börülce mozaik virüsü (CPMV) türetilen nanoparçacıkların analizi açıklanmaktadır . Intravenöz üzerine, bu viral nanopartiküller dışında damar küresel etiketleme ve tümör 7,12 içinde hızla endotel hücreleri tarafından içselleştirilmiş. Viral nanopartiküller PEGylation plazma yarılanma ömrü artırır, kan dolaşımını zamanlarını uzatır ve sonuçta gelişmiş geçirgenlik ve retansiyonu (EPR) etkisi 7, 10,11 ile tümörlerin birikimi artırır. Görüntü analiz yazılımı kullanarak bir tümör nanoparçacıkların birikimi hızı ve kapsamı zamanla ölçülür. Bu teknik, hem de görselleştirmek ve insan tümörlerinde nanoparçacık dinamiklerini ölçmek için bir yöntem sağlar.

Biz bir kuş embriyo modeli dinamik, gerçek zamanlı intravital görüntüleme kullanarak insan xenografted tümörlerin vasküler nanoparçacık yerelleştirme ölçmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Ultrason, MRI, PET ve BT gibi güncel tümör görüntüleme teknolojileri, nanoparçacıkların değerlendirilmesi için yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlayamamaktadır...

Bu prosedürün genel amacı, intravital görüntüleme kullanarak nanopartiküllerin tümörler tarafından alınmasını nicel olarak belirlemektir. Bu işlem, öncelikle kuş embriyolarının kabuklarının soyulması ve kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, koriyoallantoik membran (cam) üzerinde ksenogreft tümörler oluşturmak ve bunların yaklaşık bir hafta boyunca büyümesini sağlamaktır.Prosedürün üçüncü adımı, nanoparçacıkların damar yoluyla fareye enjekte edilmesi ve ksenogreft tümörün gerçek zamanlı intravital konfokal görüntülemesinin gerçekleştirilmesidir. Prosedürün son adımı ise tümörün çıkarılması ve kesitlenmesidir. Nihayetinde, nanoparçacıkların tümör tarafından alınımı görüntüler üzerinden nicelleştirilir ve ikincil tümör analizleri gerçekleştirilebilir.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tümörlerdeki nanopartikül birikimlerinin dinamiklerini mikroskobik düzeyde değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü görüntülerin oluşturulmasına olanak tanımasıdır. Ayrıca, bu model sistem kullanılarak, tek bir araştırmacının iki hafta içinde çok sayıda deneysel grubu analiz etmesi mümkündür. Ek olarak, Shells embriyolarının Cory Alloid membranı, fiziksel manipülasyon ve invaziv olmayan görüntüleme için kolayca erişilebilirdir.Laboratuvarım, kanserde hedeflenmiş moleküler görüntüleme ve ilaç iletimi için nanoparçacıkların geliştirilmesine odaklanmıştır. Detaylı alım analizlerinin gerçekleştirilebileceği hızlı ve düşük maliyetli bir ksenogreft modeli arayışımız bizi kabuklu tavuk embriyosuna yönlendirmiştir. Burada, modifiye edilmiş bir kabuklu tavuk embriyosu modelindeki insan tümör ksenogreftlerinde nanoparçacık alımını değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme kullanıyoruz.Bu protokol için, dördüncü gündeki döllenmiş tavuk embriyolarını hazırlayın ve kabuklarını soyun. Standart yöntemi kullanarak, kalp atışını kontrol ederek embriyoların döllenmiş ve canlı olduğundan emin olun ve embriyonik dokuzuncu güne kadar 38 °C sıcaklıkta ve en az %60 bağıl nemde inkübe edin. Dokuzuncu günde embriyolar tümör hücresi inokülasyonu için hazır hale gelir.18 gauge bir iğneyi, beş ila altı inç uzunluğunda bir tigon tüp aracılığıyla bir mililitrelik bir şırıngaya bağlayarak bir mikro enjektör düzeneği kurun. İğnenin eğimli ucunu dikkatlice tüpün içine yerleştirin. Tüpün yaklaşık dört ila beş inçlik kısmı iğnenin ucundan dışarı uzanmalıdır.Şimdi, tümör hücresi süspansiyonunu boru aracılığıyla şırıngaya çekin ve ters çevirin. Hava kabarcıklarını gidermek için şırınganın yan tarafına dikkatlice vurun ve pistonu aşağı itin. Ardından, borunun ucuna bir mikroenjeksiyon cam iğnesi yerleştirin ve hücre süspansiyonu iğnenin ucuna ulaşana kadar pistonu aşağı itin.Şimdi, bir diseksiyon mikroskobu altında, 10.000 ile 100.000 arasında kanser hücresini kam içindeki interstisyel boşluğa yavaşça ve dikkatlice enjekte edin. Hücreler kam içerisinde görünür bir bolus oluşturmalıdır; kam yüzeyine çöken hücreler, bir kim wipe veya pamuklu aplikatörle hafifçe tamponlanarak temizlenebilir. Şimdi embriyoları, en az %60 nem oranına sahip 38 °C'lik bir inkübatöre geri yerleştirin.Tümörün büyümesine ve damarlanmasına yedi güne kadar izin verilmiş ve görüntüleme öncesinde çapı en az beş milimetreye ulaşmıştır; nanopartiküller, intravital mikroskop ile uyumlu bir floresan boya ile işaretlenmeli ve en az bir yıl boyunca stabil kaldıkları PBS içinde dört santigrat derecede saklanmalıdır. Ardından, mikro enjektöre çekilmeden önce, herhangi bir agregatı çöktürmek için nanopartikülleri bir dakika boyunca santrifüjleyin. Şimdi nanopartikülleri seyreltmek için PBS kullanarak, nihayetinde 50 mikrolitre hacimde 50 mikrogram nanopartikül enjekte etmek amacıyla mililitre başına bir miligramlık bir çalışma konsantrasyonu hazırlayın.Şimdi embriyonik gelişimin 16. gününde enjeksiyonlara geçiniz. İntravenöz olarak en iyi tümör taşıyan embriyoları seçebilmek için tümörlerin yeterince vaskülarize olup olmadığını kontrol edin. Tümör hücrelerinden ve nanopartiküllerden spektral olarak farklı, düşük moleküler ağırlıklı floresan bir dekstrin enjekte edin.Ardından, dekstrini floresan mikroskobunda görüntüleyin ve en damarlanmış tümörlere sahip embriyoları seçin. Embriyolar seçildikten sonra, hazırlanan nanopartiküllerden en az 200 µL damlatmak için hazır bir mikro enjektör kullanın. Şırıngayı ters çevirin.Hava kabarcıklarını gidermek için kenara dikkatlice vurun ve pistonu aşağı itin. Ardından, tüpün ucuna uzun, konik bir cam mikroenjeksiyon iğnesi yerleştirin ve nanopartikül çözeltisi iğnenin ucuna ulaşana kadar pistonu aşağı itin. Kör bir iğne ektodermi delmeyecek, aşırı keskin ve ince bir iğne ise dokuya yerleştirildiğinde kırılacaktır.Ardından, nanopartiküller enjekte edildikten hemen sonra görüntüleme yapılacak olan taraftan uzak bölgedeki embriyolara intravenöz olarak 30 ile 200 µL arasında nanopartikül enjekte edin. Bir sonraki bölümde açıklanan tümörler için işlem, embriyo görüntüleme ünitesinin hazırlanmasıyla başlar. İlk olarak, kapağın alt kısmındaki görüntüleme portunun çevresine ince bir tabaka vakum gresi sürün.Ardından, porta 18 mm'lik bir cam lamelle kapatıcı yerleştirin. Şimdi, kapatıcı lamelle görüntüleme yapılacak istenen bölgenin üzerinde olacak şekilde embriyoyu üniteye yükleyin. Ünitenin kapağını, lamelle embriyoyla sadece temas edene kadar yavaşça indirin ve kapağı vidalayarak sabitleyin.Şimdi, embriyo içeren kabı 37 °C su ile görüntüleme ünitesine doldurun. Bu ünite, embriyoyu döner disk konfokal floresan mikroskobu altındaki döner disk konfokal mikroskopta sabit tutacaktır. Çevresel odacığın 37 °C olduğunu kontrol edin.Şimdi, lamelle penceresi doğrudan mikroskobun altında olacak şekilde görüntüleme ünitesini tablaya yerleştirin. Objektifi ayarlayın ve görüntüleme işlemine geçin. Enjeksiyondan hemen sonra ve saatlik aralıklarla tümörün ve çevre damar yapısının yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarını edinin.Ardından, görüntüler tümör vaskülatüründe meydana gelen ayrıntılı yapısal değişiklikleri yansıtacaktır. Embriyo, su banyosunu değiştirme ihtiyacı olmadan 36 saate kadar sürekli olarak görüntülenebilir. Görüntülerden viral nanopartiküllerin alımını nicelleştirmek için velocity gibi bir yazılım paketi kullanın.Öncelikle tümörü seçin ve onu çevreleyen stromadan ayırın. Seçim işlemi, tümörün floresan dekstrin ile işaretlenmesiyle kolaylaştırılır. Şimdi tümördeki ve bitişik stromanın temsili alanlarındaki nanopartiküllerden gelen ortalama floresan sinyalini hesaplayın.Ardından, ortalama sinyal oranını hesaplayın. Tümör seçimini ortalama sinyale göre güçlendirin. Stromal seçimi güçlendirin.Birden büyük bir oran, nanopartiküllerin tercihen tümörde yerleştiğini gösterir. HT 29 kolon kanseri hücreleri, dokuzuncu gün camı içerisine yaklaşık bir milimetre çapında bir bolus oluşturacak şekilde enjekte edildi. Yedi günlük inkübasyonun ardından tavuk embriyolarına, tümör vaskülarizasyonunu doğrulamak için intravenöz olarak düşük moleküler ağırlıklı bir dekstrin enjekte edildi.CPMV LOR 6 47 veya pegillenmiş CPMV LOR 6 47 nanopartiküllerinin intravenöz uygulaması ve ardından yapılan yüksek çözünürlüklü gerçek zamanlı konfokal görüntüleme, hem CPMV hem de pegillenmiş CPMV nanopartiküllerinin tüm damar sistemini hızla etiketlediğini ortaya koymuştur. Enjeksiyondan sonraki 12 saat içinde, tümör bölgelerine kıyasla stroma bölgelerindeki floresan sinyalinin miktar tayini, pegillenmiş CPMV'nin tümör tarafından alınımının, CPMV'ye göre yaklaşık üç kat daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra; kuş embriyolarının hazırlanmasından tümör hücrelerinin xenograft edilmesine, nanopartiküllerin intravenöz enjeksiyonuna ve gerçek zamanlı intravital konfokal görüntüleme ile tümörlerdeki nanopartikül alımının değerlendirilmesine kadar, bir kuş embriyosu modelinde tümör xenograftlarında nanopartikül alımını değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü intravital görüntülemenin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.

evaluation-nanoparticle-uptake-tumors-real-time-using-intravital

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

Bu makalede, tümör hedefli nanoparçacık, Herdox optik görüntüleme analizi için prosedürler. Özellikle, hedef ve tümör penetrasyon değerlendirilmesi tümör tespit için çoklu görüntüleme cihazı ayrıntılı kullanımı burada açıklanmıştır.

Hedefli Viral Protein analizi HER2 + tümörler için teslim Nanopartiküller

Bu protokol, florofor etiketli nanokorlar ve geleneksel antikorlar kullanan farelerde in vivo yakın kızılötesi floresan ksenogreft görüntüleme deneylerinin ex vivo doğrulamasını gerçekleştirmek için gereken adımları ana hatlarıyla belirtir.

Nanobody ve Antikor Temelli Doğrulama<em&gt; İn Vivo</emFarelerde&gt; Tümör Xenograftlarında NIRF-görüntüleme Deneyler kullanma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sitometrisi ve Mikroskopi

Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

Bu iletişim kuralı transgenik fareler hücre özgü floresan işaretleri ifade intravital görüntüleme açıklar. İntravital görüntüleme implante edilebilir windows üzerinden süreçlerin mikroskobik görselleştirme mümkündür kullanarak yaşayan hayvanlarda yüksek çözünürlüklü gözlemler için non-invaziv bir yöntem sağlar. Bu yöntem boyuna işlemleri incelemek özellikle kullanışlıdır.

Tümör ilişkili damarlara kullanmanın intravital mikroskobu gelişmiş Dorsal deri kıvrım pencere Chambers transgenik floresan fareler üzerinde

Nanoilaçların in vivo performansının zayıf anlaşılması, klinik translasyonlarını engellemektedir. Tümör taşıyan immünokompetan farelerde kanser nanoilaçlarının sistemik, doku, tek hücreli ve subselüler düzeylerde in vivo davranışını değerlendirme prosedürleri burada açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, araştırmacıların klinik çeviri için umut verici kanser nanoilaçlarını tanımlamalarına yardımcı olabilir.

Kapsamlı Usulü değerlendirin<em&gt; İn Vivo</em&gt; Kanser Nanomedicines performans

Canlı hücre görüntüleme dinamik süreçler görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Sabit hücrelerin incelenmesi yanlış yorumlama ve süreci hakkında kafa karışıklığı yol açabilir yalnızca statik resimler sağlar. Bu eser alımı, uyuşturucu yayın ve hücre içi canlı hücrelerdeki liposomal nano tanecikleri yerelleştirilmesini çalışmak için bir yöntem sunar.

Vitro Lipid tabanlı nano tanecikleri tarafından canlı hücre Chemotherapeutics keşfetmek için Imaging teslim kullanma

Burada açıklanan vivo insan kanser hücrelerini hedef işlevsel nano tanecikleri yeteneğini incelemek için zebra balığı embriyoları kullanmak için bir yöntemdir. Bu yöntem, büyük hayvanlarda ve klinik çalışmalarda gelecekteki testler için optimal nano partiküllerin değerlendirilmesi ve seçilmesi için izin verir.

Zebrabalığında Fonksiyonel Floresan Silika Nano partikülleri ile Ksenogreftli İnsan Kanser Hücrelerinin Vivo Hedeflemesinde

Burada, onkojenik nükleik asitlerin terapötik susturulması için klinik olarak uygulanabilir bir yaklaşım sağlayarak, RNA oligomerlerini taşıyan manyetik demir oksit nanopartiküllerinin hayvan modellerinde metastatik meme kanserine in vivo olarak verilmesi için protokolü açıklıyoruz.

Murin Meme Kanseri Metastazlarında Nanoilaç Birikiminin İzlenmesi

Kan-beyin bariyeri, tedavisi olmayan bir hastalık olan glioblastoma için tedavilerin uygulanmasında önemli bir engeldir. Burada, boyut nedeniyle bu fizyolojik bariyeri atlayabilen ve tümör içinde birikebilen in vivo görüntü kılavuzluğunda demir oksit terapötik nano bir platform sunuyoruz.

Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Teslimi

Keşfedin, tümörlerde nanopartikül alımını değerlendirmek için canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, kuş embriyosu modelinde yüksek çözünürlüklü gerçek zamanlı analiz sağlar ve kanser araştırmalarında hızlı sonuçlar sunar.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Daha fazla video keşfet