La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el estado de los óvulos en metafase dos tras una manipulación experimental. Comience por recolectar ovocitos completamente desarrollados de hembras de ratón maduras sexualmente. Luego, microinyecte los ovocitos con el material de elección para alterar la proteína de interés y madure los ovocitos in vitro hasta la metafase de la meiosis dos. A continuación, estimule la dispersión cromosómica en el óvulo mediante tratamiento con mantro, lo que resulta en un huso monopolar.

En última instancia, estos resultados pueden mostrar el estado de ploidía del óvulo mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología reproductiva y la segregación cromosómica, como comprender los mecanismos moleculares que conducen a una fluidez. Una demostración visual de este método es fundamental, ya que la técnica de microinyección es difícil de aprender porque varios pasos son complicados de transmitir por escrito. Inyecte intraperitonealmente ratones hembra sexualmente maduras con cinco UI de gonadotropina sérica de hembra preñada para maximizar el número de folículos antrales aislados de cada ratón.

Aproximadamente 48 horas después de la inducción con PMSG, caliente tres mililitros por ratón de medio de recolección a 37 grados Celsius y equilibre. Un mililitro de medio de cultivo durante al menos una hora. Prepare microgotas de cada uno en una placa de Petri y cúbralas con aceite mineral.

Ahora coloque el plato con medio de cultivo en el incubador y el plato con medio de recolección sobre un calentador de portaobjetos. Sacrifique el ratón, diseccione los ovarios y colóquelos en un vaso de reloj que contenga medio de recolección precalentado.

Utilizando una jeringa de insulina de un mililitro, fije los ovarios al platillo y libere los folículos antrales perforándolos varias veces con agujas de calibre 27 sujetas juntas. Bajo un microscopio de disección, recoja los complejos cumulus-células ovocitarias mediante una pipeta de vidrio operada con la boca. Solo recoja folículos antrales grandes, no los folículos preantrales más pequeños ni los ovocitos desnudos.

Transfiera los complejos a una microgota de medio de recolección preparado con una micropipeta ligeramente más grande que el diámetro del ovocito. Separe las células del cumulus de los complejos. Transfiera los ovocitos desnudos con una pipeta más grande a una microgota de medio de cultivo.

Deje que los ovocitos se recuperen durante al menos una hora en el incubador antes de la manipulación. Prepare pipetas de inyección tirando de tubos capilares de vidrio de borosilicato en una micropipeteadora mecánica. Retire la cámara de medio de una placa de un pocillo.

Para crear una plataforma de microinyección, coloque una gota de cinco microlitros de medio de recolección lo más cerca posible de una gota de 0.5 microlitros de SIR N-A-C-R-N-A o material de inyección de oligonucleótidos morfolinos, cúbrala con aceite mineral y colóquela sobre la platina del microscopio. Coloque las pipetas de inyección y de sujeción en sus soportes y colóquelas dentro de la gota de medio de recolección. Encienda los tanques de nitrógeno conectados al picoinyector y a la mesa antivibraciones.

Abra la punta de la pipeta de inyección golpeándola suavemente contra la pipeta de sujeción mientras la llena con medio. Transfiera de cinco a diez sitios oh del incubador a la gota de medio de recolección sobre la plataforma. Ahora configure los parámetros del picoinyector para un volumen de inyección de cinco a diez picolitros mientras presiona limpiar.

Mueva la aguja de inyección hacia la gota de material y llénela. Regrésela a la gota de medio. Utilice la pipeta de sujeción para capturar un ovocito y alinear la aguja de inyección, el ovocito y la pipeta de sujeción a lo largo del eje x.

Con mayor aumento, avance la pipeta de inyección a través del ovocito, teniendo cuidado de evitar el núcleo. Una vez que se haya perforado la membrana plasmática, presione inyectar, retire la aguja después de la inyección, libere el ovocito y repita. Una vez que todos los ovocitos hayan sido inyectados, devuélvalos al incubador para mantenerlos en medio de cultivo durante el tiempo deseado, que generalmente oscila entre 12 y 24 horas.

Luego, lave los citos a través de varias gotas de CZB y transfiéralos a una microgota de CZB bajo aceite, e incube durante 16 horas para completar la maduración hasta la metafase de la meiosis II. Coloque 750 microlitros de CZB que contenga 100 micromoles por litro de Mastri en el pocillo de una placa de cultivo de órganos que tenga agua en el anillo externo. A continuación, lave los óvulos a través de varias gotas de CZB con Mastri y luego transfiéralos al pocillo de la placa de cultivo de órganos e incube durante una hora.

Fije los huevos en una cápsula de reloj que contenga paraformaldehído al 2% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera los huevos a la solución de bloqueo y almacénelos a cuatro grados Celsius hasta el procesamiento, permeabilizando los huevos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, enjuague con varios volúmenes grandes de solución de bloqueo.

Realice el resto del procedimiento sobre la tapa de una placa de 96 pocillos que esté protegida de la luz en una cámara humedecida. A temperatura ambiente, transfiera los huevos a gotas de 25 microlitros de solución bloqueante durante 15 minutos. Luego, para etiquetar los centrómeros, transfiera los huevos a una gota de solución bloqueante que contenga suero antisuero Crest a una dilución de uno a 40, e incube durante al menos una hora.

Luego, lave pasando tres gotas de solución bloqueadora, incubando 15 minutos en cada una. Transfiera los huevos a una gota de solución bloqueadora que contenga anticuerpo marcado con fluoro cuatro y incube durante una hora. Lave dos veces con solución bloqueadora para detectar los cromosomas.

Incubar en una dilución de uno a 5.000 de cytx green y solución de bloqueo. Montar las muestras en cinco microlitros de Vector Shield. Colocar cuatro pequeñas gotas de vaselina en las posiciones previstas para las esquinas del cubreobjetos para evitar la compresión de los huevos. Colocar el cubreobjetos y sellar con esmalte de uñas. Almacenar en una caja de portaobjetos a cuatro grados Celsius hasta su procesamiento mediante microscopía confocal. Durante la adquisición de imágenes con un objetivo de 100x, capturar pasos de 0,4 micrómetros en el plano Z e imaginar toda la región del conteo de centrómeros. Utilizar software de imagen como ImageJ del NIH. Los huevos de ratón euploides contienen 20 pares de cinetocoros, lo que da un total de 40 puntos en esta proyección en Z de un huevo en metafase II. El ADN se colorea en verde y los cinetocoros K se colorean en rojo.

Las flechas indican dos brazos cromatídicos distintos que muestran superposición en el cinetocoro número 17 y en el número 18, tras el procedimiento de microinyección. Otros métodos como la transferencia Western, la PCR en tiempo real, la configuración del huso mitótico, la evaluación del alineamiento cromosómico y la fertilización in vitro pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como cómo la perturbación de su proteína de interés afecta la maduración meiótica y el potencial de desarrollo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular sitios específicos y evaluar el PLO de la metafase dos X.