Name: Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a evaluar el desarrollo y la función de la glándula mamaria en modelos de ratón mediante disección, tinción y ensayos de contracción con oxitocina. Este método permite analizar la morfología glandular y la eyección de leche.

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Estos estudios fueron financiados por CIHR y becas CBCRA a DWL. IP fue financiado por becas de CIHR-STP, FRSQ y CIHR. MKGS fue financiado por becas OGS y CIHR STP. Los autores agradecen a Kevin Barr por su ayuda con la cría de ratón.

1. Disección de la glándula mamaria <ol><li> Practicar la eutanasia con el ratón usando inhalación de CO 2. Evitar la dislocación cervical, si es posible, ya que puede dañar los vasos sanguíneos importantes en el cuello y el resultado de la acumulación de sangre alrededor de las glándulas mamarias, lo que hace la disección más difícil. Sin embargo, si otros criterios que se evaluarán en el mismo ratón, tales como los niveles de oxitocina, métodos alternativos de la eutanasia puede ser necesaria, aunque esto debe ser evaluado por su IACUC. </li><li> En una espuma de poliestireno envueltos en papel de aluminio, colocar el ratón sobre la espalda y la propagación de las cuatro extremidades. Pin firmemente las cuatro extremidades con 16 a 20 agujas de calibre (fig. 1A). </li><li> Rocíe el ratón generosamente con etanol al 70%. </li><li> El uso de pinzas, tire de la piel del abdomen en la línea media y hacer una pequeña incisión con tijeras afiladas. </li><li> A partir de la incisión, corte la piel hasta el cuello del animal y evitar la punción de la cavidad abdominal o torácica (fig. 1B). </li><li> Cortar la piel de las patas delanteras de la incisión de línea media, lo que resulta en una "forma de Y" (fig. 1B). Cortar la piel de las extremidades traseras de la misma manera (fig. 1B). </li><li> El uso de pinzas hemostáticas, pelar suavemente la piel abdominal y torácica en el lado del ratón. Si es necesario, con suavidad cortar el tejido conjuntivo. </li><li> Fijar la piel a la espuma de poliestireno con 16 a 20 agujas de calibre, la exposición de las glándulas mamarias adjunta a la parte inferior de la piel. Continuar y completar un lado a la vez (fig. 1C). </li><li> Con unas pinzas, levante suavemente la glándula mamaria de interés y reducir entre la glándula y la piel con pequeñas tijeras afiladas, a partir desde el exterior hacia la espina dorsal del animal. Asegúrese de que cortar cuidadosamente, de modo que ningún pedazo de la piel o los músculos permanecen en la glándula. Todas las glándulas mamarias (Figura 1) se pueden eliminar con este protocolo, pero abdominal glándulas mamarias (# 4) son los mejores para el montaje de todo. La 2 ª y 3 ª glándulas tener algunos músculos interdigitados y aunque se puede utilizar para montar todo y la histología, que podría no ser apropiado para todos los análisis. </li></ol> 2. Todo el montaje <ol><li> Al menos un día antes de la disección, preparar una solución de carmín alumbre por disolución de 1 g de carmín y 2,5 g de sulfato de aluminio y potasio en 500 ml de agua destilada y hervir durante 20 minutos en un matraz Erlenmeyer de 1 litro. Ajustar el volumen final de 500 ml con agua. Filtrar a través de un papel Whatman y añadir una pequeña cantidad de timol (algunos granos) como conservante. Refrigerar. Después de la tinción, solución de carmín alumbre puede ser vertida de nuevo a la botella de valores y reutilizar muchas veces durante varias semanas. Prepare una solución fresca cuando el color se debilita. </li><li> Después de extirpar la glándula mamaria del ratón (paso 1), se extendió directamente en un portaobjetos de vidrio. Tratar de aplanar la medida de lo posible, conservando el original en la forma in situ. La glándula se pega en la diapositiva muy bien cuando bien tirante. </li><li> Fijar la glándula por inmersión, en la diapositiva, en el fijador de Carnoy (EtOH al 100%, cloroformo, ácido acético glacial, 06:03:01) durante 4 horas en la campana de extracción a temperatura ambiente en un frasco. Tenga en cuenta que otros han utilizado dos horas, que parece ser suficiente. Por otra parte, las glándulas también puede ser fijado a 4 ° C durante la noche. </li><li> De lavado en etanol al 70% durante 15 min. Luego, poco a poco rehidratar con agua mediante la eliminación de la mitad de la solución de etanol a partir de la jarra y su sustitución por ddH 2 O. Incubar durante 5 min. Repetir 3 veces. Por otra parte, el uso del 70% - 35% - 15% - baños de etanol y agua durante 5 minutos cada uno. </li><li> Enjuague con agua destilada durante 5 minutos. </li><li> Mancha de carmín alumbre en la noche a temperatura ambiente. Cabe señalar que la tinción puede tomar más tiempo, dependiendo del grosor de la glándula. </li><li> Quitar manchas de carmín alumbre a la reutilización y poco a poco se deshidratan tejidos teñidos a través de baños de etanol de serie (50%, 70%, 95%, 100%) durante 5 minutos cada uno y aclarar en xileno, o en una alternativa no tóxica, como Histo-claro, durante la noche. Tanto la deshidratación y la limpieza también se puede requerir más tiempo incubaciones con muestras más gruesas. </li><li> Glándula mamaria sumergirse en salicilato de metilo. Las glándulas mamarias se puede mantener en salicilato de metilo en una campana de extracción hasta que las imágenes están listas para tomar. </li><li> Las imágenes pueden ser tomadas en una campana de humos con una cámara normal digital, colocada en un trípode (uso de "macro" función de si está disponible), mediante la colocación de las diapositivas en una mesa de luz. Utilizar un microscopio de disección de un aumento mayor. Por otra parte, las glándulas mamarias se puede montar en los medios de comunicación como Permount (después del paso 2.7) que permite imágenes que deben tomarse fuera una campana para sustancias químicas en cualquier plataforma de imágenes proporciona las monturas son lo suficientemente delgada. </li><li> Con el fin de cuantificar el desarrollo de la glándula mamaria con montaje en general, medidas tales como el número de ramificaciones (o ramas laterales) a lo largo de porciones de los conductos, la longitud de los conductos principales, o sea una proporción de células epiteliales a la zona de tejido adiposo podrían ser evaluados. Finalmente, después de documentación fotográficación, montaje de toda la glándula mamaria puede ser embebido en parafina para el corte y tinción histológica convencional. </li></ol> 3. Inducidas por la oxitocina de eyección de leche <ol><li> Separar las crías de la madre justo después de que han sido alimentados. Espere una hora antes de realizar el ensayo. </li><li> Sacrificio de la madre y exponer las glándulas mamarias como se describió anteriormente (pasos 1,1 a 1,8), sin necesidad de sacarlos de los animales. </li><li> Iniciar el ensayo de caída uniformemente PBS o la solución de oxitocina directamente en la glándula mamaria de interés, utilizando una pipeta de transferencia. Un amplio espectro de dosis se puede utilizar; ~ 8 pg / ml (dosis fisiológicas) se utiliza normalmente. Sin embargo, la alta dosis no fisiológica (hasta 1 mg / ml) se puede utilizar para garantizar la ausencia de respuesta en modelos de ratón modificados genéticamente. Para este procedimiento, se recomienda el uso de tórax (# 2-3) glándulas, utilizando un lado como un control (en contacto con PBS) y el otro lado para poner a prueba la eyección de leche (la exposición de oxitocina). </li><li> Incubar durante 1 minuto y retirar la solución cuidadosamente aspiración con una pipeta de transferencia. Entrada de la leche en los conductos se puede controlar mediante la grabación de cintas de vídeo, o por la toma de imágenes antes y después de la exposición PBS o la oxitocina. </li></ol> 4. Los resultados representativos: En un montaje de todo bien, la glándula mamaria está bien extendido y epitelio de los conductos son fácilmente observables (Figura 2A). Si la glándula no es muy extendido, que puede levantar en parte o totalmente de la diapositiva cuando se coloca en la solución fijadora. La glándula se convertirá en duro e inutilizable (Figura 2B). Del mismo modo, si la glándula no está bien diseccionado, ya sea una parte del epitelio pueden estar ausentes (Figura 2C) o resto de las partes de la piel o el músculo abdominal puede interferir con el análisis de la glándula (Figura 2). Para el ensayo de la oxitocina, es importante separar las crías lactantes de la presa por la misma cantidad de tiempo en cada ocasión. De esta manera, usted se asegurará de que ninguna leche o pequeñas cantidades de leche está presente en los conductos antes de la exposición de oxitocina, pero también que suficiente leche está presente en los alvéolos que se puede expulsar a los conductos por las contracciones mioepiteliales (Figura 3) . Si los cachorros se retiran demasiado pronto, la leche puede acumularse en los alvéolos y en los conductos de la representación del efecto de la oxitocina difícil de controlar (Figura 3B). Alternativamente, si el experimento se realiza demasiado pronto después de la eliminación crías, la leche no tendrá tiempo para acumularse en los alvéolos y la oxitocina inducida por las contracciones de las células mioepiteliales no provocar la liberación de suficiente cantidad de leche en los conductos que se observó (Figura 3C). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Disección de la glándula mamaria del ratón. Pin con el ratón sobre la espalda de las cuatro extremidades (A). Cortar la piel en primer lugar desde el vientre hasta el cuello. A continuación, hacer incisiones perpendiculares del centro de la barriga a cada miembro, como se muestra en la línea de puntos (B). Con cuidado, vaya de la piel en el lado de los animales y el pin, la exposición de las glándulas mamarias (C). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Glándula mamaria del ratón montar todo. Conductos de epitelio (flechas) y los ganglios linfáticos (cabeza de flecha) se observan con facilidad en un montaje de la glándula mamaria todo bien propagación de la glándula # 4 (A). Una glándula mamaria mal extendido pueden desprenderse de la diapositiva y se derrumbó, éste no podrá utilizarse (B). De la glándula mamaria o bien eliminado incorrectamente puede tener partes que faltan (C) o trozos de músculo o la piel restante (D). Tenga en cuenta que la 2 ª y 3 ª tienen glándulas interdigitados muscular, pero todavía se puede utilizar para todo el montaje o la histología. <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Oxitocina inducida por la eyección de leche se puede observar en los conductos del epitelio (flechas) después de la exposición de oxitocina (A). Sin embargo, si los conductos ya están llenos de leche (flechas) en el comienzo de la prueba debido a un período de latencia inapropiada después de la última amamantamiento de las crías, una mayor acumulación de leche en los conductos (flechas) después de la exposición oxitocina es difícil observar (B). Por otra parte, un período de latencia corto después de las crías lactantes no permitir la acumulación suficiente de leche en los alvéolos para ser debidamente observada en los conductos (flechas) después de la exposición de oxitocina (C). Las imágenes fueron tomadas antes y después de la exposición de oxitocina con una cámara numérica (Cybershot, Sony). <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Representaciones esquemáticas de los ensayos de tratamiento de todo el montaje y la oxitocina.

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</ol>

Desarrollo de la glándula mamaria y la función están muy orquestada. Los ratones mutantes pueden albergar las mutaciones genéticas que pueden afectar el desarrollo de la glándula mamaria y la función de resaltar la necesidad de evaluar la arquitectura glándula 13,12. Montaje de todo se puede realizar como se describe en este artículo en todas las etapas de desarrollo de la glándula mamaria. Normalmente, el desarrollo del epitelio se aprecia en el comienzo de la pubertad (~ 4 semanas de edad), en el centro de ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Carmín </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C1022 </td></tr><tr><td> De aluminio sulfato de potasio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6435 </td></tr><tr><td> Timol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0501 </td></tr><tr><td> Salicilato de metilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M6752 </td></tr><tr><td> La oxitocina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3251 </td></tr></tbody></table>

evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

La glándula mamaria humana se compone de lóbulos 15-20 que secretan la leche en un sistema de apertura de ramificación del conducto en el pezón. Los lóbulos se compone de un número de unidades del terminal del conducto lobular hecho de los alvéolos secretores y conductos de convergencia 1. En ratones, una arquitectura similar se observa en el embarazo en la que los conductos y los alvéolos se intercalan en el estroma del tejido conjuntivo. El epitelio de la glándula mamaria del ratón es un árbol como el sistema de conductos compuesto por dos capas de células, una capa interna de células luminales rodeado por una capa externa de células mioepiteliales denotada por los confines de una membrana basal 2. Al nacer, sólo un árbol ductal rudimentario está presente, compuesto por un conducto de las ramas primarias y 15-20. Rama de elongación y empezar de amplificación en el comienzo de la pubertad, alrededor de 4 semanas de edad, bajo la influencia de las hormonas 3,4,5. A las 10 semanas, la mayoría de la estroma es invadido por un complejo sistema de conductos que se someten a ciclos de ramificación y de regresión en cada ciclo estral hasta el embarazo 2. En el inicio del embarazo, una segunda fase de desarrollo se inicia, con la proliferación y diferenciación del epitelio de uva para formar estructuras en forma de secreción de leche, llamados alvéolos 6,7. Siguientes al parto y durante la lactancia, la leche es producida por las células secretoras luminal y se almacena en el lumen de los alvéolos. La liberación de oxitocina, estimulada por un reflejo neural inducida por la lactancia de las crías, induce contracciones sincronizadas de las células mioepiteliales alrededor de los alvéolos y por los conductos, permitiendo que la leche que se transporta a través de los conductos hacia el pezón, donde esté disponible a los 8 cachorros. Desarrollo de la glándula mamaria, diferenciación y función están fuertemente orquestado y que requieren, no sólo las interacciones entre el estroma y el epitelio, sino también entre las células mioepiteliales y luminal del epitelio 9,10,11. Por lo tanto, las mutaciones en muchos genes implicados en estas interacciones pueden afectar tanto el alargamiento ductal durante la formación de la pubertad o los alvéolos durante el embarazo temprano, la diferenciación durante la última etapa del embarazo y la activación secretora que conduce a la lactancia 12,13. En este artículo se describe cómo diseccionar las glándulas mamarias de ratón y evaluar su desarrollo el uso de bases conjunto. También demostramos cómo evaluar las contracciones mioepiteliales y eyección de la leche con un ex-vivo oxitocina basado en análisis funcional. El efecto de una mutación genética en el desarrollo de la glándula mamaria y la función de lo que se puede determinar in situ mediante la realización de estas dos técnicas en el control de ratones mutantes y de tipo salvaje.

Este método describe la forma de analizar y evaluar el desarrollo de la glándula mamaria y la función de los ratones. Extirpado las glándulas mamarias son evaluados por el grado de desarrollo con montaje completo, mientras que la eyección de leche se evaluó mediante un ensayo basado en la oxitocina contracción de las células mioepiteliales.

Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

La glándula mamaria humana está compuesta por 15-20 lóbulos que secretan leche hacia un sistema de conductos ramificados que desembocan en el pezón. Dichos lóbulos están, a su vez, ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el desarrollo de las glándulas mamarias en ratones de tipo silvestre y mutantes. Esto se logra primero mediante la disección de un ratón para exponer las glándulas mamarias. A continuación, las glándulas mamarias se extraen adecuadamente y se extienden sobre portaobjetos de vidrio, calm lum.Posteriormente, se utiliza tinción para analizar el grado de desarrollo del epitelio. Finalmente, se realiza un análisis de las contracciones mioepiteliales tras la exposición a oxitocina, INEA J.Ultimamente, los resultados obtenidos revelarán si los conductos de la glándula mamaria y los alvéolos se han formado adecuadamente, y si el epitelio mio puede inducirse a contraerse y expulsar leche tras la exposición a oxitocina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con el desarrollo y la diferenciación de la glándula mamaria, como el impacto de una mutación génica o la eliminación génica (knockout) sobre la morfología y función de la glándula mamaria.La demostración visual de este método garantiza una disección adecuada de la glándula mamaria, ya que tanto el montaje en orificio como el ensayo basado en oxitocina requieren glándulas mamarias bien preparadas. Una mala disección de la glándula puede provocar la ausencia de algunos conductos epiteliales o la presencia de tejidos extraños, como piel o tejido muscular. Al menos un día antes de la disección, prepare la solución de alumbre CalMin disolviendo un gramo de CalMin y 2,5 gramos de sulfato de aluminio y potasio en 500 mililitros de agua destilada.Hervir la solución durante 20 minutos en un matraz de un litro, ajustar el volumen final a 500 mililitros con agua. Filtrar la solución a través de papel Watman y añadir unos pocos granos de tiol como conservante. Luego, refrigerar la solución después de la tinción.La solución de alumbre de carbono puede volcarse nuevamente en el frasco de reserva y reutilizarse varias veces durante varias semanas. Prepare una solución nueva cuando el color se vuelva tenue. Para comenzar la disección de la glándula de la memoria, sacrifique un ratón mediante inhalación de dióxido de carbono.Evite la dislocación cervical si es posible, ya que podría dañar los vasos sanguíneos principales del cuello y provocar la acumulación de sangre alrededor de la glándula mamaria número uno, dificultando su disección sobre espuma de poliestireno envuelta en papel de aluminio. Coloque al ratón boca arriba y extienda sus cuatro extremidades.Sujete firmemente las cuatro extremidades utilizando agujas de calibre 16 a 20. Rocíe al ratón abundantemente con etanol al 70 % usando pinzas. Levante la piel abdominal en la línea media y realice una pequeña incisión con tijeras afiladas, comenzando desde la incisión.Corte la piel hasta el cuello del animal evitando perforar las cavidades abdominal o torácica. Corte la piel de las patas delanteras hasta la incisión media, obteniendo una forma de Y. Corte la piel de las patas traseras de la misma manera.Utilizando fórceps hemostáticos. Retire suavemente la piel abdominal y torácica hacia los lados del ratón si es necesario. Corte suavemente el tejido conjuntivo.Fije la piel a la espuma de poliestireno utilizando agujas de calibre 16 a 20, exponiendo las glándulas mamarias unidas a la cara inferior de la piel. Diseque una glándula a la vez usando pinzas. Levante suavemente la glándula mamaria de interés y corte entre la glándula y la piel con tijeras pequeñas y afiladas, comenzando desde el exterior hacia la columna vertebral del animal.Asegúrese de cortar cuidadosamente para que no queden restos de piel ni músculo sobre la glándula. Se pueden extraer todas las glándulas mamarias utilizando este protocolo, pero las glándulas mamarias abdominales número cuatro son las más adecuadas para el montaje completo. Después de extirpar la glándula mamaria del ratón, colóquela directamente sobre un portaobjetos de vidrio.Intente aplanarlo lo más posible. Manteniendo su forma original in situ, la glándula se adherirá bien al portaobjetos. Una vez extendida adecuadamente en una campana extractora, fije la glándula sumergiendo el portaobjetos en un frasco con car noise.Fije durante cuatro horas a temperatura ambiente. Alternativamente, fije la glándula durante la noche a cuatro grados Celsius. A continuación, lave el tejido con etanol al 70 % durante 15 minutos.Luego, rehidrátelo gradualmente en agua eliminando la mitad de la solución de etanol del frasco y reemplazándola con agua doblemente destilada. Incube durante cinco minutos. Repita el proceso tres veces, enjuague y lave con agua destilada durante cinco minutos.Luego, tiña la glándula con alumbre de carbono durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, retire la tinción de alumbre de carbono para reutilizarla y deshidrate gradualmente el tejido teñido mediante baños seriales de etanol durante cinco minutos cada uno. A continuación, aclare el tejido en xileno durante la noche; tras la aclaración, sumerja la glándula mamaria en salicilato de metilo, manteniendo el salicilato de metilo en una campana extractora hasta que esté listo para tomar las imágenes. El desarrollo de la glándula mamaria puede cuantificarse contando el número de ramificaciones o ramas laterales a lo largo de segmentos de los conductos, la longitud de los conductos principales, o bien evaluando la relación entre el área del tejido epitelial y la del tejido adiposo.Un segundo ensayo utilizado para evaluar el desarrollo y la función de la glándula mamaria consiste en exponer la glándula a oxitocina y evaluar la eyección de leche hacia los conductos epiteliales. Para realizar este ensayo, las crías recién alimentadas deben separarse de la madre y la madre debe mantenerse en aislamiento durante una hora. A continuación, sacrifique a la madre y exponga las glándulas mamarias como se describió para la disección de la glándula mamaria.Sin embargo, déjelos en el animal. Comience el ensayo utilizando una pipeta de transferencia para depositar uniformemente de tres a cinco mililitros de PBS o de la solución de oxitocina directamente sobre la glándula mamaria de interés. Para este procedimiento, se recomienda utilizar las glándulas torácicas, usando un lado como control y el otro lado para probar la eyección de leche.Incube las glándulas durante un minuto y elimine las soluciones aspirándolas cuidadosamente con una pipeta de transferencia; supervise la entrada de leche en los conductos mediante grabación en video o tomando imágenes antes y después de la exposición a PBS u oxitocina. A continuación se muestran ejemplos de memoria de ratón. En un montaje completo bien extendido de glándula mamaria, se observan fácilmente los conductos epiteliales de la glándula, indicados por flechas, y el ganglio linfático marcado por una punta de flecha.Una glándula mamaria mal extendida puede desprenderse del portaobjetos y colapsarse, lo que la hace inservible. Una glándula mamaria extraída incorrectamente puede tener partes faltantes o fragmentos de músculo o piel remanentes aquí. La eyección de leche inducida por oxitocina puede observarse en patos epiteliales tras la exposición a oxitocina.Sin embargo, si las ubres ya están llenas de leche al inicio del ensayo debido a un período de latencia inadecuadamente largo tras la última succión de las crías, es difícil observar una acumulación adicional de leche en las ubres tras la exposición a oxitocina. Alternativamente, un período de latencia corto después de la succión por las crías impedirá la acumulación de suficiente leche en los alvéolos para que pueda observarse adecuadamente en los conductos tras la exposición a oxitocina, tras la disección de las glándulas mamarias. En lugar de montar en cavidad o evaluar la eyección de leche inducida por oxitocina, las glándulas mamarias pueden congelarse, seccionarse por criomicrotomía e inmunomarcar para cualquier número de proteínas residentes en las glándulas mamarias.O alternativamente, las glándulas pueden lisarse y prepararse para inmunotransferencia western. Juntos, estos dos análisis permitieron abordar preguntas fundamentales relacionadas con el desarrollo, la diferenciación y la función de las glándulas en cualquier cantidad de modelos de ratón que han sido diseñados para carecer de genes clave o presentar mutaciones en genes arbor.

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