Name: La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende microinyección de ovocitos de ratón para evaluar la ploidía en metafase II mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal. Este método permite estudiar la biología reproductiva y los mecanismos de segregación cromosómica.

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Este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de Richard M. Schultz &#39;s. Los autores también desean agradecer a Michael Lampson para la conceptualización de la prueba de recuento de centrómero y el acceso a su microscopio confocal. Teresa Chiang y Duncan Francesca ayuda en la optimización de la prueba de recuento de centrómero. Paula Stein con el apoyo de HD022681 (a RMS) y Karen Schindler con el apoyo de HD055822.

1. Recogida de ovocitos de ratón <ol><li> Para maximizar el número de folículos antrales aislado de cada ratón, por vía intraperitoneal se inyectan ratones hembras sexualmente maduras (usamos 6 semanas de edad ratones CF-1 de Harlan) con 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG). </li><li> Preparar el medio de recolección (MEM / PVP) (3 ml / ratón) mediante la adición de milrinona a 2,5 M y calentarlo a 37 º C. La milrinona es un inhibidor de la fosfodiesterasa, que mantiene una detención meiótica de ovocitos se extraen de los folículos. Por otra parte, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (0,2 mM) o dibutiril-monofosfato cíclico de adenosina (dbcAMP) (100 mg / ml) se puede utilizar. Preparar el medio de cultivo mediante la adición de glutamina (1 mM) y milrinona (2,5 M) a 1 ml de CZB y deje que se equilibre en la incubadora por lo menos una hora. Establecer las microgotas de cada uno en una placa de Petri y la superposición con aceite mineral. El plato CZB se coloca en la incubadora, mientras que el plato MEM / PVP queda fuera de una diapositiva más cálido. Otra colección y medio de cultivo que están disponibles en el mercado (M2 y M16 de soportes especiales o Sigma) también se utilizan habitualmente. </li><li> Aproximadamente 48 horas después de la PMSG cebado, el sacrificio del ratón usando CO 2 sedación seguido por dislocación cervical, disección de los ovarios y los situará en un vidrio de reloj que contiene pre-calentado MEM / PVP + milrinona (MEM / PVP + M). </li><li> Con una jeringa de insulina de 1 ml, de anclaje de los ovarios al plato y la liberación de los folículos antrales por punción de ellos en varias ocasiones con el de calibre 27 (o de coser) agujas que se unen entre sí. </li><li> Mientras mira a través de un microscopio de disección, recoger cumulus-ovocito complejos usando una pipeta de boca de cristal. Es útil contar con un microscopio con mucho contraste. Como alternativa, el medio que contiene el tejido y las células pueden ser una pipeta a una tapa de una placa Petri de plástico. Sólo recogemos los folículos grandes antral y no menor pre-antral folículos o oocitos desnudos. Una vez recogidos, la transferencia de los complejos de una microgota de MEM / PVP + M que se encuentra en la diapositiva más caliente y con aceite. </li><li> Con una pipeta pequeña (poco más grande que el diámetro de los ovocitos), pipeta de arriba y abajo de los complejos de separar las células del cúmulo. La transferencia de los ovocitos denudados con una pipeta más grande en una microgota de CZB + milrinona (CZB + M) y el lugar en la incubadora. </li><li> Permita que los ovocitos para recuperar por lo menos durante 1 h en la incubadora antes de la manipulación. </li></ol> 2. Microinyección de ovocitos <ol><li> Hacer pipetas de inyección tirando de vidrio borosilicato tubo capilar en un extractor mecánico. Utilizamos un Flaming-Brown micropipeta extractor (Modelo P-97) con los siguientes valores: P = 500, Heat = 300, = 150 Tire, Vel = 100, Tiempo = 150. </li><li> Preparar la plataforma de microinyección mediante la colocación de una caída de 5 l de MEM / PVP + M lo más cerca posible a una caída de 0,5 l de inyección de material de elección (siRNA, por ejemplo, cRNA, oligonucleótidos morfolino, etc) en un portaobjetos de la cámara de 1-bien que tiene la cámara de los medios de comunicación eliminado. Cubrir con aceite mineral y el lugar en la platina del microscopio (Fig. 1). </li><li> Lugar de la inyección y pipetas de explotación en los titulares y la posición en la caída del MEM / PVP + M. A su vez en los tanques de nitrógeno que están conectados a la mesa de picoinjector y anti-vibración. Abrir la punta de la pipeta de inyección de él con cuidado golpeando contra la pipeta de sujeción, mientras que el llenado con el medio. Si la abertura es demasiado grande, el medio se mueven dentro y fuera de forma rápida y la aguja va a matar la célula. Pipetas con demasiado pequeño de una apertura con frecuencia se obstruyen fácilmente. </li><li> Transferencia de ovocitos (5-10) de la incubadora para el MEM / PVP + M caída en la plataforma. Antes de inyectar, la configuración de la picoinjector. Nosotros utilizamos los siguientes parámetros en nuestro picoinjector (PLI-100 Modelo de Harvard Apparatus): PBal = 2.5-3.5 psi, PInj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi, tiempo = 3s. Esto se traduce en un volumen de inyección de 5-10 pL. </li><li> Mientras presiona CLEAR, mover la aguja de la inyección a la caída de materiales y relleno. Volver a la caída de mediano plazo. </li><li> Use la pipeta de sujeción a la captura de un ovocito y alinear la aguja de inyección, óvulos y pipeta de sujeción a lo largo del eje-x. </li><li> A mayor aumento, el avance de la pipeta de inyección a través de los ovocitos con cuidado para evitar que el núcleo. Una vez que la membrana plasmática se perfora, pulse la inyección. Después de la inyección, retire la aguja. Liberación del ovocito y repetir. Una vez que todos los ovocitos se inyectan, a volver a la incubadora. Mantenga en CZB + M para la cantidad de tiempo deseado, y esta vez depende de la finalidad experimental (siRNA es decir, caída y morfolino (hasta 24 h), la sobreexpresión (03.12 h)). Tenga en cuenta que las incubaciones más de 24 horas pondrá en peligro la maduración meiótica. </li></ol> 3. Maduración de ovocitos <ol><li> Después de incubación, lavar los ovocitos a través de varias gotas de CZB (medio de maduración) y traslado a una microgota de medio de maduración con aceite y colocar en la incubadora. </li><li> Permita 16 horas para completar la maduración de t o metafase de la meiosis II. </li></ol> 4. Ploidía análisis <ol><li> Prepare CZB + monastrol (100 M) y el lugar 750 l en el pozo de una placa de cultivo de órganos que tiene el agua en el anillo exterior. </li><li> Lavar los huevos a través de varias gotas de CZB + monastrol y transferirlos a la placa de cultivo de órganos. Lugar en la incubadora durante 1 h. </li><li> Fijar los huevos, transfiriéndolos a un vidrio de reloj que contiene 2% de paraformaldehído en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Transferencia a otro vidrio de reloj con solución de bloqueo. Este plato se puede almacenar a 4 ° C hasta su transformación. </li><li> Traslado a la solución de permeabilización (PBS + 0,3% BSA + TritonX-100 0,1% + 0,02% NaN 3) en un vidrio de reloj durante 15 minutos a temperatura ambiente. Enjuague a través de varios grandes volúmenes de solución de bloqueo (PBS + 0,3% BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN 3). </li><li> El resto del procedimiento se realiza en la tapa de una placa de 96 pozos en una cámara húmeda a temperatura ambiente protegido de la luz. Las gotas (~ 25 l) se colocan dentro de las hendiduras circulares. Transferencia de huevos a la solución de bloqueo durante 15 minutos. </li><li> Los centrómeros etiqueta, los huevos de transferencia a una gota de solución de bloqueo que contienen CREST anti-suero a las 1:40. Incubar durante al menos 1 h. Lavar a 3 gotas de solución de bloqueo, incubación de 15 minutos cada uno. </li><li> La transferencia de los huevos de una gota de solución de bloqueo que contienen-o Cy5 Alexa-flúor-594-conjugado anti-IgG humana (1:200) y se incuba durante 1 hora. Repita la limpieza de los pasos que el anterior excepto para el último paso, incluyen Sytox Verde (1:5000) en la solución de bloqueo para detectar los cromosomas. Montaje en 5 l de Vectashield. Para evitar el aplastamiento de los huevos, poner 4 puntos poco de vaselina en las esquinas del lugar donde el cubreobjetos se. Coloque un cubreobjetos encima y sellar con esmalte de uñas. Conservar en una caja de diapositivas a 4 ° C hasta su procesamiento a través de microscopía confocal. </li><li> Mientras que las imágenes con un objetivo de 100X, la captura de 0,4 micras medidas en el plano Z y la imagen de toda la región del eje de la metafase. Conde centrómeros utilizando el software de imagen como Image J (NIH). </li></ol> 5. Los resultados representativos: La figura 2 es una proyección de Z-de un huevo euploides. En la metafase de la MII, los huevos euploides ratón contienen 20 pares de cromosomas y por lo tanto tiene 40 centrómeros. De vez en cuando los cromosomas no difundir a pesar del tratamiento monastrol. Esta situación hace que sea difícil contar con fiabilidad los centrómeros y por lo tanto, no incluyen los huevos en nuestros análisis. En ocasiones, puede ser difícil determinar si un CREST-inmunorreactiva "spot" es de 1 o 2 centrómeros. El uso de programas tales como J de la imagen es útil porque se puede analizar cada sección Z, mientras que observando cuidadosamente la orientación de los cromosomas, el número de secciones en las que se detecta un "punto" y la intensidad de los píxeles de la "spots" tiene. Dependiendo de donde el huso meiótico se posiciona en relación con el cuerpo polar, las regiones de ADN se pueden superponer y estas muestras no deben ser incluidos en el análisis. No manipulado, en vivo huevos ovularon de ratones jóvenes reproductivamente tienen bajas tasas de aneuploidía (~ 1.2%). Sin embargo, por razones que no entiende, la microinyección y en los procedimientos de maduración in vitro puede aumentar este índice al alza de 10%. Por lo tanto, es fundamental que los ovocitos control inyectados están incluidos en cualquier estudio de microinyección. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Plato microinyección establecido. Una diapositiva de cámara con 5 gotas de l MEM / PVP + M justo por encima de las gotas 0.5μl de solución inyectable. Cubrir con aceite mineral. En este ejemplo hay 3 gotas de tres soluciones diferentes de inyección y la tapa está sentado en el escenario de un microscopio. A la izquierda está la aguja de microinyección y la derecha es la pipeta de sujeción. Tenga en cuenta que no es un reflejo de los titulares de la aguja. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Los resultados de ploidía. A a la Z-proyección de un huevo euploides metafase II. ADN es de color verde y cinetocoros son de color rojo. Las flechas apuntan a dos armas distintas de cromátidas que indica que cinetocoros (# 17 y # 18) se superponen. Huevos euploides ratón contienen 20 pares cinetocoro (40 en total "spots"). Un huevo aneuploides contener cualquier variación en este número. Si este procedimiento se llevó a cabo en metafase MI, habría 40 pares cinetocoro (80 total de "puntos"). <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tabla 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabla 1"> Tabla 1. Receta para el medio de recolección y la microinyección (MEM / PVP + M). Todos los materiales son embrión de la cultura y el grado de Sigma-Aldrich. Filtro de esterilización a través de filtros de 0.22μm PVDF (usamos Stericups miliporo) y almacenar a 4 ° C. iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg "alt =" Tabla 2 "/&gt; Tabla 2. Receta para el medio CZB. Todos los materiales son embrión de la cultura y el grado de Sigma-Aldrich. Filtro de esterilización a través de filtros de 0.22μm PVDF (usamos Stericups miliporo) y almacenar a 4 ° C.

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</ol>

Microinyección de ovocitos es un poderoso método para estudiar los mecanismos que regulan la maduración meiótica 10,11, 12, 13. Este método ofrece una forma económica de probar las hipótesis antes de hacer una gran inversión en el desarrollo de modelos de ratones transgénicos y de destino. Recolección de los ovocitos y las técnicas de microinyección requieren más tiempo para dominar a los procedimientos típicos de la biología celular. Obstáculos específicos con la colección a menudo incluyen el control de la pipeta de la boca, tirando de la pipeta de vidrio de tamaño adecuado para la recolección y extracción de las células somáticas y el aumento de la velocidad de recogida para reducir al mínimo el tiempo en que los ovocitos se encuentran fuera de la incubadora. Se recomienda la práctica muchas veces antes de hacer experimentos. La transferencia de ovocitos entre microgotas, manteniendo el mismo número de células es una buena manera de sentirse cómodo con este método. La muerte celular ocurre comúnmente mientras aprenden microinyección. Esto puede ocurrir por varias razones, incluyendo la inyección de demasiado grande de un volumen de material (es decir, la abertura de la aguja de la inyección es demasiado grande), alcanzando el núcleo con la aguja de inyección, la perforación del otro lado de los ovocitos o que el material inyectado es tóxico para el ovocito. Practicar con la inyección de buffer en oocitos hasta que su tasa de supervivencia es de al menos el 50% es la clave para dominar esta técnica. Si no maduran los ovocitos es probable que la milrinona no se diluye bastante. Se recomienda enjuagar los ovocitos a través de muchas gotas grandes de milrinona sin CZB antes de la maduración. La microinyección siguiente análisis de ploidía es uno de los muchos ensayos para evaluar la maduración meiótica. Otros análisis de rutina que utilizamos en el laboratorio incluyen el control de la cinética en la que el progreso a través de los ovocitos de la meiosis, la inmunofluorescencia para analizar la formación del huso y la alineación de los cromosomas y la activación del huevo o la fertilización in vitro para evaluar las consecuencias del desarrollo de la manipulación de los ovocitos 14,15, 16, 17.

Tabla de reactivos específicos: <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Milrinona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4659 </td><td> Resuspender en DMSO a 2,5 mm </td></tr><tr><td> De aceite mineral </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5310 </td><td> Sólo el uso de embriones a prueba, esterilizada por filtración </td></tr><tr><td> CREST autoserum </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox Verde </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano Alexa 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8515 </td><td> Resuspender en DMSO a 100 mM </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla de equipos específicos: <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del Equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Boquilla </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio de reloj </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> Jeringa </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1 ml, 27 G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 mm Petri </td><td> Halcón </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas Pasteur de vidrio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> Lado más caliente </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Disección microscopio </td><td></td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Cámara de diapositivas </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos capilares </td><td> Drummond </td><td> 1-000-0500 </td><td> Microcaps </td></tr><tr><td> Pipeta Extractor </td><td> Flaming-Brown micropipeta extractor </td><td></td><td> Modelo P-97 </td></tr><tr><td> Microscopio invertido </td><td> Nikon </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Micromanipuladores </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modelo PLI-100 </td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> CO 2 tanques </td><td></td><td></td><td> De la incubadora </td></tr><tr><td> N2 tanque </td><td></td><td></td><td> Para la tabla y el inyector </td></tr><tr><td> Anti-vibración de mesa </td><td> Producción técnica </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td></td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Pipetas de la celebración de </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Microscopio confocal </td><td> Leica </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Herramientas de disección </td><td> Herramientas de Bellas ciencia </td><td></td><td> Cualquier modelo estándar </td></tr><tr><td> Cámara húmeda </td><td></td><td></td><td> Usamos tupperware </td></tr><tr><td> Tapa de placa de 96 pocillos </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos de microscopio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Thomas científica </td><td> 6663-F10 </td><td> De espesor puede variar para los microscopios en particular </td></tr><tr><td> Centro de órganos y placa de cultivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15 mm </td></tr></tbody></table>

la microinyección de ovocitos de ratón, maduración y evaluación de ploidía

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Errores en la segregación cromosómica llevar a las células aneuploides. En las células somáticas, la aneuploidía se asocia con el cáncer, pero en los gametos, la aneuploidía lleva a la infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Gametos haploides forma a través de las especies-programas de desarrollo específicos que se acoplan a la meiosis. La primera división meiótica (MI) es único a la meiosis, porque las cromátidas hermanas permanecen unidas, mientras que los cromosomas homólogos se separan. Por razones que no se entiende, esta división reduccional es propenso a errores y es más común la fuente de aneuploidía que los errores en la meiosis II (MII), o que los errores en la meiosis masculina 1,2. En los mamíferos, la detención ovocitos en profase de la MI con una vesícula grande, intacto germinal (GV; núcleo) y sólo reanudar la meiosis cuando se reciben señales de la ovulación. Una vez que se reanuda la meiosis, MI ovocitos completo y someterse a una división celular asimétrica, a arrestar de nuevo en la metafase de MII. Los huevos no se completará hasta MII son fertilizados por el esperma. Los ovocitos también pueden someterse a la maduración meiótica utilizando establecido en las condiciones de cultivo in vitro 3. Ya que la generación de mutantes de ratones transgénicos y de genes específicos-es costoso y puede tomar mucho tiempo, la manipulación de los gametos femeninos in vitro es una estrategia más económica y de ahorro de tiempo. Aquí se describen los métodos para aislar la profase detenido de los ovocitos de ratón y de microinyección. Cualquier material de elección puede ser introducido en el óvulo, sino porque meiotically-competente ovocitos son transcriptionally silencio cRNA 4,5, y no el ADN, se debe inyectar para los estudios de la expresión ectópica. Para evaluar la ploidía, describimos nuestras condiciones para la maduración in vitro de ovocitos MII a los huevos. Históricamente, el cromosoma de propagación se utilizan técnicas para contar el número de cromosomas 6. Este método es técnicamente difícil y se limita a la identificación de hyperploidies. Aquí se describe un método para determinar la hipo y la hyperploidies con huevos intactos 7-8. Este método utiliza monastrol, un inhibidor de la kinesina-5, que se derrumba el huso bipolar en un huso monopolar 9 cromosomas separando así como que cinetocoros individuales pueden ser fácilmente detectados y contados mediante el uso de un suero anti-CREST autoinmunes. Debido a que este método se lleva a cabo en huevos intactos, los cromosomas no se pierden debido a errores del operador.

Los ovocitos son propensos a la aneuploidía debido a errores en la segregación cromosómica durante la maduración meiótica. Huevos aneuploides puede causar infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Aquí se describen los métodos para introducir los materiales de elección en los ovocitos y los métodos para estudiar la maduración meiótica y evaluar la ploidía.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Los errores en la segregación cromosómica dan lugar a células aneuploides. En las células somáticas, la aneuploidía se asocia con el cáncer, pero en los gametos, la aneuploidía conduce a...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el estado de los óvulos en metafase dos tras una manipulación experimental. Comience por recolectar ovocitos completamente desarrollados de hembras de ratón maduras sexualmente. Luego, microinyecte los ovocitos con el material de elección para alterar la proteína de interés y madure los ovocitos in vitro hasta la metafase de la meiosis dos. A continuación, estimule la dispersión cromosómica en el óvulo mediante tratamiento con mantro, lo que resulta en un huso monopolar.En última instancia, estos resultados pueden mostrar el estado de ploidía del óvulo mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología reproductiva y la segregación cromosómica, como comprender los mecanismos moleculares que conducen a una fluidez. Una demostración visual de este método es fundamental, ya que la técnica de microinyección es difícil de aprender porque varios pasos son complicados de transmitir por escrito. Inyecte intraperitonealmente ratones hembra sexualmente maduras con cinco UI de gonadotropina sérica de hembra preñada para maximizar el número de folículos antrales aislados de cada ratón.Aproximadamente 48 horas después de la inducción con PMSG, caliente tres mililitros por ratón de medio de recolección a 37 grados Celsius y equilibre. Un mililitro de medio de cultivo durante al menos una hora. Prepare microgotas de cada uno en una placa de Petri y cúbralas con aceite mineral.Ahora coloque el plato con medio de cultivo en el incubador y el plato con medio de recolección sobre un calentador de portaobjetos. Sacrifique el ratón, diseccione los ovarios y colóquelos en un vaso de reloj que contenga medio de recolección precalentado.Utilizando una jeringa de insulina de un mililitro, fije los ovarios al platillo y libere los folículos antrales perforándolos varias veces con agujas de calibre 27 sujetas juntas. Bajo un microscopio de disección, recoja los complejos cumulus-células ovocitarias mediante una pipeta de vidrio operada con la boca. Solo recoja folículos antrales grandes, no los folículos preantrales más pequeños ni los ovocitos desnudos.Transfiera los complejos a una microgota de medio de recolección preparado con una micropipeta ligeramente más grande que el diámetro del ovocito. Separe las células del cumulus de los complejos. Transfiera los ovocitos desnudos con una pipeta más grande a una microgota de medio de cultivo.Deje que los ovocitos se recuperen durante al menos una hora en el incubador antes de la manipulación. Prepare pipetas de inyección tirando de tubos capilares de vidrio de borosilicato en una micropipeteadora mecánica. Retire la cámara de medio de una placa de un pocillo.Para crear una plataforma de microinyección, coloque una gota de cinco microlitros de medio de recolección lo más cerca posible de una gota de 0.5 microlitros de SIR N-A-C-R-N-A o material de inyección de oligonucleótidos morfolinos, cúbrala con aceite mineral y colóquela sobre la platina del microscopio. Coloque las pipetas de inyección y de sujeción en sus soportes y colóquelas dentro de la gota de medio de recolección. Encienda los tanques de nitrógeno conectados al picoinyector y a la mesa antivibraciones.Abra la punta de la pipeta de inyección golpeándola suavemente contra la pipeta de sujeción mientras la llena con medio. Transfiera de cinco a diez sitios oh del incubador a la gota de medio de recolección sobre la plataforma. Ahora configure los parámetros del picoinyector para un volumen de inyección de cinco a diez picolitros mientras presiona limpiar.Mueva la aguja de inyección hacia la gota de material y llénela. Regrésela a la gota de medio. Utilice la pipeta de sujeción para capturar un ovocito y alinear la aguja de inyección, el ovocito y la pipeta de sujeción a lo largo del eje x.Con mayor aumento, avance la pipeta de inyección a través del ovocito, teniendo cuidado de evitar el núcleo. Una vez que se haya perforado la membrana plasmática, presione inyectar, retire la aguja después de la inyección, libere el ovocito y repita. Una vez que todos los ovocitos hayan sido inyectados, devuélvalos al incubador para mantenerlos en medio de cultivo durante el tiempo deseado, que generalmente oscila entre 12 y 24 horas.Luego, lave los citos a través de varias gotas de CZB y transfiéralos a una microgota de CZB bajo aceite, e incube durante 16 horas para completar la maduración hasta la metafase de la meiosis II. Coloque 750 microlitros de CZB que contenga 100 micromoles por litro de Mastri en el pocillo de una placa de cultivo de órganos que tenga agua en el anillo externo. A continuación, lave los óvulos a través de varias gotas de CZB con Mastri y luego transfiéralos al pocillo de la placa de cultivo de órganos e incube durante una hora.Fije los huevos en una cápsula de reloj que contenga paraformaldehído al 2% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera los huevos a la solución de bloqueo y almacénelos a cuatro grados Celsius hasta el procesamiento, permeabilizando los huevos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, enjuague con varios volúmenes grandes de solución de bloqueo.Realice el resto del procedimiento sobre la tapa de una placa de 96 pocillos que esté protegida de la luz en una cámara humedecida. A temperatura ambiente, transfiera los huevos a gotas de 25 microlitros de solución bloqueante durante 15 minutos. Luego, para etiquetar los centrómeros, transfiera los huevos a una gota de solución bloqueante que contenga suero antisuero Crest a una dilución de uno a 40, e incube durante al menos una hora.Luego, lave pasando tres gotas de solución bloqueadora, incubando 15 minutos en cada una. Transfiera los huevos a una gota de solución bloqueadora que contenga anticuerpo marcado con fluoro cuatro y incube durante una hora. Lave dos veces con solución bloqueadora para detectar los cromosomas.Incubar en una dilución de uno a 5.000 de cytx green y solución de bloqueo. Montar las muestras en cinco microlitros de Vector Shield. Colocar cuatro pequeñas gotas de vaselina en las posiciones previstas para las esquinas del cubreobjetos para evitar la compresión de los huevos. Colocar el cubreobjetos y sellar con esmalte de uñas. Almacenar en una caja de portaobjetos a cuatro grados Celsius hasta su procesamiento mediante microscopía confocal. Durante la adquisición de imágenes con un objetivo de 100x, capturar pasos de 0,4 micrómetros en el plano Z e imaginar toda la región del conteo de centrómeros. Utilizar software de imagen como ImageJ del NIH. Los huevos de ratón euploides contienen 20 pares de cinetocoros, lo que da un total de 40 puntos en esta proyección en Z de un huevo en metafase II. El ADN se colorea en verde y los cinetocoros K se colorean en rojo.Las flechas indican dos brazos cromatídicos distintos que muestran superposición en el cinetocoro número 17 y en el número 18, tras el procedimiento de microinyección. Otros métodos como la transferencia Western, la PCR en tiempo real, la configuración del huso mitótico, la evaluación del alineamiento cromosómico y la fertilización in vitro pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como cómo la perturbación de su proteína de interés afecta la maduración meiótica y el potencial de desarrollo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular sitios específicos y evaluar el PLO de la metafase dos X.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A continuación, presentamos un protocolo para el agotamiento de ARNm siRNA mediada específico seguido por análisis de inmunofluorescencia para evaluar ensamblaje del huso meiótico y la organización de los ovocitos de ratón. Este protocolo es adecuado para el agotamiento de las transcripciones in vitro y la evaluación funcional de los diferentes husillo y / o factores MTOC asociada en ovocitos.

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

Aquí, presentamos un protocolo para la evaluación no invasiva de competencia desarrollo de oocito durante su maduración en vitro de la vesícula germinal a la etapa de metafase II. Este método combina la proyección de imagen de Time-lapse con partículas imagen velocimetry (PIV) y análisis de redes neuronales.

Una identificación basada en redes neuronal desarrollo competentes o incompetentes adulto de ovocitos de ratón

Ovogénesis en mamíferos es conocido por ser errores, particularmente debido a protooncogenes del cromosoma. Este manuscrito describe métodos de preparación de cromatina extensión de profase de ratón, metafase I y II etapas ovocitos. Estas técnicas fundamentales permiten el estudio de las proteínas de la cromatina-limite y morfología cromosómicas en mamíferos Oogénesis.

Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

Como las variantes genéticas asociadas con enfermedades humanas empiezan a ser descubierto, se está convirtiendo en cada vez más importante para el desarrollo de sistemas con los que evaluar rápidamente la importancia biológica de las variantes identificadas. Este protocolo describe los métodos para evaluar la función del gen humano durante la meiosis femenina utilizando ovocitos de ratón.

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Proporcionamos un esquema del protocolo clínico para la evaluación no invasiva de la madurez del óvulo humano mediante microscopía de luz polarizada.

Evaluación de la madurez del óvulo humano y su aplicación clínica

Se presenta un protocolo optimizado que permite el agotamiento de los centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón durante la metafase I utilizando un láser de femtosegundo de infrarrojo cercano.

Ablación con láser multifotón de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón

El error en la segregación cromosómica es una característica común en los ovocitos. Por lo tanto, estudiar el punto de control de ensamblaje del husillo da pistas importantes sobre los mecanismos necesarios para producir óvulos sanos. El presente protocolo describe tres ensayos complementarios para evaluar la integridad del punto de control del ensamblaje del huso en ovocitos de ratón.

Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón

Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar el impacto físico del citoesqueleto en la forma nuclear y los orgánulos internos sin membrana en el sistema de ovocitos de ratón. El marco se puede adaptar para su uso en otros tipos de células y contextos.

Captura de la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito de ratón a través de escalas espaciales

Los errores meióticos en las sinapsis y la recombinación son comunes en los ovocitos de mamíferos. El análisis riguroso de las proteínas involucradas en estos procesos es esencial para comprender cómo y por qué la ovogénesis a menudo sale mal. Las técnicas aquí presentadas permiten un seguimiento exhaustivo de la recombinación y las sinapsis para evaluar la calidad de los ovocitos en ratones.

Preparación de distribuciones de cromosomas meióticos de ovocitos de ratón para la evaluación de la sinapsis y la recombinación

Este protocolo describe procedimientos para la maduración in vitro de ovocitos de ratón, la fertilización in vitro y el posterior cultivo embrionario hasta la etapa de blastocisto.

Maduración in vitro, fertilización y cultivo de embriones preimplantacionales de ovocitos de ratón

Aprende microinyección de ovocitos de ratón para evaluar la ploidía en metafase II mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal. Este método permite estudiar la biología reproductiva y los mecanismos de segregación cromosómica.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

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