Name: Método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprende a evaluar la eficacia de fármacos en gliomas malignos utilizando el método de explantes tumorales de muestras quirúrgicas. Esta técnica preserva el microambiente tumoral para obtener resultados más relevantes en oncología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La Sociedad Americana del Cáncer (MRSG-08-108-01), Vicente J. Sgro / La Asociación de Tumores Cerebrales de América, y la familia Khan Foundation para que Nakano.

1. Preparación de los medios de comunicación <ol><li> Los medios de comunicación fue elaborado con 10% de SFB (16140-071 - GIBCO) en DMEM/F-12 (1X), líquido 01:01 (10.565-042 - Invitrogen) con 0,6% de solución de agar purificado, Granulado (1.01614.1000-EMD ). Condiciones de esterilidad se mantuvieron durante todo el experimento. </li><li> Para la preparación de 5 ml de medios de FBS (16.140-071 - GIBCO) se añadió a 45 ml de DMEM/F-12 (1X), líquido 01:01 (10565-042 - Invitrogen) haciendo volumen final de 50 ml. Los medios preparados se mantuvo en un baño de agua a 37 ° C de temperatura. </li><li> La solución de agar se prepara mediante el método de microondas el calor. 0,3 gramos de agar granulado se disolvió en 50 ml de agua destilada utilizando microondas. La solución de agar se enfríe a 37 º C de temperatura, manteniendo que en el baño de agua. </li><li> Se utilizó el mismo volumen de los medios de comunicación desde el paso 1.2 y 1.3 y la solución madre preparada. La proporción de 0,6% de agar (0,5 ml) y el 10% FBS-D-MEM/F-12 los medios de comunicación (0,5 ml) fue de 1:1, por lo que el volumen total de 1 ml en cada pocillo de placas de 6 pocillos. </li></ol> 2. Procesamiento de tejidos <ol><li> El glioblastoma multiforme (GBM) los tejidos se recibieron inmediatamente después de la cirugía del Departamento de Patología. El tejido fue clasificado como GBM, del Departamento de Patología. </li><li> El tejido fue transferido al patri-placa con las pinzas con cuidado y se lava con 5 ml 1XPBS helada durante 3 horas. </li><li> Las secciones seriadas de las muestras fueron cortadas de las muestras disecadas para crear bloques de tumor (aproximadamente 10 mm de diámetro) con una cuchilla quirúrgica (Feather, 2976 # 10) y pinza (Fisher Scientific). </li><li> Los bloques fueron trasladados en una placa de 6 pocillos. Cada 1 ml y se contiene de los medios de comunicación mencionan en el paso 1.4. El tejido había suficiente exposición al aire para mantener el tejido viable. </li><li> Bloques tumorales fueron inyectados con cualquiera de DMSO (5%) o TMZ (2,5 nM) y se incubó durante 16 horas a 37 ° C en aire humidificado contiene 5% de CO2. 0,1 ml de DMSO (5%) o TMZ fue inyectado 3 veces en los bloques de tumor en diferentes lugares para un tratamiento coherente. La droga fue inyectada con jeringa de insulina 1 ml 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Point Comfort-26027). </li><li> Después de 16 horas los bloques se lavaron con 5 ml 1XPBS por 3 veces. Después de lavar los bloques se fijaron con 10 ml de 10% v / v en formol durante 24 horas (Ricca Chemical Company) en tubos de 50 ml (de Basix-5539802) y se procesa de parafina 4μm secciones. </li><li> La sección fijado en formol se coloca en el vaso sobre la placa de agitación con "sin calor" y procesados ​​a través de las siguientes soluciones durante 30 minutos en cada solución. 30% de etanol, etanol al 50%, 75% etanol, 80% de etanol, etanol al 95%, 100% de etanol y xileno. </li><li> El tejido se transfirieron a las toallas de papel y se coloca en parafina derretida (58 a 60 ° C, Fisher Paraplast parafina) durante 30 minutos. </li><li> El tejido se incluyó en moldes con parafina Surgipath Blue Ribbon, tejidos embebidos se enfrió a temperatura ambiente. </li><li> Embebidos en parafina secciones de tejido 4μm se tomaron y se coloca en Fisher diapositivas Plus. </li></ol> 3. Inmunohistoquímica La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente. 1 <ol><li> Deparaffinization y lugar de rehidratación de las diapositivas en un bastidor y realizar los pasos siguientes. Xileno de 3x5 minutos (3 veces durante 5 minutos), etanol al 100% para los minutos de 3x5, el 95% de etanol durante unos minutos 1x5, el 70% de etanol para el 1x5 minutos, enjuague con agua corriente del grifo durante 3 minutos. </li><li> Antígeno de recuperación de calor inducido por diapositivas de recuperación del epítopo de lleno en tampón de citrato 1X (Thermo Scientific-AP9003-500) diluido en agua destilada en un vaso de vidrio. Hervir durante 15 minutos en un plato caliente (asegúrese de que las secciones don "t caen fuera de la diapositiva). Enfriar la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuague los portaobjetos con PBS 1X de 3x5 minutos. </li><li> La inhibición de peróxido de internos Sumerja los portaobjetos en metanol (Fisher Scientific-A-452-4) con peróxido de hidrógeno al 0,3% (Fisher Scientific-BP2633-500-diluido en agua destilada) en un vaso de cristal durante 15 minutos. Enjuague con 1X PBS para 3x5 minutos. </li><li> El bloqueo de la cubierta de los tejidos con suero de cabra al 10% normal. Transferencia de las diapositivas de una caja húmeda e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavan los portas con PBS 1X de 3x5 minutos. </li><li> Secciones primaria de anticuerpos se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario en las siguientes concentraciones: la caspasa-3 humana específica (1:1000, sistemas de I + D, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) diluido con PBS 1X. Enjuague los portaobjetos en PBS 1X minutos 3x10 al día siguiente. </li><li> Reacción de los anticuerpos secundarios cubren los tejidos con 2-3 gotas de HRP etiqueta secundaria de anticuerpos (prever sistemas). Poner los portaobjetos en una caja húmeda e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar con PBS 1X de 3x10 minutos. </li><li> Detección de Desarrollo para el kit de cromógeno DAB (Vector laboratorios-SK-4100) para la detección de anticuerpos primaria siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Tinción contador Sumerja las láminas con hematoxilina (10-15 s egundos, asegúrese de que don "t invadido DAB señal). Enjuague con agua corriente del grifo durante 3 minutos. </li><li> Sumerja la deshidratación de las diapositivas en el siguiente orden, el 70% de etanol durante 5 minutos, el 95% de etanol durante 5 minutos, 100% de etanol para los minutos de 3x5, 3x5 de xileno minutos. </li><li> Cubreobjetos las diapositivas con el reactivo de Permount montaje (Fisher Scientific-SP-15-100). </li><li> Las imágenes fueron tomadas con microscopio de fluorescencia Olympus (DP-72) .3.11). En todos los experimentos, etiquetado específico fue confirmada por el control negativo sin anticuerpo primario. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Se recogieron muestras quirúrgicas de glioblastoma multiforme (GBM). Los pacientes se sometieron a la primera cirugía sin quimioterapia previa como la temozolomida (TMZ). La imagen en T1 de la RM con gadolinio en la Figura 1a-demostró un tumor mayor en el lóbulo frontal derecho antes de la cirugía. La imagen postoperatoria (Figura 1b), confirmó la resección casi total de la lesión después de la cirugía. Los tejidos quirúrgicos fueron enviados al Departamento de Patología con el propósito diagnóstico clínico, y el resto de las muestras fueron procesadas para la obtención de tejidos en la Junta de Revisión aprobada Institucional (IRB) de protocolo en la Ohio State University Medical Center. Hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción demostrado la presencia de necrosis, las células pseudopallisading, y la proliferación microvascular (Figura 1-c). Por lo tanto, estos tumores fueron diagnosticados histopatológicamente como GBM. Es de destacar que los explantes de tumores después de la incubación sin TMZ hasta 48 horas mantiene la citoarquitectura de GBM. Por el contrario, con una incubación de 72 horas o más, nos dimos cuenta el aumento del número de núcleos de condensación en las muestras, lo que sugiere algunas de las células del tumor a partir de someten a la apoptosis. Como resultado, los tejidos tumorales después de la incubación ya contenía regiones irregular que perdió las células tumorales, las cuales fueron observadas preferentemente en y alrededor de las áreas necróticas (datos no mostrados). Con el fin de investigar si estas muestras de explantes de tumores de forma fiable puede ser utilizado con el propósito de la prueba de eficacia del fármaco, hemos probado el efecto del tratamiento con TMZ. Figura 2 representa el flujo de los experimentos en este estudio. Un estudio reciente indica que la inyección intratumoral de TMZ tiene un efecto más potente sobre el control del crecimiento de los gliomas malignos que la de la administración sistémica de este medicamento 2. Después de la incubación durante 16 horas, los explantes fueron incluidos en parafina y las secciones de serie se prepararon para la tinción. Inmunohistoquímica de tejidos tratados con TMZ GBM demostró una reducción sustancial de las células tumorales Ki-67-positivas en comparación con las muestras de control. A su vez, la inmunohistoquímica con un marcador de la apoptosis, la caspasa-3, no produjo ninguna diferencia significativa entre las muestras de glioma tratada con TMZ y las muestras de control (Figura 3). El efecto del tratamiento con TMZ se caracterizó además por la combinación de este ensayo de explante, juntamente con el cultivo in vitro o la citometría de flujo. En concreto, hemos tratado de determinar el efecto sobre la madre similares a las células las células tumorales (SCLTC). Por lo tanto, después de un tratamiento intratumoral con TMZ, se realizó un ensayo de formación de ámbito y citometría de flujo de estos explantes tumorales. Las muestras tratada con TMZ se disocia en las células individuales de un solo y único de estas células se sembraron a una densidad baja (1 de células por microlitro o menos) en placas de 96 pocillos en medio libre de suero complementado con bFGF y EGF. En el grupo control, la formación de esferas de tumores de los explantes de tumores se observó después de 7 días de incubación. Teniendo en cuenta que la formación de la esfera es una propiedad de SCLTC 3 4, alteraciones en el número de esferas del tumor mediante un tratamiento de drogas indica que el efecto sobre SCLTC. Del mismo modo, la citometría de flujo de los explantes de tumores disocian con un marcador de superficie celular, CD133, se llevó a cabo para verificar el efecto sobre la SCLTC. Si SCLTC en las células de tumor heterogéneo en GBM son selectivamente erradicar mediante el tratamiento con medicamentos, se podría predecir que la citometría de flujo detecta un descenso de la fracción CD133 positivas de un tratamiento (datos no mostrados). <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figure.1 imágenes por resonancia magnética (MRI) de un paciente GBM. Figuras representativas de la pre-operación de la Figura 1a-y post-operación Figura 1b. Figura 1c es la tinción H &amp; E de la muestra de tejido fresco GBM. Ampliación original, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura. 2 El flujo experimental del experimento de bloquear la cultura. Figura 2a. Imagen de GBM recién recibido de cirugía departamento de patología. Figura 2b muestra la disección del bloque del tumor en pequeñas piezas de 10 mm con la hoja de ayuda quirúrgica. Figura 2c es la droga (TMZ) el tratamiento de los bloques de tumor usando una jeringa de insulina. e 3 "/&gt; Figura. 3 inmunohistoquímica. Inmunohistoquímica de los bloques de tejido GBM inyectado con DMSO o con TMZ activa la caspasa-3 y Ki67. Hematoxilina fue utilizado para la tinción nuclear. Ampliación original, 40X.

<ol><li>Hemmati, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).</li>
<li>Heimberger, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temozolomide+delivered+by+intracerebral+microinfusion+is+safe+and+efficacious+against+malignant+gliomas+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats.</a> Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).</li>
<li>Nakano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+embryonic+leucine+zipper+kinase+is+a+key+regulator+of+the+proliferation+of+malignant+brain+tumors%2C+including+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells.</a> J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).</li>
<li>Laks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+formation+is+an+independent+predictor+of+clinical+outcome+in+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li>
<li>Phillips, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+subclasses+of+high-grade+glioma+predict+prognosis%2C+delineate+a+pattern+of+disease+progression%2C+and+resemble+stages+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis.</a> Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+Analysis+of+Glioblastoma+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation.</a> J Proteome Res. , (2010).</li>
<li>Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+stem+cell+markers+and+proliferative+labeling+on+glioma+cell+lines%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Bing+Li+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines].</a> Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).</li>
<li>Vik-Mo, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells+maintain+overall+phenotype+and+tumorigenicity+after+in+vitro+culturing+in+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions.</a> Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).</li>
<li>Hovinga, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+notch+signaling+in+glioblastoma+targets+cancer+stem+cells+via+an+endothelial+cell+intermediate.+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells.</a> 28, 1019-1029 (2010).</li>
<li>de Groot, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+after+treatment+of+glioblastoma+with+bevacizumab%3A+radiographic+and+pathologic+correlation+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice.</a> Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).</li>
</ol>

Hay una brecha entre la eficacia de los medicamentos en el actual pre-clínicos y modelos experimentales la eficacia en los pacientes. Más específicamente, en el campo de investigación sobre el cerebro del tumor, nuevos métodos y fiable es necesario que ayude a llenar el vacío existente entre la evaluación de los medicamentos con los actuales métodos y la eficacia en los pacientes. El ensayo se describe en este estudio es una ventaja adicional, si no una solución, para facilitar el llenado de la discrepancia de los datos experimentales y los resultados de los pacientes afectados. En cultivos celulares in vitro preferentemente ampliar ciertos tipos de células tumorales, independientemente de las condiciones de cultivo, y sólo representan una subpoblación de todo el tumor. 5 Además, la transformación genética y fenotípica de la expansión de las células artificiales ocurre y es inevitable con los cultivos celulares a largo plazo . Uno de los principales obstáculos para el tratamiento de los gliomas malignos es la heterogeneidad de las células tumorales, tanto dentro de un solo tumor, y entre las muestras de tumor de 6, 7. Por lo tanto, el enriquecimiento selectivo de una cierta población de células tumorales, a pesar de un tipo u otro, no puede ser un medio apropiado para determinar la eficacia de los agentes quimioterápicos en las células tumorales heterogéneos. 8 9 Cualquier modelo animal de los tumores cerebrales derivadas de una subpoblación de las células tumorales arrojar luces sobre la eficacia del fármaco en una subpoblación, pero no todo el tumor. Varias limitaciones, por otro lado, aún permanecen en este método de explante del tumor. Una limitación de este tipo es el período relativamente corto de tratamiento. Desde células de tumores malignos son considerados para adquirir resistencia a la mayoría, si no todas, las terapias a través del tiempo, el control inicial del crecimiento de las células tumorales a corto plazo no puede ser reflejada por el pronóstico de los pacientes a largo plazo, como se informó recientemente con un anti- agente antiangiogénico, bevacizumab 10. Por lo tanto, la mejora del protocolo para este ensayo de explante para conservar los tejidos por un largo período se requiere de más investigaciones. Otra cuestión es un efecto específico de una prueba de drogas en SCLTC en el tumor. Teniendo en cuenta que SCLTC son relativamente resistentes a las terapias actuales para el glioma maligno, identificación de nuevos fármacos contra el cáncer que potencialmente erradicar SCLTC se justifica. En este sentido, en la actualidad tratan de combinar este ensayo con el consiguiente explante en experimentos in vitro, como el ensayo de neuroesfera formación (datos no mostrados). Esperamos aprender más sobre los efectos, en su caso, de un candidato a fármaco en SCLTC a través de estas pruebas combinadas. Por último, utilizando pequeños bloques de muestras de tumores pueden no reflejar la totalidad del tumor poblaciones de células, como es el caso de las líneas celulares tumorales convencionales o cultivos primarios de las muestras quirúrgicas. Estos problemas a un lado, preservar el estroma del tumor, incluyendo el nicho vascular, es útil en la caracterización de los factores ambientales de las células tumorales. Por lo tanto, este ensayo puede tener potencial para evaluar cualquier estrategia terapéutica bajo condiciones fisiológicamente más relevantes. En este caso, se estableció un ensayo para la prueba de eficacia del fármaco con explantes de piezas quirúrgicas de GBM. De hecho, con las piezas quirúrgicas a prueba, se encontró que una inyección directa de TMZ reduce la proliferación en las muestras de GBM. Este método de explantes de tejidos en teoría es aplicable a otros tumores sólidos y ofrece activos para determinar la eficacia del fármaco en el tumor de un paciente, que esperamos nos ayude a evitar un nuevo fracaso en los ensayos clínicos para el cáncer.

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> De suero bovino fetal, calificado, inactivado por calor </td><td> GIBCO </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 (1X) Líquido 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> El agar-agar purificado, Granulado </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> DPBS para la tinción </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoxyllin </td><td> Richalrd allan ciencia </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> 10% w / v caspasa-3 en formol </td><td> Ricca Chemical Company </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Caspasa-3 </td><td> I + D de sistemas </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> Envision sistema anti-ratón </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> Envision sistema anti-conejo </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB-kit </td><td> Vector Lab.. </td><td> SK-4100 </td></tr></table> Tabla 1. Materiales. <table border="1"><tr><td> Nombre del equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 6 pocillos </td><td> Greiner un bio- </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Una caja de petri </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> Serológicas pipeta </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> Puntas con filtro </td><td> EE.UU. científica </td><td></td></tr><tr><td> 500 micras de malla de poliéster Netwell inserción </td><td> Costar </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel Matriz </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> BD jeringa de 10 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Aguja hipodérmica de aluminio de concentradores. </td><td> Tyco Health Care </td><td> 2000029 </td></tr><tr><td> Frasco de cultivo de tejidos </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de centrífuga </td><td> BASIX </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td> Tubos delgados de pared </td><td> Eton </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> Quirúrgica de la hoja de acero inoxidable </td><td> Pluma </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> Jeringa de insulina </td><td> Confort punto </td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50 ml con tapa de rosca de tubo plano de la PAC </td><td> BASIX </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td> Disección microscopio </td><td> Tritech </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Olimpo </td><td> DP-72 </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Fisher Ciencia </td><td></td></tr></table> Tabla 2. Equipo.

método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Las terapias actuales para el glioma maligno sólo tienen efecto paliativo. Para el desarrollo terapéutico, un obstáculo es la discrepancia de la eficacia determinada por las actuales pruebas de eficacia del fármaco y la eficacia en los pacientes. Por lo tanto, nuevos métodos y confiable para evaluar la eficacia del medicamento están garantizados en la fase pre-clínica. Cultivo in vitro de los tejidos tumorales, incluidas las líneas celulares, cuenta con importantes alteraciones fenotípicas, genéticas y epigenéticas de las células de cáncer causado por el medio artificial de cultivo, lo que puede no reflejar la biología de los tumores originales in situ. Modelos de xenoinjerto con los ratones inmunodeficientes también tienen sus limitaciones, es decir, la falta de sistema inmunológico y las discrepancias entre especies genéticas y epigenéticas en el microambiente. Aquí, demostramos un nuevo método utilizando los especímenes quirúrgicos de los gliomas malignos, como bloques de tumor no disociadas para evaluar los efectos del tratamiento. Para validar este método, los datos actuales con los de primera línea agente quimioterapéutico, la temozolomida (TMZ), se describen. Se utilizó la pieza quirúrgica recién eliminado de los gliomas malignos para nuestros experimentos. Se realizó la inyección intratumoral de TMZ o candidatos de otras drogas, seguido de la incubación y el análisis de piezas quirúrgicas. En este caso, hemos tratado de establecer un método de tejido explante del tumor como una plataforma para determinar la eficacia de la novela de terapias contra el cáncer, para que podamos ser capaces de superar, al menos, algunas de las limitaciones actuales y salvar la brecha existente entre la corriente experimental datos y la eficacia en tumor de un paciente real. Este método puede tener el potencial para acelerar la identificación de nuevos agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de cánceres sólidos.

En este caso, hemos establecido un método para la prueba de eficacia del fármaco con la pieza quirúrgica de los tumores cerebrales, llamado &quot;método de explante del tumor&quot;. Con este método, podemos evaluar la eficacia del medicamento sin romper el microambiente de los tumores sólidos. Para validar la fiabilidad de este método, se describen los datos representativos de nuestra muestra de glioma tratadas con la actual primera línea del agente quimioterapéutico, la temozolomida.

Método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas

Las terapias actuales para el glioma maligno tienen únicamente un efecto paliativo. Para el desarrollo terapéutico, un obstáculo es la discrepancia de la eficacia determinada ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un método novedoso para la evaluación de la eficacia de fármacos con especímenes quirúrgicos de tumores cerebrales denominado método tumor X explante. Esto se logra primero asegurando especímenes quirúrgicos recién extraídos de gliomas malignos durante la cirugía para experimentos preclínicos. A continuación, las muestras se transportan al centro de obtención de tejidos para separarlas con fines de diagnóstico clínico e investigación.Luego, en el laboratorio de investigación, los explantes tumorales se disecan en múltiples tejidos más pequeños y se transfieren a un medio optimizado. Finalmente, se realizan inyecciones intratumorales con candidatos a fármacos y los explantes se incuban durante 16 horas. En última instancia, se pueden obtener resultados que revelan la eficacia del tratamiento mediante tinción con hematina y ein, así como inmunohistoquímica con marcadores específicos de tipo celular.También podemos evaluar la eficacia de los fármacos in vitro mediante citometría de flujo y ensayos de formación de neuroesferas. La mayoría de los ensayos actuales de eficacia de fármacos dejan una brecha entre la eficacia del fármaco en los modelos experimentales preclínicos actuales y la eficacia en pacientes hospitalizados. En particular, cuando probamos candidatos a fármacos en cánceres sólidos como los gliomas malignos, no podemos subestimar los intercambios de señales intercelulares e intracelulares.Con el fin de evitar alterar el microentorno de los tumores sólidos, establecimos un método de cultivo anty con nuestro explante tumoral. Después de que los tumores son extraídos de los pacientes, las muestras se transfieren desde o hacia el Departamento de Patología; dividimos los fragmentos tumorales en dos partes. Una parte de la muestra tumoral se utiliza para seccionado por congelación e inclusión en parafina para el diagnóstico clínico, y el resto del tejido tumoral se envía a los laboratorios de investigación para ser utilizado por los investigadores.Mediante este método, podemos preservar el microambiente del tumor junto con las células endoteliales tumorales adyacentes y las células inmunitarias, así como las células cerebrales normales que rodean el tumor o migran hacia las cavidades tumorales. Antes de procesar el tejido de glioblastoma, prepare soluciones líquida, de medio y de agar. Mézclelas en una proporción uno a uno.Luego, agregue un mililitro a cada pocillo de placas de seis pocillos. Después de recibir el tejido fresco de glioblastoma multiforme, transfiéralo a una placa de Petri utilizando pinzas y láveselo cuidadosamente tres veces con cinco mililitros de PBS frío al hielo al 1x con la hoja quirúrgica y pinzas. Corte secciones seriadas de aproximadamente 10 milímetros de diámetro de las muestras diseccionadas para crear bloques tumorales, transfiera cada bloque a un pocillo de la placa de seis pocillos que contenga medio de agar, permitiendo que tenga suficiente exposición al aire para mantenerlo viable.A continuación, utilizando una jeringa de insulina de un mililitro y una aguja de 28 gauge y media pulgada, inyecte los bloques tumorales tres veces con DMSO al 5 % o con temozolomida a 2,5 nanomolar o con un nuevo candidato a fármaco anticancerígeno e incube durante 16 horas a 37 grados Celsius en aire humidificado que contenga 5 % de dióxido de carbono. Tras la incubación, lave los bloques tres veces con cinco mililitros de PBS al 1×. Luego, en tubos de 50 mililitros, fije los bloques con 10 mililitros de paraformaldehído al 10 % volumen/volumen durante 24 horas.Incrustar el tejido en parafina y cortar secciones de cuatro micrones para desparafinar, desanizar y rehidratar las secciones. Colocar los portaobjetos en una gradilla e incubarlos en las siguientes soluciones. Silene tres veces durante cinco minutos cada una.Etileno al 100 % tres veces durante cinco minutos cada vez. Etanol al 95 % una vez durante cinco minutos y etanol al 70 % una vez durante cinco minutos. Finalmente, enjuague con agua corriente durante tres minutos.Consulte el protocolo escrito adjunto para obtener detalles sobre la recuperación de antígenos y la inhibición de la peroxidasa interna. Para bloquear las secciones, cubra los tejidos con suero de cabra normal al 10 %, transfiera las laminillas a una caja húmeda e incube durante una hora a temperatura ambiente. Lave las laminillas tres veces con PBS al 1×, cinco minutos cada vez.A continuación, agregue anticuerpos primarios, como caspasa tres específica para humanos o KI 67, diluidos en PBS al uno por uno, e incube toda la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Enjuague los portaobjetos en PBS al uno por uno, tres veces, durante 10 minutos cada vez. A continuación, cubra los tejidos con dos o tres gotas de anticuerpo secundario marcado con HRP.Coloque los portaobjetos en una caja húmeda e incube durante una hora a temperatura ambiente. Lave con PBS 1X tres veces durante cinco minutos cada vez. Revele las muestras utilizando un kit de cromógeno DAB siguiendo las instrucciones del fabricante para la contratincción.Sumerja las laminillas en hematina durante 10 a 15 segundos. Luego enjuague con agua corriente del grifo durante tres minutos. Deshidrate las muestras sumergiendo las laminillas en las siguientes soluciones en un reactivo de montaje y un cubreobjetos.Luego, utilice un microscopio de fluorescencia para obtener imágenes de los portaobjetos. La imagen de resonancia magnética ponderada en T1 con realce mediante gadolinio en esta figura muestra un tumor de glioblastoma multiforme o GBM realzado en el lóbulo frontal derecho de un paciente antes de la cirugía. La imagen posoperatoria confirmó la resección subtotal de la lesión tras la intervención quirúrgica.La tinción con hematoxilina y eosina demuestra la presencia de necrosis, células en pseudo palizada y proliferación microvascular. Por lo tanto, estos tumores fueron diagnosticados histopatológicamente como GBM para investigar si estas muestras de explantes tumorales podrían utilizarse de manera confiable. Con el fin de realizar una prueba de eficacia del fármaco, evaluamos el efecto del fármaco temozolomida o TMZ; la inmunohistoquímica de tejidos de GBM tratados con TMZ demuestra una reducción sustancial de células tumorales positivas para KI 67 en comparación con las muestras control.Por otro lado, la inmunohistoquímica con un marcador de apoptosis, la caspasa tres, no mostró ninguna diferencia significativa entre las muestras de glioma tratadas con TMZ y las muestras de control. El efecto del tratamiento con temozolomida puede caracterizarse más a fondo combinando este ensayo ex explan con cultivo in vitro o citometría de flujo. Podemos comparar este método ex explan con el trasplante de xenoinjertos y el ensayo de formación de esferoides in vitro para la selección de nuevos agentes anticancerígenos.Una vez que se obtienen los tejidos tumorales en el laboratorio, el procedimiento para este experimento puede completarse en menos de una hora. Este nuevo ensayo es relativamente fácil de realizar y reproducible tras la disociación de los implantes tumorales tratados. Podemos combinarlo con experimentos in vitro.Una ventaja importante de este ensayo es que conserva el microambiente tumoral. Obtenemos datos positivos con explantes tumorales tratados con Temodar, que fueron consistentes con el resultado de los mismos pacientes que recibieron tratamiento con Temodar tras las cirugías. Por último, esto es aplicable a otros cánceres sólidos y, por lo tanto, podría tener el potencial de acelerar la identificación de nuevos agentes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer sólido.

method-for-novel-anti-cancer-drug-development-using-tumor-explants

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo muestra una técnica para estudiar la localización in vivo de anticuerpos específicos de tumor en un modelo de xenoinjerto tumoral de ratón. Al inyectar células cancerosas por vía subcutánea en ratones para la formación de tumores, se inyectan anticuerpos marcados con fluorescencia que se unen a los receptores específicos del tumor, lo que permite la evaluación in vivo de la localización de anticuerpos mediante imágenes.

Una técnica para evaluar la localización in vivo de anticuerpos específicos contra tumores

Este video muestra una técnica de localización de inmunofluorescencia (IVIL) in vivo para estudiar la biodistribución de anticuerpos dirigidos al tumor en un modelo murino de cáncer de mama. Tras la inyección intravenosa de un anticuerpo específico del tumor en el ratón, el tumor se aísla quirúrgicamente y la localización del anticuerpo dentro del tejido tumoral se confirma mediante inmunotinción ex vivo.

Un método de localización de inmunofluorescencia in vivo para estudiar la biodistribución de anticuerpos

Establecido líneas celulares de cáncer y xenoinjertos han sido el pilar de la investigación del cáncer durante las últimas décadas. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que la respuesta terapéutica está fuertemente influenciado por el microambiente de las células tumorales. Por lo tanto, hemos desarrollado un análisis ex vivo de las muestras de tumor primario con fines de desarrollo de fármacos.

Ex Vivo respuesta al tratamiento de los tumores primarios y / o Asociados Metástasis de Preclínica y Desarrollo Clínico de Terapéutica

La utilización de los tumores derivados del paciente en un modelo preclínico subcutánea es una manera excelente para estudiar la eficacia de nuevas terapias, el descubrimiento de biomarcadores predictivos y vías resistentes a los fármacos. Este modelo, en el proceso de desarrollo de fármacos, es fundamental para determinar el destino de muchas nuevas terapias contra el cáncer antes de la investigación clínica.

Desarrollo y mantenimiento de un tumor del paciente preclínicos Derivado modelo de xenoinjerto para la Investigación de Novela Anti-Cancer Therapies

Describimos un protocolo detallado para el aislamiento de células que inician tumores de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma humano mediante la clasificación celular activada por fluorescencia, utilizando el antígeno leucocito humano-1 (HLA-1) como marcador negativo, y para la validación y caracterización de estas células que inician tumores HLA-1 negativos.

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

Aquí, presentamos un protocolo utilizar inyección guiada por ultrasonido de las células de (ES) el sarcoma de Ewing y neuroblastoma (NB) (estableció líneas celulares y células tumorales derivados del paciente) en sitios biológicamente relevantes para crear modelos preclínicos fiables para el cáncer investigación.

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Nos proporcionan un método para la generación, cultivo y análisis sistemático de rebanadas organotypic derivadas de tumores de pulmón murino. También se describe cómo optimizar el grosor de corte y cómo seleccionar las concentraciones de la droga para el tratamiento de rodajas de tumor.

Establecimiento y análisis de segmento de Tumor explantes como prerrequisito para la prueba de diagnóstico

El método de localización de inmunofluorescencia in vivo (IVIL) se puede utilizar para examinar la biodistribución in vivo de anticuerpos y conjugados de anticuerpos con fines oncológicos en organismos vivos utilizando una combinación de segmentación tumoral in vivo e inmunostainización ex vivo Métodos.

Localización de Inmunofluorescencia In Vivo para la Evaluación de la Biodistribución de Anticuerpos Terapéuticos y Diagnóstico en la Investigación del Cáncer

Aquí presentamos un protocolo para estudiar la localización in vivo de anticuerpos en modelos de xenoinjertos tumorales en ratones.

Análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) y los modelos de ratón genéticamente modificados trasplantables recapitulan fielmente la enfermedad humana y son modelos preferidos para la investigación básica y traslacional del cáncer de mama. Aquí, se describe un método para trasplantar ortotópicamente fragmentos de tumores de mama en la almohadilla de grasa mamaria para estudiar la biología del tumor y evaluar la respuesta al fármaco.

Trasplante ortotópico de tumores de mama como modelos preclínicos para el cáncer de mama

Este artículo describe métodos para la generación, el tratamiento farmacológico y el análisis de explantes derivados del paciente para evaluar las respuestas a los medicamentos tumorales en un sistema modelo preclínico vivo, relevante para el paciente.

Explantes de tumores derivados de pacientes como una plataforma preclínica "viva" para predecir la resistencia a los medicamentos en pacientes

Aprende a evaluar la eficacia de fármacos en gliomas malignos utilizando el método de explantes tumorales de muestras quirúrgicas. Esta técnica preserva el microambiente tumoral para obtener resultados más relevantes en oncología.

Método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas

Explorar más videos