Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el desarrollo de las glándulas mamarias en ratones de tipo silvestre y mutantes. Esto se logra primero mediante la disección de un ratón para exponer las glándulas mamarias. A continuación, las glándulas mamarias se extraen adecuadamente y se extienden sobre portaobjetos de vidrio, calm lum.

Posteriormente, se utiliza tinción para analizar el grado de desarrollo del epitelio. Finalmente, se realiza un análisis de las contracciones mioepiteliales tras la exposición a oxitocina, INEA J.Ultimamente, los resultados obtenidos revelarán si los conductos de la glándula mamaria y los alvéolos se han formado adecuadamente, y si el epitelio mio puede inducirse a contraerse y expulsar leche tras la exposición a oxitocina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con el desarrollo y la diferenciación de la glándula mamaria, como el impacto de una mutación génica o la eliminación génica (knockout) sobre la morfología y función de la glándula mamaria.

La demostración visual de este método garantiza una disección adecuada de la glándula mamaria, ya que tanto el montaje en orificio como el ensayo basado en oxitocina requieren glándulas mamarias bien preparadas. Una mala disección de la glándula puede provocar la ausencia de algunos conductos epiteliales o la presencia de tejidos extraños, como piel o tejido muscular. Al menos un día antes de la disección, prepare la solución de alumbre CalMin disolviendo un gramo de CalMin y 2,5 gramos de sulfato de aluminio y potasio en 500 mililitros de agua destilada.

Hervir la solución durante 20 minutos en un matraz de un litro, ajustar el volumen final a 500 mililitros con agua. Filtrar la solución a través de papel Watman y añadir unos pocos granos de tiol como conservante. Luego, refrigerar la solución después de la tinción.

La solución de alumbre de carbono puede volcarse nuevamente en el frasco de reserva y reutilizarse varias veces durante varias semanas. Prepare una solución nueva cuando el color se vuelva tenue. Para comenzar la disección de la glándula de la memoria, sacrifique un ratón mediante inhalación de dióxido de carbono.

Evite la dislocación cervical si es posible, ya que podría dañar los vasos sanguíneos principales del cuello y provocar la acumulación de sangre alrededor de la glándula mamaria número uno, dificultando su disección sobre espuma de poliestireno envuelta en papel de aluminio. Coloque al ratón boca arriba y extienda sus cuatro extremidades.

Sujete firmemente las cuatro extremidades utilizando agujas de calibre 16 a 20. Rocíe al ratón abundantemente con etanol al 70 % usando pinzas. Levante la piel abdominal en la línea media y realice una pequeña incisión con tijeras afiladas, comenzando desde la incisión.

Corte la piel hasta el cuello del animal evitando perforar las cavidades abdominal o torácica. Corte la piel de las patas delanteras hasta la incisión media, obteniendo una forma de Y. Corte la piel de las patas traseras de la misma manera.

Utilizando fórceps hemostáticos. Retire suavemente la piel abdominal y torácica hacia los lados del ratón si es necesario. Corte suavemente el tejido conjuntivo.

Fije la piel a la espuma de poliestireno utilizando agujas de calibre 16 a 20, exponiendo las glándulas mamarias unidas a la cara inferior de la piel. Diseque una glándula a la vez usando pinzas. Levante suavemente la glándula mamaria de interés y corte entre la glándula y la piel con tijeras pequeñas y afiladas, comenzando desde el exterior hacia la columna vertebral del animal.

Asegúrese de cortar cuidadosamente para que no queden restos de piel ni músculo sobre la glándula. Se pueden extraer todas las glándulas mamarias utilizando este protocolo, pero las glándulas mamarias abdominales número cuatro son las más adecuadas para el montaje completo. Después de extirpar la glándula mamaria del ratón, colóquela directamente sobre un portaobjetos de vidrio.

Intente aplanarlo lo más posible. Manteniendo su forma original in situ, la glándula se adherirá bien al portaobjetos. Una vez extendida adecuadamente en una campana extractora, fije la glándula sumergiendo el portaobjetos en un frasco con car noise.

Fije durante cuatro horas a temperatura ambiente. Alternativamente, fije la glándula durante la noche a cuatro grados Celsius. A continuación, lave el tejido con etanol al 70 % durante 15 minutos.

Luego, rehidrátelo gradualmente en agua eliminando la mitad de la solución de etanol del frasco y reemplazándola con agua doblemente destilada. Incube durante cinco minutos. Repita el proceso tres veces, enjuague y lave con agua destilada durante cinco minutos.

Luego, tiña la glándula con alumbre de carbono durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, retire la tinción de alumbre de carbono para reutilizarla y deshidrate gradualmente el tejido teñido mediante baños seriales de etanol durante cinco minutos cada uno. A continuación, aclare el tejido en xileno durante la noche; tras la aclaración, sumerja la glándula mamaria en salicilato de metilo, manteniendo el salicilato de metilo en una campana extractora hasta que esté listo para tomar las imágenes. El desarrollo de la glándula mamaria puede cuantificarse contando el número de ramificaciones o ramas laterales a lo largo de segmentos de los conductos, la longitud de los conductos principales, o bien evaluando la relación entre el área del tejido epitelial y la del tejido adiposo.

Un segundo ensayo utilizado para evaluar el desarrollo y la función de la glándula mamaria consiste en exponer la glándula a oxitocina y evaluar la eyección de leche hacia los conductos epiteliales. Para realizar este ensayo, las crías recién alimentadas deben separarse de la madre y la madre debe mantenerse en aislamiento durante una hora. A continuación, sacrifique a la madre y exponga las glándulas mamarias como se describió para la disección de la glándula mamaria.

Sin embargo, déjelos en el animal. Comience el ensayo utilizando una pipeta de transferencia para depositar uniformemente de tres a cinco mililitros de PBS o de la solución de oxitocina directamente sobre la glándula mamaria de interés. Para este procedimiento, se recomienda utilizar las glándulas torácicas, usando un lado como control y el otro lado para probar la eyección de leche.

Incube las glándulas durante un minuto y elimine las soluciones aspirándolas cuidadosamente con una pipeta de transferencia; supervise la entrada de leche en los conductos mediante grabación en video o tomando imágenes antes y después de la exposición a PBS u oxitocina. A continuación se muestran ejemplos de memoria de ratón. En un montaje completo bien extendido de glándula mamaria, se observan fácilmente los conductos epiteliales de la glándula, indicados por flechas, y el ganglio linfático marcado por una punta de flecha.

Una glándula mamaria mal extendida puede desprenderse del portaobjetos y colapsarse, lo que la hace inservible. Una glándula mamaria extraída incorrectamente puede tener partes faltantes o fragmentos de músculo o piel remanentes aquí. La eyección de leche inducida por oxitocina puede observarse en patos epiteliales tras la exposición a oxitocina.

Sin embargo, si las ubres ya están llenas de leche al inicio del ensayo debido a un período de latencia inadecuadamente largo tras la última succión de las crías, es difícil observar una acumulación adicional de leche en las ubres tras la exposición a oxitocina. Alternativamente, un período de latencia corto después de la succión por las crías impedirá la acumulación de suficiente leche en los alvéolos para que pueda observarse adecuadamente en los conductos tras la exposición a oxitocina, tras la disección de las glándulas mamarias. En lugar de montar en cavidad o evaluar la eyección de leche inducida por oxitocina, las glándulas mamarias pueden congelarse, seccionarse por criomicrotomía e inmunomarcar para cualquier número de proteínas residentes en las glándulas mamarias.

O alternativamente, las glándulas pueden lisarse y prepararse para inmunotransferencia western. Juntos, estos dos análisis permitieron abordar preguntas fundamentales relacionadas con el desarrollo, la diferenciación y la función de las glándulas en cualquier cantidad de modelos de ratón que han sido diseñados para carecer de genes clave o presentar mutaciones en genes arbor.