Name: Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 15 s
Description: Aprende a analizar células inmunes en aortas murinas mediante citometría de flujo. Este método permite caracterizar leucocitos infiltrantes y estudiar la inflamación vascular en aterosclerosis.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención: PO1 HL55798 (a KL) y la American Heart Association de Desarrollo Científico subvención 0525532U (a EG).

<ol><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li>
<li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+in+atherosclerosis%3A+a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+influx+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Leukocyte influx in atherosclerosis.</a> Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).</li>
<li>Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+atherosclerotic+plaque+cells+from+human+carotids%3A+a+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study.</a> Cytometry. 39, 158-165 (2000).</li>
<li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+%22mock%22+FL3+channel+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li>
<li>Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).</li>
<li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li>
<li>Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+interleukin-17A+results+in+reduced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circulation. 121, 1746-1755 (2010).</li>
<li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li>
</ol>

A continuación, presentamos un método de la citometría de flujo basado en la investigación de la composición de las células inmunes de aortas murino. La principal ventaja de este método es la capacidad de analizar la aorta células del sistema inmune en un nivel de células individuales y para caracterizar el estado de activación de los leucocitos aórtica. Este método no se limita a aortas murino y nosotros (datos no publicados) y otras 10 personas utiliza este enfoque para analizar las muestras humanas, como l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material </td><td> Número de catálogo </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> Colagenasa XI </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Hialuronidasa </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNasa I, tipo 2 </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Colagenasa I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Colagenasa II </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Biochemical Corp. </td></tr><tr><td> Elastasa </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Biochemical Corp. </td></tr></tbody></table>

análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

La aterosclerosis es un proceso inflamatorio crónico de los barcos de tamaño medio y grande que se caracteriza por la formación de placas consiste en células espumosas, células del sistema inmune, las células vasculares endoteliales y de músculo liso, plaquetas, la matriz extracelular, y un núcleo rico en lípidos, con extensa necrosis y fibrosis de los tejidos circundantes. 1 Los brazos innata y adaptativa de la respuesta inmune están implicados en la iniciación, desarrollo y la persistencia de la aterosclerosis. 2, 3 hay un importante cuerpo de evidencia de que los diferentes subconjuntos de las células inmunes, como los macrófagos, dendríticas las células, los linfocitos T y B, están presentes en las aortas de los ratones sanos y con tendencia aterosclerosis-4. Además, las células inmunes se encuentran en la adventicia aórtica rodea lo que sugiere un papel importante de este tejido en la aterogénesis. 2 Desde hace algún tiempo, la detección cuantitativa de los diferentes tipos de células del sistema inmune, su estado de activación, y la composición celular dentro de la pared de la aorta se vio limitada por RT-PCR y los métodos de inmunohistoquímica para el estudio de la aterosclerosis. Pocos intentos se hicieron para realizar citometría de flujo utilizando aortas humanos, y una serie de problemas, tales como una alta autofluorescencia, se han reportado 5,6. Las placas ateroscleróticas humanas fueron digeridos con colagenasa 1, y se recogieron las células libres y se tiñeron de CD14 + / + CD11c para destacar derivada de macrófagos en células espumosas. En este estudio, un &quot;simulacro&quot; de canal se utiliza para evitar falsos positivos tinción. 6 material necrótico acumulado durante el proceso de digestión dar lugar a una gran cantidad de desechos que genera una alta autofluorescencia en las muestras de la aorta. Para resolver este problema, un panel de controles positivos y negativos se ha propuesto, pero sólo la doble tinción se podría aplicar en estas muestras. Hemos desarrollado un nuevo flujo de citometría basado en el método 7 para analizar la composición de las células inmunitarias y caracterizar la activación, proliferación, diferenciación de las células inmunes en aorta sana y propenso aterosclerosis. Este método permite la investigación de la composición de las células inmunes de la pared aórtica y abre la posibilidad de utilizar una amplia gama de métodos inmunológicos para la investigación de los aspectos inmunológicos de la enfermedad.

Este trabajo presenta una citometría de flujo basado en el método para investigar la composición inmunológica de aortas. El documento también muestra una técnica adicional que permite examinar los alrededores y adventicia pared de los vasos por separado. Este método abre la posibilidad de realizar análisis fenotípico de los leucocitos aórtica y aplicar varios ensayos inmunológicos para los estudios de la aterosclerosis.

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

La aterosclerosis es un proceso inflamatorio crónico de los vasos de mediano y gran tamaño que se caracteriza por la formación de placas compuestas por células espumosas...

El objetivo principal del siguiente experimento es caracterizar la composición y el fenotipo de los leucocitos infiltrantes en la aorta y la adventicia mediante citometría de flujo. Esto se logra primero aislado una aorta aterosclerótica como segundo paso. La adventicia circundante se aísla de la aorta y se preparan suspensiones de células individuales a partir de ambos tejidos.A continuación, se obtienen suspensiones individuales de células marcadas con fluorescencia para diferenciar subpoblaciones específicas de leucocitos a partir del tejido adventicial y de la pared aórtica, cuyos resultados muestran la diversidad de los leucocitos que infiltran la aorta durante la aterogénesis y la viabilidad de aislar los leucocitos del tejido adventicial aórtico mediante análisis citométrico de flujo de suspensiones de células individuales. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunohistoquímica es que los leucocitos pueden examinarse y fenotiparse utilizando múltiples marcadores a partir de una sola aorta. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los mediadores celulares de la inflamación en la patogénesis de la aterosclerosis y otros trastornos inflamatorios vasculares.La identificación de leucocitos aórticos y la caracterización fenotípica de mediadores existentes y nuevos de la inflamación ayudarán a comprender los mecanismos de la aterosclerosis. Coloque un tubo de recolección vacío para la sangre y un tubo de recolección que contenga PBS sobre hielo. Para cada aorta que se vaya a recolectar, sumerja brevemente un ratón sacrificado con etanol al 70 % y sujete el ratón a una plataforma de disección utilizando cinta adhesiva de laboratorio.Luego, utilizando una jeringa heparinizada, extraiga sangre del ratón mediante punción cardíaca. Abra las cavidades abdominal y torácica con un par de tijeras de disección y, con una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 25, perfunda completamente la vasculatura con PBS que contenga heparina al 2%. A continuación, diseque y retire los órganos viscerales, los órganos genitourinarios, el diafragma y el bazo, dejando intactos el riñón, el corazón y la aorta.Asegúrese de que no haya sangre dentro de los tejidos aórticos. Diseque cuidadosamente los tejidos adiposos y los ganglios linfáticos paraaórticos de la aorta, dejando intacta la aorta y la adventicia. Luego recoja toda la aorta, incluyendo el arco aórtico y las porciones descendente, torácica descendente y abdominal.Coloque la aorta aislada en un tubo de recolección con PBS. Retire el PBS del tubo de recolección que contiene la aorta. Añada 2.5 mililitros de solución enzimática de digestión de la adventicia aórtica al 1x a la aorta.Luego, incubar la aorta con la solución enzimática durante 10 a 20 minutos a 37 grados Celsius. Añadir PBS a una placa de Petri durante la incubación.Tras la incubación, transfiera la aorta parcialmente digerida desde la solución enzimática al recipiente de Petri con PBS con mucha precaución. Utilizando dos pares de pinzas curvas, desprenda la capa de tejido adventicial de la aorta como una unidad única.Una vez que se haya eliminado completamente la adventicia, transfiera la adventicia y la aorta a tubos de ensayo separados. A continuación, agregue 2,5 mililitros de una solución enzimática de disociación de aorta al 1x a la aorta y a la adventicia. La aorta puede cortarse en fragmentos más pequeños.Para facilitar la digestión enzimática, incubar la aorta y la adventicia durante otros 30 minutos a 37 grados Celsius. Tras esta incubación, colocar los tubos de tejido de aorta y adventicia sobre hielo. Preparar suspensiones de células individuales a partir de la aorta y la adventicia utilizando filtros celulares de 70 micrones y émbolos de jeringa para disgregar mecánicamente el tejido restante.Transfiera las suspensiones celulares a tubos Fax de polipropileno de cinco mililitros. Pellete las células mediante centrifugación durante cinco minutos a 400 veces la gravedad a cuatro grados Celsius. Resuspenda las células en un mililitro de tampón Fax y utilice azul de tripan y un hemocitómetro para contar las células.Dado que el tratamiento con enzimas podría afectar la expresión de los antígenos superficiales, incube pequeños fragmentos de bazo con o sin el cóctel de enzimas durante una hora a 37 grados Celsius. Tras una hora, confirma la ausencia de efecto sobre la expresión del antígeno superficial experimental mediante citometría de flujo.Etiquete un número adecuado de nuevos tubos de ensayo experimentales y de control. Añada los cócteles de anticuerpos experimentales y de control para los antígenos extracelulares deseados en un conjunto separado de tubos etiquetados. Coloque los tubos con los cócteles sobre hielo y cúbralos para proteger los fluoróforos de la luz.A continuación, transfiera un alícuota de cinco a ocho veces 10 a la cinco células aórticas y de la adventicia a los tubos FACS previamente etiquetados correspondientes. Añada un mililitro de tampón FACS a cada tubo y haga un pellet de las células mediante centrifugación. Retire el sobrenadante de las células en pellet por decantación para discriminar entre células vivas y muertas.Primero, se puede utilizar un kit de tinción de células muertas viables y fijables; prepare una solución 1X de viable-muerte agregando un microlitro de colorante viable-muerte reconstituido en un mililitro de PBS y mezcle mediante vortex. A continuación, añada de 100 a 200 microlitros de la solución 1X de colorante viable-muerte a los tubos de muestra experimentales y de control. Incube entonces las muestras con el colorante a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad.Incube el tubo de control único para la prueba de viabilidad celular a 56 grados Celsius en la oscuridad durante 10 minutos para matar las células mediante choque térmico. Tras la incubación, lave todas las células con un mililitro de PBS y forme el pellet celular por centrifugación. A continuación, lave las células añadiendo un mililitro de tampón fax a cada tubo.Vortexe los tubos para mezclarlos y luego pelete las células mediante centrifugación. Retire el sobrenadante de las células por decantación. Añada 100 microlitros de bloqueante FC.Añada tampón Fax a todos los tubos y vortexe suavemente los tubos para resuspender las células. Incube las muestras de 10 a 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, lave las células como antes.Retire el sobrenadante de las células mediante decantación. Añada 100 microlitros del cóctel de anticuerpos apropiado a los tubos correspondientes. Vortexee suavemente para resuspender.Suspenda el sedimento e incube todos los tubos durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, tras la tinción extracelular de 20 a 30 minutos. Lave las células dos veces como antes, deseche el sobrenadante y resuspenda las células sedimentadas en 300 microlitros de paraformaldehído al 2 % y analice las muestras en un citómetro de flujo. El TER uno 19 demuestra que los vasos digeridos, no la sangre periférica circulante, son la fuente de la mayoría de los leucocitos analizados en la suspensión celular aórtica.Los glóbulos rojos positivos para TER 1 1 9 representan el 18 % de las células en esta suspensión celular aórtica representativa. Esto indica que menos del 0,02 % de las células aisladas de suspensiones celulares aórticas derivan de la sangre. Se evaluaron los efectos de la mezcla enzimática de disociación de aorta sobre los antígenos de superficie celular. La mezcla enzimática no tiene efecto sobre la expresión de CD 45 o CD 19, como se observa aquí, ni sobre CD tres TCR, alfa beta TCR Gamma delta, y varios otros antígenos de superficie no mostrados en esta figura.En las siguientes figuras, se seleccionaron leucocitos vivos CD45 positivos de la aorta para determinar el porcentaje de linfocitos T positivos para interferón gamma dentro de la aorta de dos ratones jóvenes deficientes en lipoproteína APOE. Aquí, se muestran los perfiles de dispersión directa y dispersión interna de una aorta APOE representativa; para analizar únicamente leucocitos, solo se utilizó el antígeno leucocitario común CD45 para seleccionar los leucocitos aórticos, tal como se observa aquí. La pequeña población granular a lo largo del eje de dispersión lateral en el perfil de dispersión directa y lateral de los leucocitos aórticos que se ve en esta figura sugiere la presencia de células necróticas en nuestro análisis de leucocitos. Para eliminar estas células, se utilizó el marcador Live/Dead Aqua para seleccionar leucocitos viables, que representaron hasta el 30 % de la población representativa observada aquí en esta figura.La presencia de células pequeñas no granulares en el perfil de dispersión directa y lateral positivo para CD45 y negativo para viabilidad sugiere que aún hay fragmentos celulares presentes en la población positiva para CD45 y negativa para muerte celular. Se trazó una puerta poligonal en el gráfico de dispersión directa y lateral para incluir únicamente las células viables más grandes en el análisis, como se observa aquí. El examen de la población positiva para CD45, negativa para muerte celular y con dispersión directa y lateral para TCR alfa beta e interferón gamma revela que el 6 % de los leucocitos aórticos viables son células T helper 1 positivas para TCR alfa beta e interferón gamma, utilizando un esquema de selección similar al de la serie anterior de figuras. En las siguientes figuras se pueden observar datos representativos de tinción intracelular para macrófagos positivos para CD68 y CD11b, así como para células positivas para interferón gamma y TCR alfa beta procedentes de dos ratones APOE nulos alimentados con dieta occidental durante 12 semanas, tal como se esperaba, como se muestra en esta figura.La aorta de un ratón APOE nulo alimentado con dieta occidental. La mayoría de los leucocitos dentro de la aorta son macrófagos con doble positividad para CD68 y CD11B. Otras células mieloides positivas para CD11B representan el 15 % de las poblaciones de leucocitos aórticos dentro del bazo del mismo ratón APOE nulo alimentado con dieta occidental.El 7% de los citoes SP viables eran macrófagos positivos para CD11B y positivos para CD68, y el 10% eran otras células mieloides positivas para CD11B. En contraste, en esta figura de una muestra control de isotipo representativa y teñida de manera similar, solo el 0,01% de los citoes viables nulos para APOE resultaron falsamente positivos para el isotipo. Además, dentro de las 12 semanas en ratones nulos para APOE alimentados con dieta occidental, las células T helper positivas para TCR alfa, beta y negativas para interferón gamma, así como las células TH1 productoras de interferón gamma, constituyen una proporción importante de las poblaciones de células T infiltrantes aórticas y residentes esplénicas.Como se observa en este examen de la figura de aov, ninguna célula teñida con un control de isotipo sugiere que solo el 0,5 % de las células positivas para TCR alfa beta y positivas para interferón gamma son falsamente positivas para interferón gamma. Para demostrar la viabilidad del aislamiento de la adventicia aórtica para la tinción por citometría de flujo, aquí se muestran tinciones representativas de leucocitos positivos para CD45 en suspensiones celulares de tejido adventicial y aórtico. Los leucocitos infiltrantes positivos para CD45 representaron aproximadamente el 18 % de la suspensión celular adventicial y el 11 % de la suspensión celular aórtica. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener esos reactivos y las células en hielo y en la oscuridad, salvo que se indique lo contrario.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y preparar suspensiones de células individuales de la aorta y la adventicia aórtica para su uso en experimentos de citometría de flujo.

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Investigación

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