Name: Transducción de las células humanas con polímeros complejos Lentivirus ecotropic de Mayor Seguridad de la Biotecnología (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: Aprende a transducir células humanas con lentivirus ecotrópico usando complejos de polímeros para mejorar la eficiencia. Este método seguro permite introducir oncogenes en investigación del cáncer.

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La financiación de este proyecto fue proporcionado por el Instituto de Medicina Regenerativa de California.

1. Producción, recolección y congelación de lentivirus
<ol>
	<li>Consulte al responsable de seguridad de su institución antes de comenzar este protocolo y siga sus pautas recomendadas de seguridad.</li>
	<li>Día 1. Comience con células 293T sanas y de crecimiento rápido para producir el virus. Siembre las células a una densidad de 5 x 106 
	células por placa de 10 cm. Utilice medio para células 293T sin antibióticos (DMEM de alta glucosa con 10 % de FBS y 4 mM de L-glutamina) para la producción del virus.</li>
	<li>Día 2. En la tarde, transfecte las células 293T como sigue (los valores indicados corresponden a una placa de 10 cm). 
	Deje que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Pipetee 375 μl de OptiMEM en un tubo de microcentrifugación y luego agregue 25 μl 
	de Fugene HD. No permita que el Fugene sin diluir entre en contacto con la superficie del tubo.</li>
	<li>En un tubo de microcentrifugación, mezcle:
		<ul>
			<li>5 μg de plásmido de transferencia (Slc7a1, vector diana o vector de control fluorescente)</li>
			<li>3,75 μg de plásmido de empaquetamiento (pCMV-dR8.91 o psPax2)</li>
			<li>1,25 μg de plásmido de envoltura (pMD2.G para pantrópico, pHCMV-EcoEnv para ectrópico)</li>
			<li>OptiMEM sin suero hasta completar 100 μl</li>
		</ul>
	</li>
	<li>Combine las dos mezclas y deje incubar la solución durante 20-30 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cambie el medio de las células 293T por 10 ml de medio fresco sin antibióticos. Añada la mezcla de Fugene/plásmidos gota a gota sobre la placa y deje incubar toda la noche a 37°C y 5 % de CO2.</li>
	<li>Día 3. Cambie el medio de las células 293T por 10 ml de medio fresco sin antibióticos. Tenga cuidado, 
	ya que las células 293T se adhieren débilmente y pueden desprenderse si el medio se pipetea con demasiada fuerza sobre la monocapa. Incube durante dos días en un incubador humedecido para la producción del virus.</li>
	<li>Día 5. Recolecte el virus y filtre mediante un filtro de baja unión a proteínas de 0,45 mm. Utilícelo inmediatamente o distribúyalo en alícuotas de un solo uso y congélelo a -80°C. El virus pantrópico y ectrópico congelado debe volver a titularse después de seis meses y un mes de almacenamiento, respectivamente.</li>
	<li>Titule el virus como se indica a continuación, utilizando células relativamente susceptibles a la transducción. Transduzca las células durante toda la noche con el virus de control fluorescente, empleando diluciones seriadas (por ejemplo, 1:10, 1:100, 1:1000) en medio fresco con 6 μg/ml de PB. Al día siguiente, cambie a medio fresco. Deje que las células expresen la proteína fluorescente durante dos días tras la transducción y luego determine la fracción de células transducidas mediante citometría de flujo (FACS). Calcule la titulación en unidades transformantes (TU) por ml, basándose en las diluciones que produzcan &lt; 15 % de transducción, para minimizar eventos de transducción múltiple. 
	<img src="/files/ftp_upload/2822/2822eq1.jpg" alt="Fórmula para el cálculo de la titulación, ecuación para la cuantificación viral, análisis matemático en virología." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Ecuación 1">
	</li>
</ol>
2. Transducción de células diana humanas con el receptor de retrovirus murino Slc7a1
<ol>
	<li>Seleccione una multiplicidad de infección (MOI) = 2 para asegurar que la mayoría de las células serán transducidas. Para células diana resistentes a la transducción, como los HDF, se requerirá un MOI más alto; diluimos el sobrenadante viral solo 1:2 para lograr la transducción de la mayoría de las células.</li>
	<li>Transduzca las células diana durante toda la noche con sobrenadante viral diluido en medio de cultivo fresco con 6 μg/ml de PB, lo que aumenta la transducción al mejorar la interacción electrostática entre el virus y la célula diana.1 Idealmente, se debe usar un volumen mínimo de virus, como 1 ml para una placa de 35 mm, ya que la difusión es un factor limitante en la eficiencia de transducción.</li>
	<li>Cultive las células durante al menos 48 horas después de retirar el virus antes de transducirlas con virus ecotrópico, con el fin de asegurar una expresión suficiente del receptor Slc7a1.</li>
	<li>(Opcional) Es posible usar blasticidina para seleccionar células transducidas establemente que expresan Slc7a1, si se desea. Se debe generar previamente una curva de letalidad con blasticidina para determinar la concentración efectiva más baja, generalmente entre 2 – 10 μg/ml, que elimine todas las células diana no transducidas en 7 días. Aproximadamente 2 días después de retirar el virus Slc7a1, cambie las células transducidas a medio que contenga blasticidina. Cultive las células en medio con blasticidina durante 7 días, momento en el cual todas las células restantes expresarán establemente el receptor del retrovirus y podrán ser transducidas con virus ecotrópico, así como almacenadas para uso futuro como una línea estable que expresa Slc7a1.</li>
</ol>
3. Titulación del complejo polimérico para determinar la toxicidad
<ol>
	<li>Día 1. Sembrar células a 5000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos, dejando al menos tres pocillos por cada grupo experimental. Incluir células no transducidas en medio completo para obtener un valor basal de células sanas, así como muestras compuestas por células en medio sin suero para inducir el arresto del crecimiento como control. En paralelo, sembrar células en un formato adecuado (como una placa de 24 pocillos) para el análisis microscópico o mediante FACS de la eficiencia de transducción en cada condición experimental.</li>
	<li>Día 2. Transducir las células en las placas preparadas para los análisis de MTT y FACS con virus que exprese GFP, a una MOI de 0,5 para transducir aproximadamente el 40 % de las células diana. Probar diferentes concentraciones de CS/PB (por ejemplo, 50, 100, 200, 400, 600 y 800 mg/ml de cada componente), así como 6 μg/ml de PB, para determinar las cantidades óptimas. Generar complejos poliméricos según se describe en la Parte 4, más adelante.</li>
	<li>Día 3. Eliminar el medio que contiene el virus y reemplazarlo con medio fresco. Devolver las placas a una incubadora humedecida.</li>
	<li>Día 5. Analizar la placa de FACS para determinar la eficiencia de transducción con cada concentración de polímero.</li>
	<li>Día 6. Eliminar el medio de todos los pocillos de la placa de MTT y reemplazarlo con 100 μl de solución de MTT (1 mg/ml de MTT en medio completo). Incubar durante tres horas en una incubadora humedecida para permitir que el MTT sea reducido en las mitocondrias de las células metabólicamente activas.</li>
	<li>Eliminar la solución de MTT y reemplazarla con 200 ml de disolvente de MTT (0,1 N HCl, 0,1 % Igepal CA-630 en isopropanol).</li>
	<li>Incubar durante dos horas a temperatura ambiente o hasta que todo el precipitado púrpura de formazán de MTT se haya disuelto completamente. Leer la absorbancia en un lector de microplacas a 570 nm, restando la lectura de fondo a 690 nm.</li>
	<li>Seleccionar la concentración óptima de polímero que produzca el máximo aumento en la transducción, según lo determinado por FACS, con el menor efecto sobre la actividad metabólica, según lo determinado por el ensayo de MTT. Para las HDF, seleccionamos 100 μg/ml de CS/PB basándonos en los datos mostrados en los Resultados Representativos, más adelante.</li>
</ol>
4. Transducción ecotrópica con complejación polimérica
<ol>
	<li>Prepare soluciones stock de PB y sulfato de condroitina filtradas estérilmente a 20 mg/ml en agua. Aliquotee y almacene a -20°C.</li>
	<li>Transfiera por pipeta el sobrenadante vírico a un tubo de microcentrifugación y dilúyalo hasta la concentración final deseada (por ejemplo, MOI de 2) con medio de cultivo fresco. Añada volúmenes iguales de PB y sulfato de condroitina (concentraciones determinadas en el paso 3 anterior) sucesivamente, agitando ligeramente el tubo para mezclar tras cada adición. La mezcla vírica se volverá inmediatamente turbia a medida que se formen precipitados. Incube la mezcla vírica a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir la formación del complejo.</li>
	<li>Retire el medio de las células diana que expresan el receptor, sustitúyalo por la mezcla vírica e incube durante la noche a 37°C, 5% CO2. Tras retirar la mezcla vírica, lave la superficie de las células dos veces con PBS para ayudar a eliminar los complejos víricos. No es necesario eliminarlos por completo; no hemos observado efectos adversos en la salud celular debidos a complejos poliméricos residuales.</li>
</ol>
5. Verificación de la especificidad de la transducción ecótrofica
<ol>
	<li>Al producir por primera vez un virus ecotrópico, es prudente, desde una perspectiva de seguridad, verificar que el virus no pueda transducir células humanas no modificadas. Transduzca células humanas con lentivirus ecotrópico a una concentración relativamente alta (solo una dilución de 1 a 2 veces del sobrenadante viral en medio fresco) durante toda la noche con 6 μg/ml PB o la concentración óptima de CS/PB.</li>
	<li>Retire el medio que contiene el virus y sustitúyalo por medio fresco. Después de incubar las células durante 2 días, valide la expresión del transgén mediante citometría de flujo (FACS) utilizando vectores fluorescentes y/o mediante RT-PCR con cebadores específicos para el transgén.</li>
</ol>
6. Resultados representativos:
La figura 1A muestra el proceso de producción de lentivirus, y la figura 1B muestra la transducción de células humanas con lentivirus ecotrópico, incluyendo la pretransducción con el receptor de retrovirus murino Slc7a1. Para la titulación del virus, utilizamos una línea celular de rabdomiosarcoma humano transducida establemente con Slc7a1 (Slc-hRMS). Al utilizar vectores de control fluorescentes para monitorear la eficiencia de transducción, habitualmente alcanzamos una eficiencia de transducción > 90% en Slc-hRMS con virus ecotrópico, como se muestra en las figuras 2A y 2B. Las tasas de transducción de HDFs son generalmente más bajas porque las células no han sido seleccionadas con blasticidina para la expresión del receptor (figura 2C). Los títulos de lentivirus ecotrópico son generalmente del 10-20% de los del virus pseudotipado con VSV cuando se miden en Slc-hRMS (figura 2D).
Un ciclo de congelación-descongelación reduce el título del virus ecotrópico en un 16 - 3%, lo que equivale a la pérdida de título durante un único ciclo de congelación-descongelación del virus pseudotipado con VSV (p &gt; 0,05). Contrariamente a informes previos,2 no observamos ningún efecto positivo en el título vírico al congelar rápidamente en hielo seco. Más bien, obtenemos títulos posteriores a la descongelación más altos para cualquiera de los pseudotipos simplemente colocando los tubos del virus en un congelador a -80°C (datos no mostrados).
El ensayo de viabilidad con MTT permite la detección sensible de la detención del crecimiento en células diana. La transducción con virus más concentraciones de CS/PB hasta 800 μg/ml no tiene efecto sobre el metabolismo de los HDF (Fig. 3A). La exposición a CS/PB sin virus tampoco tiene efecto tóxico sobre las células (datos no mostrados). El análisis por FACS de HDF transducidos con virus y diversas concentraciones de CS/PB muestra una mejora en la transducción en comparación con PB solo (Fig. 3B). La máxima mejora ocurre a 100 μg/ml de CS/PB (Fig. 3C), varias veces menor que los valores previamente reportados.3 Por lo tanto, es importante optimizar las condiciones para cualquier tipo celular diana.
La complejación con CS/PB mejora aproximadamente 3 veces el título observado en Slc-hRMS (Fig. 4A, p &lt; 0,01). En la práctica, esto produce un efecto mayor en la eficiencia de transducción a bajas concentraciones de virus que a concentraciones más altas (Fig. 4B), lo cual probablemente se deba a células transducidas múltiples veces y a la saturación de receptores a concentraciones elevadas de virus.
La transducción con virus ectrópico es específica para células que expresan el receptor de retrovirus murino. Al transducir células humanas no modificadas con virus ectrópico, no hemos observado fluorescencia mayor que el fondo de no transducción, ya sea utilizando PB o CS/PB, como se muestra en la Figura 5A. Microscópicamente, los HDF no muestran transducción en ausencia del receptor (Figura 5B), mientras que la pretransducción con el receptor da como resultado células fluorescentes (Figura 5C).
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig1.jpg" alt="Diagrama del proceso de producción de lentivirus, que muestra la transducción de células 293T y las etapas del sobrenadante viral." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1. Vista esquemática de (A) el proceso de producción del virus y (B) la transducción de células humanas con receptor retroviral murino seguida por lentivirus ecotrópico.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig2.jpg" alt="Gráficos de citometría de flujo, análisis del porcentaje de células GFP+, microscopía de fluorescencia, gráfico de barras de titulación viral." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Transducción de alta eficiencia de células humanas con lentivirus ecotrópico que codifica para GFP. Las células fueron previamente transducidas con el receptor de retrovirus murino Slc7a1. (A) Línea celular de rabdomiosarcoma humano seleccionada con blasticidina para Slc7a1 (Slc-hRMS), transducida (azul) o no transducida (rosa) con GFP. (B) Microfotografía fluorescente de Slc-hRMS transducidas con lentivirus ecotrópico (4X). (C) HDFs transducidas (azul) y no transducidas (rosa) con lentivirus ecotrópico GFP; las células fueron transducidas con Slc7a1 dos días antes de la transducción ecotrópica. (D) Título del lentivirus pseudotipado con VSV-G y del lentivirus ecotrópico, medido en Slc-hRMS.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig3.jpg" alt="Efectos de la concentración de polímero en la expresión de GFP; gráficos de absorbancia, citometría de flujo y porcentaje de GFP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Optimización de las concentraciones de sulfato de condroitina/polibreno (CS/PB) en fibroblastos dérmicos humanos. (A) Viabilidad de los HDF evaluada mediante el ensayo MTT después de la transducción en presencia de PB solo o con diferentes concentraciones de CS/PB. (B) Mejora de la eficiencia de transducción en los HDF mediante distintas concentraciones de CS/PB, medida por citometría de flujo (FACS). (C) Cuantificación del aumento en la transducción, que muestra que la transducción máxima ocurre con 100 μg/ml de CS/PB.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig4.jpg" alt="Eficiencia de transducción génica frente a análisis de título, gráfico de barras y gráfico de dispersión, comparación del efecto de polibreno." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4. Efecto de 400 μg/ml CS/PB en la transducción de Slc-hRMS con lentivirus ecotrópico. (A) Mejora del título, y (B) cambio en la tasa de transducción en comparación con 6 μg/ml de polibreno solo.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig5.jpg" alt="Gráfico de intensidad de GFP por citometría de flujo con imágenes de microscopía de fluorescencia que muestran la distribución de células GFP+" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 5"> 
Figura 5. Ausencia de transducción ecotrópica de HDF en ausencia del receptor de retrovirus murino Slc7a1. (A) Gráfico de citometría de flujo de fibroblastos humanos BJ, no transducidos (rosado) o transducidos (azul) con lentivirus GFP ecotrópico, en ambos casos en ausencia del receptor Slc7a1. Fibroblastos humanos BJ transducidos con lentivirus GFP ecotrópico, sin (B) y con (C) pre-transducción con el receptor Slc7a1 (4X).

<ol><li>Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charged+polymers+modulate+retrovirus+transduction+via+membrane+charge+neutralization+and+virus+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation.</a> Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).</li>
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<li>Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+tropism+of+lentiviral+vectors+through+pseudotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping.</a> Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).</li>
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<li>Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> J Virol. 72, 9873-9880 (1998).</li>
</ol>

Recombinante gammaretrovirus ecotropic basado en el virus de la leucemia murina Moloney (MLV) y su receptor mSlc7a1 están bien estudiadas y ampliamente disponible, después de haber sido utilizado por más de 20 años para ofrecer los transgenes en las células murinas. Gammaretrovirus ecotropic también se ha utilizado más recientemente para ofrecer oncogenes a las células humanas;. En el marco de la reprogramación celular, el uso de mSlc7a1 para evitar la generación de virus anfotrópico albergar oncogenes humanos está bien establecida 4,5 Sin embargo, lentivirus ofrece ventajas significativas sobre gammaretrovirus en la transducción de las poblaciones de células refractarias, 6 incluidas las células primarias que a menudo son objetivos deseables para la reprogramación, ya que el lentiviral pre-integración compleja permite la transducción de la no división de las células 7. Los lentivirus se han producido decenas de pseudotipos diferentes, incluyendo MLV, en un esfuerzo por alterar el tropismo del virus, la toxicidad y otras propiedades. 8-MLV pseudotyped lentivirus ecotropic se ha utilizado para la transducción de células de ratón, 9, pero rara vez se ha utilizado en las células humanas 10. Por tanto, proponemos el uso de MLV pseudotyped lentivirus ecotropic como un vehículo seguro, rentable y altamente eficiente para entregar oncogenes conocidos o sospechosos, incluyendo factores de reprogramación celular, las células humanas. Es importante notar que este protocolo no se elimina totalmente la necesidad de producir y utilizar lentivirus pantropic, sino que este protocolo se separa del oncogén (s) del virus de la pantropic, el aislamiento de los investigadores del potencial de auto-inoculación con virus relacionados con el cáncer. El mSlc7a1 proteína y su homólogo humano hSlc7a1 se expresó doquier transportadores de aminoácidos sin tumorigenicidad conocido o capacidad de conferir una ventaja selectiva de crecimiento de las células receptoras, 11 mSlc7a1 realización de un riesgo relativamente bajo para su incorporación en anfotrópico virus. Este paso adicional puede ser especialmente útil en los laboratorios carecen de virus dedicados o instalaciones de cultivo de tejidos del nivel de bioseguridad necesarias. En algunas situaciones puede ser posible eliminar por completo el uso de virus pantropic mediante la transferencia de la Slc7a1 plásmido directamente en las células diana, sin embargo, muchas células que sería útil para los objetivos de esta técnica también son refractarios a la transfección. Como alternativa, la posibilidad de aislar Slc7a1-células transducidas por la selección blasticidin significa que VSV-G lentivirus pseudotyped puede ser usado una vez para generar una acción de los receptores de las células que expresan, tras lo cual puede ser el virus de ecotropic utilizarse de forma rutinaria para la transducción de estas células para muchos experimentos. Los investigadores siempre deben seguir las directrices de seguridad institucional para trabajar con cualquier lentivirus, independientemente de su tropismo. Los títulos de virus ecotropic logra con este protocolo son ligeramente inferior a la VSV-pseudotyped virus, por lo general el 10-20% de los títulos de virus pantropic, de acuerdo con estudios anteriores. 9 Estos títulos se midieron en las células humanas establemente transducidas con Slc7a1, por lo que el menor título observado para el virus de ecotropic puede deberse en parte a la expresión variadas del gen del receptor en las células diana. Sin embargo, los títulos virales obtenidos en nuestro protocolo es más que suficiente para la mayoría de las aplicaciones y llevar a la transducción de la mayoría de las células, en algunos casos&gt; 90% de las células. Basado en las técnicas de centrifugación se utilizan para concentrar las partículas virales. Sin embargo, la centrifugación requiere varias horas, genera aerosoles infecciosos, y puede resultar en una pérdida significativa de partículas virales. 12 Como alternativa, la formación de complejos con CS / PB se pueden utilizar para mejorar la transducción, sin alterar el tropismo viral. 3 Este método es rápido (5 minutos ) y de bajo costo ($ 0,03 por el virus de 10 ml), mientras que aproximadamente el triple del título observado. Ningún equipo especial o de los reactivos de esta naturaleza se requiere, y se observó toxicidad aguda mínima después de la exposición de HDFs a CS / PB, de acuerdo con trabajos previos en otras líneas celulares. 13 Un posible inconveniente de este protocolo es que algunos de los complejos polímero visibles al microscopio se adhieren a las células durante varios días en la cultura. No podemos descartar la posibilidad de que estos complejos, aunque no visiblemente tóxicas para las células, pueden tener efectos más sutiles en los procesos celulares. Aquí hemos descrito una metodología para la seguridad y eficiencia de transducción de células humanas con factores oncogénicos. Este enfoque debe ser de gran utilidad para los investigadores que estudian los oncogenes y la biología de células madre, incluyendo las células iPS.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> pLenti6/UbC/mSlc7a1 </td><td> Addgene </td><td> 17224 </td><td> Murino receptor MLV </td></tr><tr><td> pMD2.G </td><td> Addgene </td><td> 12259 </td><td> VSV-G sobre </td></tr><tr><td> pCMV-dR8.91 </td><td> D. Trono de laboratorio 14 </td><td></td><td> Embalaje plásmido (plásmido psPax2 equivalente está disponible en Addgene, cat. Número 12.260) </td></tr><tr><td> pHCMV-EcoEnv </td><td> Addgene </td><td> 15802 </td><td> Sobre ecotropic </td></tr><tr><td> FUGW </td><td> Addgene </td><td> 14883 </td><td> GFP plásmido de control </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche </td><td> 04 709 705 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hexadimetrina bromuro (Polybrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td><td></td></tr><tr><td> El sulfato de condroitina sal sódica del cartílago de tiburón </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4384 </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Pescador </td><td> BP 2647100 </td><td></td></tr><tr><td> Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio (MTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2128 </td><td></td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I3021 </td><td></td></tr></tbody></table>

transducción de las células humanas con polímeros complejos lentivirus ecotropic de mayor seguridad de la biotecnología

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Madre y el tumor de estudios de la biología celular a menudo requieren la transducción viral de las células humanas con oncogenes conocidos o sospechosos, que planteaba cuestiones importantes de seguridad para el personal de laboratorio. Lentivirus Pantropic, tales como el uso común VSV-G pseudotipo, son una herramienta valiosa para estudiar la función génica, ya que pueden transducir muchos tipos de células, incluyendo las células no se dividen. Sin embargo, los investigadores desean evitar la producción y la centrifugación de los virus pantropic codificación oncogenes debido a los mayores requerimientos de manejo de nivel de bioseguridad y seguridad. Varios oncogenes potentes, incluyendo c-Myc y SV40 antígeno T grande, son conocidos por aumentar la producción de células madre pluripotentes inducidas (IPSC). Todas las otras iPSC que induce cambios genéticos (Oct4, Sox2, Klf4, NANOG, LIN28, y la pérdida de la función de p53) también tienen enlaces con el cáncer, lo que los problemas de seguridad relativamente alto, así. Aunque estos virus relacionados con el cáncer son útiles en el estudio de la reprogramación celular y pluripotencia, deben utilizarse de manera segura. Para abordar estas cuestiones de bioseguridad, se demuestra un método para la transducción de células humanas con lentivirus ecotropic, con énfasis adicional en el costo reducido y fácil manejo. Hemos producido lentivirus ecotropic con título suficientemente alto como para la transducción de más del 90% de los receptores de las células que expresan humanos expuestos al virus, la validación de la eficacia de este enfoque. Lentivirus se concentra a menudo por ultracentrifugación, sin embargo, este proceso dura varias horas y puede producir aerosoles infecciosos para la salud humana de los investigadores biomédicos. Como una alternativa de partículas, viral puede ser más segura sedimentado en las células por la formación de complejos con sulfato de condroitina y polibreno (CS / PB). Esta técnica aumenta el título viral funcional hasta 3 veces en células que expresan establemente receptores retrovirus murino, con el tiempo añadido y el coste insignificante. Transducción de los fibroblastos dérmicos humanos (HDFs) es la máxima mejorada utilizando CS / PB concentraciones aproximadamente cuatro veces menor que el valor óptimo se ha informado de líneas celulares de cáncer, lo que sugiere que la concentración de polímero se debe ajustar para el tipo de célula diana de interés. Por lo tanto, describen el uso de methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio (MTT) para el ensayo de toxicidad de polímero en un nuevo tipo de células. Se observa la viabilidad equivalente de HDFs después de la transducción viral utilizando complejos polímero o la dosis estándar de polibreno (PB, 6 mg / ml), lo que indica un mínimo de toxicidad aguda. En este protocolo, se describe el uso de lentivirus ecotropic para la sobreexpresión de los oncogenes en las células humanas, lo que reduce los riesgos de bioseguridad y el aumento de la tasa de transducción. También demostrar el uso de complejos de polímeros para mejorar la transducción, evitando la formación de aerosoles centrifugación de las partículas virales.

Los lentivirus son una valiosa herramienta de investigación para explorar la función del gen, sin embargo, los investigadores desean evitar la producción de la codificación de lentivirus pantropic conocidos o sospechosos oncogenes. Como alternativa, se presenta un protocolo más seguro para el uso de lentivirus ecotropic en las células humanas modificadas para expresar el receptor mSlc7a1 ecotropic.

Transducción de las células humanas con polímeros complejos Lentivirus ecotropic de Mayor Seguridad de la Biotecnología

Los estudios de biología de células madre y células tumorales a menudo requieren la transducción viral de células humanas con oncogenes conocidos o sospechosos, lo que plantea importantes problemas de seguridad para...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en introducir oncogenes u otros genes potencialmente peligrosos en células humanas mediante un lentivirus ecotrópico. Esto se logra produciendo un lentivirus pantrópico que codifica el receptor del retrovirus murino, así como un lentivirus ecotrópico que codifica el gen de interés. Las células son transducidas con el receptor del retrovirus murino, lo que las hace susceptibles a la transducción con el virus ecotrópico. A continuación, las células se transducen con el virus ecotrópico para introducir el oncogén, utilizando complejación polimérica con poli-cerebro y sulfato de condroitina para mejorar los resultados de transducción. Los resultados obtenidos muestran una transducción selectiva de células humanas con lentivirus ecotrópico, basada en microscopía fluorescente y análisis de hechos.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la transducción con retrovirus gamma, es que las partículas lentivirales pueden transducir de manera más eficaz muchos tipos celulares, incluidas las células no divididas, como las células madre. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer y de las células madre, como comprender la función de posibles oncogenes. Antes de comenzar este procedimiento, consulte al responsable de seguridad de su institución y siga las directrices de seguridad recomendadas.Comience con un cultivo de células 293T sanas y de crecimiento rápido, trabajando en una cabina de cultivo de tejidos. Bajo condiciones asépticas, re suspenda cinco veces 10 a la 6 células 293T en 10 mililitros de medio para 293T sin antibiótico. Pipetee la suspensión celular en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros e incube la placa durante la noche en un incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Al día siguiente, inicie la transfección en la tarde. Primero, recoja una alícuota de Optum y de los plásmidos de transferencia, empaquetamiento y envoltura, y permita que estos se calienten a temperatura ambiente. Pipete 375 microlitros de Optimum en un tubo microcentrífugo y luego agregue 25 microlitros del reactivo de transfección FU gene HD. Asegúrese de que el reactivo FU gene se pipete directamente en el medio y no toque las paredes del tubo.A continuación, en un segundo tubo de microcentrífuga, combine cinco microgramos del plásmido de transferencia, 3,75 microgramos del plásmido de empaquetamiento y 1,25 microgramos del plásmido de envoltura en la cantidad necesaria de OptiMEM para alcanzar un volumen de 100 microlitros. Luego, añada la mezcla de OptiMEM al tubo que contiene la mezcla de plásmidos e incube a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Durante los últimos minutos de la incubación, aspire muy suavemente el medio de la placa que contiene las células 293T y sustitúyalo con 10 mililitros de medio fresco para 293T sin antibiótico.Finalmente, agregue gota a gota la mezcla de plásmidos del gen FU al medio de la placa de 10 centímetros. Coloque la placa en un incubador de cultivo celular ajustado a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, e incube durante la noche. Al día siguiente, aspire muy suavemente el medio de la placa y sustitúyalo por medio 2 9 3 T fresco sin antibiótico.Luego, coloque nuevamente la placa en el incubador de cultivo de tejidos e incube durante dos días más. Tres días después de la transfección, aspire el medio que contiene el virus de la placa y filtre utilizando un filtro de baja unión a proteínas de 0,45 micrones. Después de filtrar el virus, realice diluciones seriadas de un virus control fluorescente en medio fresco sin antibióticos con seis microgramos por mililitro de polibrena, y utilice estas diluciones para transducir células de la línea celular adecuada. Al día siguiente, en una placa de 24 pocillos, cambie el medio por medio fresco sin antibióticos y continúe la incubación durante otros dos días para permitir que las células expresen la proteína fluorescente.Utilice datos empíricos para determinar la fracción de células transducidas para cada dilución viral. Luego, calcule el título en unidades transformantes por mililitro basándose en las diluciones que produzcan menos del 15 % de transducción, con el fin de minimizar los eventos de transducción múltiple. Se presume que los títulos de otros lentivirus no fluorescentes producidos en paralelo son similares al del virus fluorescente.Para transducir células diana, comience por seleccionar una multiplicidad de infección mayor a dos para asegurar que la mayoría de las células serán transducidas. Primero, diluya el sobrenadante viral hasta la multiplicidad de infección requerida en medio de cultivo completo fresco, suplementado con seis microgramos por mililitro de polibreno hasta un volumen final de un mililitro.Aspire el medio de un platillo de 35 milímetros de células diana y agregue un mililitro de sobrenadante viral diluido. Incube en el incubador de cultivo de tejidos durante 24 a 48 horas para permitir una expresión suficiente del receptor SLC7A1 si se desea. Utilice selección con antibiótico blasticidina para seleccionar células transducidas establemente que expresen SLC7A1 según las instrucciones del procedimiento escrito.Para comenzar la determinación de toxicidad, prepare una solución madre de 20 miligramos por mililitro de sulfato de condroitina y una solución madre de 20 miligramos por mililitro de poli cerebro en agua y filtre estérilmente. Las soluciones madre en exceso pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius hasta que sean necesarias.A continuación, determine el número de cultivos celulares de 96 pocillos necesarios para determinar con precisión la toxicidad del complejo polimérico. Mediante el ensayo de MTT, se deben probar al menos seis concentraciones de sulfato de condroitina y poli verde, en triplicado. Además, incluya células no tratadas y células cultivadas sin suero.Debe incluirse medio para proporcionar una línea base de células sanas y para controlar respectivamente el arresto del crecimiento. Una vez determinado el número de pozos necesarios, sembrar 5.000 células diana en cada pozo de una placa de 96 pozos, y simultáneamente sembrar células en una placa de 24 pozos para análisis microscópico o basado en hechos de la eficiencia de transducción en cada condición experimental; dejar crecer ambas series de células durante la noche. Al día siguiente, tomar una alícuota de la solución stock de sulfato de condroitina y una alícuota de la solución stock de poli-cerebro.Luego, diluya el virus que codifica GFP en medio sin antibiótico que contenga seis microgramos por mililitro de polibrena a una multiplicidad de infección suficiente para transducir aproximadamente del 10 al 50 % de las células diana por pocillo. Asegúrese de que haya suficiente virus diluido para cada condición de prueba más los pocillos de control en cada placa. Etiquete un conjunto de tubos con cada concentración de sulfato de condroitina y polímero verde poli que se vaya a probar.Luego, alícuota suficiente suspensión viral para cada condición por triplicado en los tubos. A continuación, pipetee el volumen requerido de sulfato de condroitina y solución stock de poli cerebro para preparar las concentraciones de prueba en cada uno de los tubos sucesivamente. Inmediatamente después de añadir el sulfato de condroitina y el poli verde, agite ligeramente el tubo para mezclar.Deje que las mezclas de virus, condroitín sulfato y verde de poliéster incuben a temperatura ambiente durante cinco minutos. La mezcla puede volverse turbia a medida que se forman los precipitados virales. Después de la incubación, aspire el medio de los pocillos de la placa de 96 pocillos.A continuación, agregue la mezcla de virus, condroitín sulfato y poli verde a los pocillos según lo planeado. Asimismo, pipetee el medio control y libre de suero en los pocillos correspondientes. Repita el proceso para la placa de 24 pocillos e incube durante la noche en el incubador de cultivo de tejidos.A continuación, aspire el medio que contiene el virus de las placas y reemplácelo con medio fresco. Devuelva las placas al incubador durante 48 horas. Después de 48 horas, retire la placa de 24 pocillos y utilice los datos para analizar la eficiencia de transducción de cada concentración de sulfato de condroitina y poli-cerebro.Al día siguiente, aspire el medio de todos los pocillos de la placa de 96 pocillos y sustitúyalo por 100 microlitros de solución de MTT por tres horas en un incubador humedecido para permitir que el MTT se reduzca en las mitocondrias de las células metabólicamente activas. Después de tres horas, aspire la solución de MTT y sustitúyala por 200 microlitros de solución disolvente.Incube la placa durante dos horas a temperatura ambiente o hasta que todo el púrpura de MTT formado y el precipitado se disuelvan. Lea la absorbancia en un lector de microplacas a 570 nanómetros, restando la lectura de fondo a 690 nanómetros. La concentración óptima del polímero producirá el máximo aumento de la transducción determinado por hechos, con un efecto mínimo sobre la actividad metabólica determinada por MTT para hdfs.100 microgramos por mililitro de sulfato de condroitina. Poly brain es la concentración óptima del polímero determinada mediante este método. Primero, prepare suficiente mezcla de sobrenadante vírico de poli verde con sulfato de condroitina al 100 microgramos por mililitro para transducir el número requerido de placas de 35 milímetros de células HDF que expresan el receptor SLC siete A uno. Incube la mezcla durante cinco minutos para permitir la formación de complejos poliméricos.Luego aspire el medio de las células diana que expresan el receptor y sustitúyalo por la mezcla viral. Incube durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de retirar la mezcla viral, lave la superficie de las células dos veces con PBS para ayudar a eliminar los complejos virales. No es necesario eliminarlos por completo, ya que no se han observado efectos adversos en la salud celular por los complejos poliméricos residuales.Esta imagen de microscopio de fluorescencia ilustra una transducción suficiente de células de sarcoma humano, que expresan establemente SLC seven A one con virus trópico al utilizar vectores de control fluorescentes para monitorear la eficiencia de transducción. La cuantificación de la fluorescencia mediante análisis de fax demuestra una eficiencia de transducción mayor al 90 %. Las tasas de transducción de HDFS suelen ser más bajas porque las células no han sido estimuladas para expresar receptores; los rendimientos de lentivirus atrópico generalmente son del 10 al 20 % del virus pseudo tipificado con VSV, medidos en S-L-C-H-S-C. El ensayo de viabilidad MTT permite la detección sensible del arresto del crecimiento en células diana, como se observa aquí, tras la transducción con virus más concentraciones de sulfato de condroitina.Poli cerebro hasta 800 microgramos por mililitro no tiene efecto sobre el metabolismo de HDF. Análisis de fax de HDF transducidos con virus más diversas concentraciones de sulfato de condroitina. Poli verde muestra mejora de la transducción en comparación con poli verde solo.La máxima potenciación ocurre a 100 microgramos por mililitro. El poli sulfato de condroitina cerebral es varias veces menor que los valores previamente reportados. Por lo tanto, es importante optimizar las condiciones para cualquier tipo celular dado en la formación de complejos con sulfato de condroitina.El poli cerebro mejora el título observado, aproximadamente tres veces en S-L-C-H-S-C. En la práctica, esto produce un efecto mayor en la eficiencia de transducción a bajas concentraciones de virus que a concentraciones más altas, lo cual probablemente se debe a múltiples células transducidas y a la saturación del receptor a concentraciones elevadas de virus. La transducción con virus trópico es específica para células que expresan el receptor de retrovirus neuronal.Al transducir células humanas no modificadas con virus trópicos, no se ha observado fluorescencia superior al fondo no reducido, como se observa mediante microscopía de análisis de fax. Los HDFS no muestran transducción en ausencia del receptor, mientras que la pretransducción con el receptor da como resultado células fluorescentes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar que el virus no transduzca células humanas modificadas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar lentivirus trópico para entregar genes potencialmente peligrosos a células humanas, incluido el uso de complejación con polímeros para mejorar la transducción.

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Investigación

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Biología

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Reprogramación intratable in vivo de células tumorales a células dendríticas convencionales tipo 1

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Visualización y análisis cuantitativo de la activación de PARP1/PARP2 inducida por genotoxinas en células utilizando un reportero basado en proteínas de fusión fluorescentes

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Transducción de las células humanas con polímeros complejos Lentivirus ecotropic de Mayor Seguridad de la Biotecnología

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