Método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas

El objetivo general de este procedimiento es establecer un método novedoso para la evaluación de la eficacia de fármacos con especímenes quirúrgicos de tumores cerebrales denominado método tumor X explante. Esto se logra primero asegurando especímenes quirúrgicos recién extraídos de gliomas malignos durante la cirugía para experimentos preclínicos. A continuación, las muestras se transportan al centro de obtención de tejidos para separarlas con fines de diagnóstico clínico e investigación.

Luego, en el laboratorio de investigación, los explantes tumorales se disecan en múltiples tejidos más pequeños y se transfieren a un medio optimizado. Finalmente, se realizan inyecciones intratumorales con candidatos a fármacos y los explantes se incuban durante 16 horas. En última instancia, se pueden obtener resultados que revelan la eficacia del tratamiento mediante tinción con hematina y ein, así como inmunohistoquímica con marcadores específicos de tipo celular.

También podemos evaluar la eficacia de los fármacos in vitro mediante citometría de flujo y ensayos de formación de neuroesferas. La mayoría de los ensayos actuales de eficacia de fármacos dejan una brecha entre la eficacia del fármaco en los modelos experimentales preclínicos actuales y la eficacia en pacientes hospitalizados. En particular, cuando probamos candidatos a fármacos en cánceres sólidos como los gliomas malignos, no podemos subestimar los intercambios de señales intercelulares e intracelulares.

Con el fin de evitar alterar el microentorno de los tumores sólidos, establecimos un método de cultivo anty con nuestro explante tumoral. Después de que los tumores son extraídos de los pacientes, las muestras se transfieren desde o hacia el Departamento de Patología; dividimos los fragmentos tumorales en dos partes. Una parte de la muestra tumoral se utiliza para seccionado por congelación e inclusión en parafina para el diagnóstico clínico, y el resto del tejido tumoral se envía a los laboratorios de investigación para ser utilizado por los investigadores.

Mediante este método, podemos preservar el microambiente del tumor junto con las células endoteliales tumorales adyacentes y las células inmunitarias, así como las células cerebrales normales que rodean el tumor o migran hacia las cavidades tumorales. Antes de procesar el tejido de glioblastoma, prepare soluciones líquida, de medio y de agar. Mézclelas en una proporción uno a uno.

Luego, agregue un mililitro a cada pocillo de placas de seis pocillos. Después de recibir el tejido fresco de glioblastoma multiforme, transfiéralo a una placa de Petri utilizando pinzas y láveselo cuidadosamente tres veces con cinco mililitros de PBS frío al hielo al 1x con la hoja quirúrgica y pinzas. Corte secciones seriadas de aproximadamente 10 milímetros de diámetro de las muestras diseccionadas para crear bloques tumorales, transfiera cada bloque a un pocillo de la placa de seis pocillos que contenga medio de agar, permitiendo que tenga suficiente exposición al aire para mantenerlo viable.

A continuación, utilizando una jeringa de insulina de un mililitro y una aguja de 28 gauge y media pulgada, inyecte los bloques tumorales tres veces con DMSO al 5 % o con temozolomida a 2,5 nanomolar o con un nuevo candidato a fármaco anticancerígeno e incube durante 16 horas a 37 grados Celsius en aire humidificado que contenga 5 % de dióxido de carbono. Tras la incubación, lave los bloques tres veces con cinco mililitros de PBS al 1×. Luego, en tubos de 50 mililitros, fije los bloques con 10 mililitros de paraformaldehído al 10 % volumen/volumen durante 24 horas.

Incrustar el tejido en parafina y cortar secciones de cuatro micrones para desparafinar, desanizar y rehidratar las secciones. Colocar los portaobjetos en una gradilla e incubarlos en las siguientes soluciones. Silene tres veces durante cinco minutos cada una.

Etileno al 100 % tres veces durante cinco minutos cada vez. Etanol al 95 % una vez durante cinco minutos y etanol al 70 % una vez durante cinco minutos. Finalmente, enjuague con agua corriente durante tres minutos.

Consulte el protocolo escrito adjunto para obtener detalles sobre la recuperación de antígenos y la inhibición de la peroxidasa interna. Para bloquear las secciones, cubra los tejidos con suero de cabra normal al 10 %, transfiera las laminillas a una caja húmeda e incube durante una hora a temperatura ambiente. Lave las laminillas tres veces con PBS al 1×, cinco minutos cada vez.

A continuación, agregue anticuerpos primarios, como caspasa tres específica para humanos o KI 67, diluidos en PBS al uno por uno, e incube toda la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Enjuague los portaobjetos en PBS al uno por uno, tres veces, durante 10 minutos cada vez. A continuación, cubra los tejidos con dos o tres gotas de anticuerpo secundario marcado con HRP.

Coloque los portaobjetos en una caja húmeda e incube durante una hora a temperatura ambiente. Lave con PBS 1X tres veces durante cinco minutos cada vez. Revele las muestras utilizando un kit de cromógeno DAB siguiendo las instrucciones del fabricante para la contratincción.

Sumerja las laminillas en hematina durante 10 a 15 segundos. Luego enjuague con agua corriente del grifo durante tres minutos. Deshidrate las muestras sumergiendo las laminillas en las siguientes soluciones en un reactivo de montaje y un cubreobjetos.

Luego, utilice un microscopio de fluorescencia para obtener imágenes de los portaobjetos. La imagen de resonancia magnética ponderada en T1 con realce mediante gadolinio en esta figura muestra un tumor de glioblastoma multiforme o GBM realzado en el lóbulo frontal derecho de un paciente antes de la cirugía. La imagen posoperatoria confirmó la resección subtotal de la lesión tras la intervención quirúrgica.

La tinción con hematoxilina y eosina demuestra la presencia de necrosis, células en pseudo palizada y proliferación microvascular. Por lo tanto, estos tumores fueron diagnosticados histopatológicamente como GBM para investigar si estas muestras de explantes tumorales podrían utilizarse de manera confiable. Con el fin de realizar una prueba de eficacia del fármaco, evaluamos el efecto del fármaco temozolomida o TMZ; la inmunohistoquímica de tejidos de GBM tratados con TMZ demuestra una reducción sustancial de células tumorales positivas para KI 67 en comparación con las muestras control.

Por otro lado, la inmunohistoquímica con un marcador de apoptosis, la caspasa tres, no mostró ninguna diferencia significativa entre las muestras de glioma tratadas con TMZ y las muestras de control. El efecto del tratamiento con temozolomida puede caracterizarse más a fondo combinando este ensayo ex explan con cultivo in vitro o citometría de flujo. Podemos comparar este método ex explan con el trasplante de xenoinjertos y el ensayo de formación de esferoides in vitro para la selección de nuevos agentes anticancerígenos.

Una vez que se obtienen los tejidos tumorales en el laboratorio, el procedimiento para este experimento puede completarse en menos de una hora. Este nuevo ensayo es relativamente fácil de realizar y reproducible tras la disociación de los implantes tumorales tratados. Podemos combinarlo con experimentos in vitro.

Una ventaja importante de este ensayo es que conserva el microambiente tumoral. Obtenemos datos positivos con explantes tumorales tratados con Temodar, que fueron consistentes con el resultado de los mismos pacientes que recibieron tratamiento con Temodar tras las cirugías. Por último, esto es aplicable a otros cánceres sólidos y, por lo tanto, podría tener el potencial de acelerar la identificación de nuevos agentes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer sólido.