Transducción de las células humanas con polímeros complejos Lentivirus ecotropic de Mayor Seguridad de la Biotecnología

El objetivo general del siguiente experimento consiste en introducir oncogenes u otros genes potencialmente peligrosos en células humanas mediante un lentivirus ecotrópico. Esto se logra produciendo un lentivirus pantrópico que codifica el receptor del retrovirus murino, así como un lentivirus ecotrópico que codifica el gen de interés. Las células son transducidas con el receptor del retrovirus murino, lo que las hace susceptibles a la transducción con el virus ecotrópico. A continuación, las células se transducen con el virus ecotrópico para introducir el oncogén, utilizando complejación polimérica con poli-cerebro y sulfato de condroitina para mejorar los resultados de transducción. Los resultados obtenidos muestran una transducción selectiva de células humanas con lentivirus ecotrópico, basada en microscopía fluorescente y análisis de hechos.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la transducción con retrovirus gamma, es que las partículas lentivirales pueden transducir de manera más eficaz muchos tipos celulares, incluidas las células no divididas, como las células madre. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer y de las células madre, como comprender la función de posibles oncogenes. Antes de comenzar este procedimiento, consulte al responsable de seguridad de su institución y siga las directrices de seguridad recomendadas.

Comience con un cultivo de células 293T sanas y de crecimiento rápido, trabajando en una cabina de cultivo de tejidos. Bajo condiciones asépticas, re suspenda cinco veces 10 a la 6 células 293T en 10 mililitros de medio para 293T sin antibiótico. Pipetee la suspensión celular en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros e incube la placa durante la noche en un incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Al día siguiente, inicie la transfección en la tarde. Primero, recoja una alícuota de Optum y de los plásmidos de transferencia, empaquetamiento y envoltura, y permita que estos se calienten a temperatura ambiente. Pipete 375 microlitros de Optimum en un tubo microcentrífugo y luego agregue 25 microlitros del reactivo de transfección FU gene HD. Asegúrese de que el reactivo FU gene se pipete directamente en el medio y no toque las paredes del tubo.

A continuación, en un segundo tubo de microcentrífuga, combine cinco microgramos del plásmido de transferencia, 3,75 microgramos del plásmido de empaquetamiento y 1,25 microgramos del plásmido de envoltura en la cantidad necesaria de OptiMEM para alcanzar un volumen de 100 microlitros. Luego, añada la mezcla de OptiMEM al tubo que contiene la mezcla de plásmidos e incube a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Durante los últimos minutos de la incubación, aspire muy suavemente el medio de la placa que contiene las células 293T y sustitúyalo con 10 mililitros de medio fresco para 293T sin antibiótico.

Finalmente, agregue gota a gota la mezcla de plásmidos del gen FU al medio de la placa de 10 centímetros. Coloque la placa en un incubador de cultivo celular ajustado a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, e incube durante la noche. Al día siguiente, aspire muy suavemente el medio de la placa y sustitúyalo por medio 2 9 3 T fresco sin antibiótico.

Luego, coloque nuevamente la placa en el incubador de cultivo de tejidos e incube durante dos días más. Tres días después de la transfección, aspire el medio que contiene el virus de la placa y filtre utilizando un filtro de baja unión a proteínas de 0,45 micrones. Después de filtrar el virus, realice diluciones seriadas de un virus control fluorescente en medio fresco sin antibióticos con seis microgramos por mililitro de polibrena, y utilice estas diluciones para transducir células de la línea celular adecuada. Al día siguiente, en una placa de 24 pocillos, cambie el medio por medio fresco sin antibióticos y continúe la incubación durante otros dos días para permitir que las células expresen la proteína fluorescente.

Utilice datos empíricos para determinar la fracción de células transducidas para cada dilución viral. Luego, calcule el título en unidades transformantes por mililitro basándose en las diluciones que produzcan menos del 15 % de transducción, con el fin de minimizar los eventos de transducción múltiple. Se presume que los títulos de otros lentivirus no fluorescentes producidos en paralelo son similares al del virus fluorescente.

Para transducir células diana, comience por seleccionar una multiplicidad de infección mayor a dos para asegurar que la mayoría de las células serán transducidas. Primero, diluya el sobrenadante viral hasta la multiplicidad de infección requerida en medio de cultivo completo fresco, suplementado con seis microgramos por mililitro de polibreno hasta un volumen final de un mililitro.

Aspire el medio de un platillo de 35 milímetros de células diana y agregue un mililitro de sobrenadante viral diluido. Incube en el incubador de cultivo de tejidos durante 24 a 48 horas para permitir una expresión suficiente del receptor SLC7A1 si se desea. Utilice selección con antibiótico blasticidina para seleccionar células transducidas establemente que expresen SLC7A1 según las instrucciones del procedimiento escrito.

Para comenzar la determinación de toxicidad, prepare una solución madre de 20 miligramos por mililitro de sulfato de condroitina y una solución madre de 20 miligramos por mililitro de poli cerebro en agua y filtre estérilmente. Las soluciones madre en exceso pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius hasta que sean necesarias.

A continuación, determine el número de cultivos celulares de 96 pocillos necesarios para determinar con precisión la toxicidad del complejo polimérico. Mediante el ensayo de MTT, se deben probar al menos seis concentraciones de sulfato de condroitina y poli verde, en triplicado. Además, incluya células no tratadas y células cultivadas sin suero.

Debe incluirse medio para proporcionar una línea base de células sanas y para controlar respectivamente el arresto del crecimiento. Una vez determinado el número de pozos necesarios, sembrar 5.000 células diana en cada pozo de una placa de 96 pozos, y simultáneamente sembrar células en una placa de 24 pozos para análisis microscópico o basado en hechos de la eficiencia de transducción en cada condición experimental; dejar crecer ambas series de células durante la noche. Al día siguiente, tomar una alícuota de la solución stock de sulfato de condroitina y una alícuota de la solución stock de poli-cerebro.

Luego, diluya el virus que codifica GFP en medio sin antibiótico que contenga seis microgramos por mililitro de polibrena a una multiplicidad de infección suficiente para transducir aproximadamente del 10 al 50 % de las células diana por pocillo. Asegúrese de que haya suficiente virus diluido para cada condición de prueba más los pocillos de control en cada placa. Etiquete un conjunto de tubos con cada concentración de sulfato de condroitina y polímero verde poli que se vaya a probar.

Luego, alícuota suficiente suspensión viral para cada condición por triplicado en los tubos. A continuación, pipetee el volumen requerido de sulfato de condroitina y solución stock de poli cerebro para preparar las concentraciones de prueba en cada uno de los tubos sucesivamente. Inmediatamente después de añadir el sulfato de condroitina y el poli verde, agite ligeramente el tubo para mezclar.

Deje que las mezclas de virus, condroitín sulfato y verde de poliéster incuben a temperatura ambiente durante cinco minutos. La mezcla puede volverse turbia a medida que se forman los precipitados virales. Después de la incubación, aspire el medio de los pocillos de la placa de 96 pocillos.

A continuación, agregue la mezcla de virus, condroitín sulfato y poli verde a los pocillos según lo planeado. Asimismo, pipetee el medio control y libre de suero en los pocillos correspondientes. Repita el proceso para la placa de 24 pocillos e incube durante la noche en el incubador de cultivo de tejidos.

A continuación, aspire el medio que contiene el virus de las placas y reemplácelo con medio fresco. Devuelva las placas al incubador durante 48 horas. Después de 48 horas, retire la placa de 24 pocillos y utilice los datos para analizar la eficiencia de transducción de cada concentración de sulfato de condroitina y poli-cerebro.

Al día siguiente, aspire el medio de todos los pocillos de la placa de 96 pocillos y sustitúyalo por 100 microlitros de solución de MTT por tres horas en un incubador humedecido para permitir que el MTT se reduzca en las mitocondrias de las células metabólicamente activas. Después de tres horas, aspire la solución de MTT y sustitúyala por 200 microlitros de solución disolvente.

Incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente o hasta que todo el púrpura de MTT formado y el precipitado se disuelvan. Lea la absorbancia en un lector de microplacas a 570 nanómetros, restando la lectura de fondo a 690 nanómetros. La concentración óptima del polímero producirá el máximo aumento de la transducción determinado por hechos, con un efecto mínimo sobre la actividad metabólica determinada por MTT para hdfs.

100 microgramos por mililitro de sulfato de condroitina. Poly brain es la concentración óptima del polímero determinada mediante este método. Primero, prepare suficiente mezcla de sobrenadante vírico de poli verde con sulfato de condroitina al 100 microgramos por mililitro para transducir el número requerido de placas de 35 milímetros de células HDF que expresan el receptor SLC siete A uno. Incube la mezcla durante cinco minutos para permitir la formación de complejos poliméricos.

Luego aspire el medio de las células diana que expresan el receptor y sustitúyalo por la mezcla viral. Incube durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de retirar la mezcla viral, lave la superficie de las células dos veces con PBS para ayudar a eliminar los complejos virales. No es necesario eliminarlos por completo, ya que no se han observado efectos adversos en la salud celular por los complejos poliméricos residuales.

Esta imagen de microscopio de fluorescencia ilustra una transducción suficiente de células de sarcoma humano, que expresan establemente SLC seven A one con virus trópico al utilizar vectores de control fluorescentes para monitorear la eficiencia de transducción. La cuantificación de la fluorescencia mediante análisis de fax demuestra una eficiencia de transducción mayor al 90 %. Las tasas de transducción de HDFS suelen ser más bajas porque las células no han sido estimuladas para expresar receptores; los rendimientos de lentivirus atrópico generalmente son del 10 al 20 % del virus pseudo tipificado con VSV, medidos en S-L-C-H-S-C. El ensayo de viabilidad MTT permite la detección sensible del arresto del crecimiento en células diana, como se observa aquí, tras la transducción con virus más concentraciones de sulfato de condroitina.

Poli cerebro hasta 800 microgramos por mililitro no tiene efecto sobre el metabolismo de HDF. Análisis de fax de HDF transducidos con virus más diversas concentraciones de sulfato de condroitina. Poli verde muestra mejora de la transducción en comparación con poli verde solo.

La máxima potenciación ocurre a 100 microgramos por mililitro. El poli sulfato de condroitina cerebral es varias veces menor que los valores previamente reportados. Por lo tanto, es importante optimizar las condiciones para cualquier tipo celular dado en la formación de complejos con sulfato de condroitina.

El poli cerebro mejora el título observado, aproximadamente tres veces en S-L-C-H-S-C. En la práctica, esto produce un efecto mayor en la eficiencia de transducción a bajas concentraciones de virus que a concentraciones más altas, lo cual probablemente se debe a múltiples células transducidas y a la saturación del receptor a concentraciones elevadas de virus. La transducción con virus trópico es específica para células que expresan el receptor de retrovirus neuronal.

Al transducir células humanas no modificadas con virus trópicos, no se ha observado fluorescencia superior al fondo no reducido, como se observa mediante microscopía de análisis de fax. Los HDFS no muestran transducción en ausencia del receptor, mientras que la pretransducción con el receptor da como resultado células fluorescentes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar que el virus no transduzca células humanas modificadas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar lentivirus trópico para entregar genes potencialmente peligrosos a células humanas, incluido el uso de complejación con polímeros para mejorar la transducción.