Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

El objetivo del siguiente experimento es caracterizar la composición y el fenotipo de los leucocitos infiltrantes aórticos y adventiciales mediante citometría de flujo. Esto se logra aislando primero una aorta aterosclerótica como segundo paso. La adventicia circundante se aísla de la aorta y se preparan suspensiones unicelulares a partir de ambos tejidos.

A continuación, se obtienen los resultados de las suspensiones unicelulares de leucocitos marcados con fluorescencia para diferenciar subconjuntos específicos de leucocitos del tejido de advenimiento y la pared aórtica que muestran la diversidad de leucocitos infiltrantes aórticos durante la aterogénesis y la viabilidad de aislar los leucocitos del tejido aórtico de advenimiento basándose en el análisis citométrico de flujo de suspensiones unicelulares. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la inmunohistoquímica, es que los leucocitos se pueden examinar y fenotipar utilizando múltiples marcadores de una sola aorta. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los mediadores celulares de la inflamación en la patogénesis de la aterosclerosis y otros trastornos inflamatorios vasculares.

La identificación de los leucocitos aórticos y la caracterización fenotípica de los mediadores existentes y nuevos de la inflamación ayudarán a analizar los mecanismos de la aterosclerosis. Coloque un tubo de recolección vacío para la sangre y un tubo de recolección que contenga PBS en hielo. Para cada aorta que se va a recolectar, remoje brevemente un ratón sacrificado con etanol al 70% y sujete el ratón a una etapa de disección con cinta de laboratorio.

Luego, usando una jeringa heparinizada, extraiga sangre del ratón a través de una punción cardíaca. Abra las cavidades abdominal y torácica con un par de tijeras de disección con una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 25 y perfunde completamente la vasculatura con PBS que contiene heparina al 2%. A continuación, diseccione y extirpe los órganos viscerales, los órganos urinarios genitales, el diafragma y el bazo, dejando intactos el corazón y la aorta del riñón.

Asegúrese de que no haya sangre dentro de los tejidos aórticos. Diseccionar cuidadosamente los tejidos adiposos y los ganglios linfáticos paraaórticos lejos de la aorta, dejando la aorta y la adventicia intactas. A continuación, recoge toda la aorta, incluido el arco aórtico y las porciones torácica y abdominal descendentes y descendentes.

Coloque la aorta aislada en un tubo de recolección con PBS. Retire el PBS del tubo colector que contiene la aorta. Agregue 2,5 mililitros de una solución enzimática de digestión de adventicia aórtica a la aorta.

Luego incube la aorta con la solución enzimática durante 10 a 20 minutos. A 37 grados centígrados. Agregue PBS a una placa de Petri durante la incubación.

Después de la incubación. Transfiera la aorta parcialmente digerida de la solución enzimática a la placa de Petri con el PBS con mucho cuidado. Con dos pares de pinzas curvas, retire la capa de tejido adventivo de la aorta como una sola unidad.

Cuando la adventicia se haya extirpado por completo, transfiera la adventicia y la aorta a tubos de fax separados. A continuación, añada 2,5 mililitros de una solución de enzima de disociación de la aorta a la aorta y a la adventicia. La aorta se puede cortar en pedazos más pequeños.

Para facilitar la digestión enzimática, incubar la aorta y la adventicia durante otros 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de esta incubación, coloque los tubos de tejido de aorta y advenimiento en hielo. Prepare suspensiones unicelulares de la aorta y la adventicia utilizando filtros de células de 70 micras y émbolos de jeringa para separar el tejido restante.

Transfiera las suspensiones de celdas a tubos de fax de polipropileno de cinco mililitros. Granular las células por centrifugación durante cinco minutos a 400 veces la gravedad a cuatro grados centígrados. Reese ha doblado las células en un mililitro de búfer de fax y ha utilizado trian blue y un hemocitómetro para contar las células.

Dado que el tratamiento enzimático puede afectar la expresión de antígenos de superficie. Incubar pequeños trozos de bazo con o sin el cóctel de enzimas durante una hora a 37 grados centígrados después de una hora. Confirmar la falta de efecto sobre la expresión experimental de antígeno de superficie mediante citometría de flujo.

Etiquete un número adecuado de nuevos tubos de fax experimentales y de control. Agregue los cócteles de anticuerpos experimentales y de control para los antígenos extracelulares deseados en un conjunto separado de tubos marcados. Coloque los tubos de cóctel sobre hielo y cúbralos para proteger los fluoróforos de la luz.

A continuación, transfiera una alícuota de cinco a ocho veces 10 a las cinco células aórticas y adventicias a los tubos de fax preetiquetados correspondientes. Agregue un mililitro de tampón de fax a cada tubo y granule las células por centrifugación. Retire el supan natante de las células peletizadas mediante decantación para discriminar entre células vivas y muertas.

Primero se puede usar un kit de tinción de células muertas vivas y reparables, cree una solución de muerte viva una vez agregando un microlitro de tinte de muerte viva redisuelto en un mililitro de PBS y vórtice para mezclar. A continuación, agregue de 100 a 200 microlitros de colorante muerto una vez vivo a los tubos de muestra experimentales y de control. A continuación, incubar las muestras a temperatura ambiente de la dieta durante 10 minutos en la oscuridad.

Incubar el único tubo de control para muertos vivos a 56 grados centígrados en la oscuridad durante 10 minutos para matar las células por choque de calor. Después de la incubación, lavar todas las células con un mililitro de PBS y granular las células por centrifugación. A continuación, lave las celdas añadiendo un mililitro de tampón de fax a cada tubo.

Vórtice de los tubos para mezclarlos y luego peletizar las células por centrifugación. Retire el supinato de las células mediante decantación. Añadir 100 microlitros de bloqueo FC.

Envíe un tampón por fax a todos los tubos y haga un vórtice suave de los tubos para resuspender las células. Incube las muestras durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, lave las células como antes.

Retirar el SUP natum de las celdas mediante decantación. Añadir 100 microlitros del cóctel de anticuerpos adecuado a sus tubos correspondientes. Suavemente vórtice para resus.

Suspenda el pellet e incube todos los tubos durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad después de la tinción extracelular de 20 a 30 minutos. Lave las células dos veces como antes, decante el sobrenadante y vuelva a suspender las células peletizadas en 300 microlitros de formaldehído al 2%Para, ejecute las muestras en una tinción con citómetro de flujo. El TER one 19 demuestra que los vasos digeridos que no circulan por sangre periférica son la fuente de la mayoría de los leucocitos analizados en la suspensión de células aórticas.

Los glóbulos rojos positivos TER 1 1 9 representan el 18% de las células de esta suspensión representativa de células aórticas. Esto indica que menos del 0,02% de las células aisladas de las suspensiones de células aórticas de la sangre derivaron de los efectos del cóctel de enzimas de disociación de la aorta sobre los antígenos de superficie de los citos. El cóctel de enzimas no tiene ningún efecto sobre la expresión de CD 45 o CD 19 como se ve aquí, así como CD tres TCR, alfa beta TCR Gamma delta y varios otros antígenos de superficie que no se muestran en esta figura.

En las siguientes figuras, se seleccionaron leucocitos aórticos vivos CD 45 positivos para determinar el porcentaje de células T positivas para interferón gamma dentro de la aorta pool de dos ratones jóvenes con deficiencia de lipoproteína e APO. Aquí, se muestran los perfiles de dispersión hacia adelante e hacia adentro de una aorta APOE representativa: para analizar leucocitos, solo se utilizó el antígeno leucocitario común CD 45 para caminar sobre leucocitos aórticos, como se ve aquí. La pequeña población granular a lo largo del eje de dispersión lateral en el perfil de dispersión frontal y lateral de los leucocitos aórticos que se observa en esta figura sugiere que las células necróticas están presentes en nuestra marcha de leucocitos para eliminar estas células muertas

La presencia de pequeñas células no granulares en el perfil de dispersión lateral y de muerte viva positiva CD 45 negativa, sugiere que los fragmentos celulares todavía están presentes en la marcha de CD 45 positivo, vivo, muerto, negativo. Se dibujó una puerta de dispersión poligonal del lado delantero para incluir solo las celdas viables más grandes en el análisis, como se ve aquí. El examen de la población de dispersión del lado frontal CD 45 positivo, muerto, negativo negativo para TCR alfa beta e interferón gamma revela que el 6% de los leucocitos aórticos vivos son células TCR alfa beta positivas, interferón gamma positivo T helper uno utilizando un esquema de compuerta similar al de la serie anterior de figuras, datos representativos de tinción intracelular para macrófagos CD 68 positivos para CD 11 B positivo e interferón gamma positivo TCR alfa beta positivo de células En las siguientes figuras se pueden ver dos ratones A P OE nulos alimentados con dieta occidental durante 12 semanas, como se esperaba como se ve en esta figura.

La aorta de una dieta occidental alimentada con ratón APOE nulo. La mayoría de los leucocitos dentro de la aorta son macrófagos con 40% de doble positividad para CD 68 y CD 11 B. Otras células mieloides CD 11 B positivas representan el 15% de las poblaciones de leucocitos aórticos dentro del bazo de la misma dieta occidental alimentada con ratón APOE nulo.

El 7% de los citos SP viables eran CD-11 B, macrófagos CD-68 positivos, y el 10%, otras células mieloides CD-11 B positivas. Por el contrario, en esta figura de una muestra de control de isotipo representativa teñida de manera similar, solo el 0,01% de los citos nulos APOE viables son falsamente positivos para el isotipo. Además, dentro de las 12 semanas en ratones APOE nulos, TCR alfa, células T auxiliares beta positivas de interferón gamma negativo y células TH productoras de interferón gamma comprenden una proporción importante de las poblaciones de células T infiltrantes aórticas y residentes esplénicas.

Como se ve en este examen de la figura de aov, ningún citador teñido con un control de isotipo sugiere que solo el 0,5% de las células TCR alfa beta positivas para interferón gamma son falsamente positivas para interferón gamma Para demostrar la viabilidad de aislar la adventicia aórtica para la tinción con citometría de flujo aquí, se muestra una tinción representativa de leucocitos CD 45 positivos para suspensiones de células de tejido aórtico y adventista. Los leucocitos CD 45 positivos infiltrantes representaron aproximadamente el 18% de la suspensión de células adventicias y el 11% de la suspensión de células aórticas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener esos reactivos y las células en hielo y en la oscuridad, a menos que se indique lo contrario.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar y preparar suspensiones de células individuales de la aorta y la adventicia aórtica o usarlas en experimentos de citometría de flujo.