Name: El ratón Cremaster preparación muscular for Imaging intravital de la microcirculación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprende a preparar el músculo cremaster en ratones para microscopía intravital de la microcirculación. Este método permite visualizar redes microvasculares y estudiar el flujo sanguíneo en modelos de salud y enfermedad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Investigación en el laboratorio de los autores con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R37-HL041026, R01 y R01-HL086483 HL056786 (SSS) y F32-HL097463 y T32 AR048523 (PB) del Servicio de Salud Pública de Estados Unidos.

1. Ratón bordo, pedestal del músculo, la cuña del cuerpo y la solución de superfusión <ol><li> Ratón bordo: A bordo de plexiglás transparente rectangular (6 "de ancho x 8" de largo x 3.16 "de espesor) se hace para caber en el escenario del microscopio." Tablero del ratón "es donde el ratón anestesiado se asegura durante la preparación quirúrgica de el músculo cremáster. </li><li> Pedestal del músculo: Un pedestal transparente de goma silastic se prepara a partir Sylgard 184, que se mezcla de acuerdo a las instrucciones del s · Fabricante. Un molde es una práctica de 15 mm de espesor x 50 mm de diámetro de plato de Petri desechables de diámetro. El bloque Sylgard se corta a la forma deseada con una cuchilla de afeitar (ver Figura 1C).. Una fina capa de silicona adhesiva transparente a prueba de agua se utiliza para fijar el bloque Sylgard a la junta del ratón. Consejos útiles: Después de verter el Sylgard en la placa de Petri, de desgasificación en una cámara de vacío durante una hora, elimina las burbujas de aire y mejora la claridad. Después de la desgasificación, el tiempo de curado de Sylgard se acorta mediante la colocación de la cápsula en un horno de laboratorio a 50 ° C durante varias horas. </li><li> Cuña del cuerpo y la plataforma de calefacción: una cuña (2 "x 4" x 15 °) situado debajo del ratón y contra el pedestal se inclina el cuerpo hacia adelante que facilita la ampliación del músculo cremáster sobre el pedestal de su origen. La incorporación de una plataforma de aluminio sobre la superficie proporciona calor por conducción. La plataforma es calentado por resistencias conectadas a una fuente de alimentación DC (Figura 1). Calibración de la temperatura de la plataforma a 40 ° C mantiene la temperatura del esófago a ~ 37 ° C. De lo contrario, el calor radiante de una lámpara se utiliza. </li><li> Pins. Para asegurar el músculo cremáster en el pedestal, pines están preparados a partir de 0,15 mm alfileres de insectos que se han doblado en forma de "L" forma. </li><li> Solución salina fisiológica (PSS). Los preparativos están superfused (riego) de forma continua con bicarbonato de búfer PSS preparado en agua ultrapura (18,2 MW) H 2 O. Las soluciones madre se preparan en 20 veces la concentración final de trabajo y se esteriliza a través de un filtro de 0,2 micras. Disponibilidad de soluciones siguen siendo buenas durante varias semanas cuando se almacenan a 4 ° C. La preparación de sales por separado el bicarbonato y mezclar con la dilución en el día del experimento evita la precipitación de bicarbonato de calcio. La solución de sal para el ganado se compone de (en mmol / L): 2638 NaCl, KCl 94, 40 MgS0 4, el 23,4 CaCl2. El bicarbonato de valores es de 360 NaHCO3. En el día de un experimento, las soluciones respectivas son llevados a un volumen final (normalmente 2 L para un experimento dado) en un matraz aforado y se coloca en un baño de agua a ~ 37 ° C. Equilibrar la PSS con un 5% de CO 2 / 95% N 2 de ~ 15 minutos con un dispersor de gas se ajusta el pH a 7.4 ~ y evita la precipitación. El PSS se burbujea continuamente con CO2 al 5% / 95% de N 2 a través de experimentos. La composición final de solución de trabajo (en mmol / L) es: 132 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgS0 4, 2 CaCl2, 18 de NaHCO3. </li></ol> 2. Anestesia y preparación para la cirugía <ol><li> Tras la aprobación del Cuidado de Animales institucional y el empleo, los ratones machos de al menos 12 semanas de edad se utilizan. El ratón es anestesiados con pentobarbital sódico (60 mg / kg) vía intraperitoneal (ip). Un tubo de restricción sea de utilidad para asegurar el ratón durante la inyección inicial. A lo largo de los procedimientos quirúrgicos y protocolos experimentales, la anestesia se mantiene con los suplementos (10-20% de la inyección inicial, ip), según sea necesario (cada 30-60 minutos, se indica por la respuesta de la retirada a los pies o pellizcar la cola). Consejo: La dilución de la pentobarbital 10 mg / ml en solución salina estéril antes de la inyección reduce la posibilidad de sobredosis. </li><li> Anestesia compromisos regulación de la temperatura por lo que el ratón debe ser mantenido caliente inmediatamente después de la primera inyección. Situar el ratón en una jaula de metal (cesta ventilada de aluminio) en la parte superior de una placa calefactora (calibrado a ~ 37 ° C) funciona bien. Por otra parte, una lámpara de calor se puede utilizar con cuidado de que la posición a una distancia apropiada del ratón. El ratón debe ser tomada cada 5-10 minutos hasta que el nivel adecuado de anestesia se consigue (la falta de retiro a los pies o pellizcar la cola). Una dosis suplementaria puede ser necesaria después de 15-20 minutos. Lo mejor es ser paciente y proceder con cautela para evitar una sobredosis, especialmente en los animales obesos o de edad avanzada. </li><li> El pelo se elimina de la parte inferior del abdomen, la espalda baja, el escroto y las piernas cuidadosamente afeitado respectivas regiones. Se debe prestar especial cuidado para evitar un traumatismo en el escroto y los testículos, que de otra forma dañar el músculo cremáster. Quitar el pelo suelto con un hisopo con alcohol. </li><li> Si la vejiga está llena, se siente como una uva pequeña a través de la pared abdominal. Vaciar la vejiga con una presión suave para evitar que el ratón de orinar en la preparación cremáster durante los experimentos. A Kimwipe es una esponja de la validez de colecciónt la orina. </li><li> Coloque el ratón sobre la espalda, acostado en la cuña con sus piernas a horcajadas del pedestal. Una sutura de seda (4-0 o 5-0) empató a cada pie tiene una correa de sujeción para asegurar el ratón con su entrepierna contra el pedestal. Un pedazo de cinta adhesiva colocada libremente en el pecho y aseguró que la cuña mantiene la posición del cuerpo en general. Los procedimientos quirúrgicos se realizan mientras se visualiza a través de un microscopio estereoscópico con tijeras y pinzas en ángulo microdisección. </li></ol> 3. Preparación quirúrgica del músculo cremáster abierto <ol><li> Un pin se coloca a través del ápice de la bolsa escrotal (ya sea la izquierda o la derecha) y se asegura en el pedestal para colocar la tensión en la piel. Superfusión con PSS (34-35 ° C) se inicia en el campo quirúrgico y se mantiene durante la disección de mantener el tejido expuesto cálido y húmedo. Una mecha (a partir de Kimwipe) colocados con un extremo junto a la bolsa escrotal y el otro junto a una línea de vacío elimina el PSS de efluentes. Una capa de sellador de silicona adherida a la placa de plexiglás y completa que rodea la cuña y el pedestal sirve como "foso" para recoger el PSS que no se aspira, que actúa como una eficaz medida de precaución para evitar fugas de PSS en el microscopio. </li><li> Se hace una incisión a lo largo de la superficie ventral del saco escrotal. Si el testículo se ha retraído por el músculo cremáster en la cavidad abdominal, una ligera presión en el abdomen inferior dirige el testículo en el saco. La superficie del músculo cremáster que recubre los testículos se deben identificar en este momento. Tejido conjuntivo entre la piel del escroto y el músculo cremáster se retira cuidadosamente para liberar el músculo cremáster del tejido circundante. </li><li> La piel del escroto está ligeramente retraído por detrás del borde proximal del pedestal y se asegura a cada lado con un alfiler. La superficie exterior de la superficie del músculo cremáster se borra del tejido conectivo. Superfusión continua durante los hidratos de disección del tejido conectivo, lo que facilita la visibilidad y la eliminación. </li><li> Un alfiler en el vértice del músculo cremáster se utiliza para ponerlo bajo tensión longitudinal. Se hace una incisión longitudinal a través de la superficie ventral del músculo con gran cuidado para reducir al mínimo la interrupción del suministro vascular. La dinámica del flujo de sangre cerca de la periferia de la preparación se ven alterados por este daño en los tejidos 14. Por lo tanto, para minimizar estos efectos en la recopilación de datos, los vasos sanguíneos cerca del centro de la preparación se utilizan para la imagen y los estudios fisiológicos. </li><li> El músculo cremáster está conectado por un ligamento delgada en el epidídimo por debajo de los testículos. Como reflejo de los testículos a un lado expone este ligamento, que se separa cuidadosamente del epidídimo. Cerca de la punta del músculo cremáster es pequeña arteria y la vena que se conecta al epidídimo. Oclusión de los vasos entre las pinzas y tirando de ellos, aparte minimiza el sangrado. El testículo, el epidídimo, la arteria y la vena testicular se ligan proximal (4-0 o 5-0 sutura de seda), cortado y desechado (orquiectomía), junto con la almohadilla de grasa inguinal asociada. Por otra parte, el testículo puede volver a colocarse suavemente en la cavidad abdominal y retenido con un trozo de algodón o Kimwipe. La orquiectomía sirve para evitar el posible trauma a los tejidos cuando se empuja los testículos en la cavidad abdominal. No hemos encontrado diferencias notables en la calidad de la preparación de la microcirculación cremáster (ver sección 3.8) mediante el procedimiento 7,15. </li><li> La superficie externa del músculo cremáster, se elimina el tejido conectivo restantes y luego se extendió radialmente sobre la superficie del pedestal. Los bordes están aseguradas con clavijas (ver sección 1.4) en 5-6 lugares para crear una hoja plana de músculo estriado con microcirculación intacta. </li><li> La preparación completa se transfiere a la etapa de un microscopio intravital, superfused continua (3-5 ml / min, 34 ° C) y se equilibra durante 30 minutos. </li><li> La integridad de la preparación cremáster se evalúa de acuerdo a varios criterios. Espontánea tono vasomotor con un mínimo trauma quirúrgico está indicado por el flujo rápido en las arteriolas y la falta de leucocitos adheridos en las vénulas. El índice más sensible de una preparación de respuesta es la constricción de las arteriolas a elevar la solución de superfusión contenido de oxígeno durante 5-10 minutos. Esto se hace equilibrar con un 21% de O 2 (frente al 5% O 2, véase la sección 1.5, todos con 5% de CO 2, el balance de N 2). La presencia de leucocitos en las arteriolas, la ausencia de las células rojas de la sangre que fluye a través de los capilares, y / o leucocitos se acumulan en las vénulas y los tejidos circundantes son signos de daño en los tejidos y la inflamación. </li></ol> 4. Intravital imagen de la microcirculación del músculo cremáster <ol><li> Intravital de imágenes se realiza en un microscopio personalizado basado en una plataforma de Olympus MVX10 Zoom Estéreo. El microscopio MVX10 cuerpose monta en un híbrido MVX10 stand equipado con transiluminación (lámpara halógena) para campo claro (Köhler) de imágenes y con epi-iluminación (lámparas de mercurio) para imágenes de fluorescencia. Epi-iluminación, GCaMP2 se complace en nm 472/30 con la emisión recogidos en nm 520/35. Las imágenes se adquieren a través de una MV PLAPO 2xc objetivo (apertura numérica = 0,50; Olympus) con una intensificación de XR/Mega-10 cámara digital (Stanford Photonics, Inc., SPI) a través de Piper Control de Software (SPI) en un ordenador personal. Con este sistema, el campo observado de visión (FOV) puede variar de 553 m X 442 micras a 22 mm X 18 mm. </li><li> Al término de los experimentos de imagen intravital, el ratón anestesiado es la eutanasia con sobredosis de pentobarbital seguido por dislocación cervical. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ratón bordo de imagen intravital de la preparación del ratón cremáster. A) Cuerpo de cuña con plataforma de aluminio (aislados con plástico de color amarillo) se ve desde la parte inferior. Resistencias calentadoras asegurado a la parte inferior de la plataforma de proporcionar calor a cabo. B) La plataforma de calefacción se basa en una cuña de plástico. C) La cuña cuerpo es colocado en un tablero de acrílico para la cirugía y posterior traslado a la platina del microscopio intravital. Pedestal Sylgard se indica con la flecha roja. Un cordón de silicona resistente al agua rodea toda la preparación que contenga cualquier solución que pueden tener fugas durante el procedimiento intravital, evitando que caigan gotas en el microscopio. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Personalizado microscopio de campo amplio MacroZoom imágenes. A) MVX10 cuerpo del microscopio (Olympus) con XR/Mega-10 cámara ICCD (Stanford Photonics) montado en el puerto trinocular. B) Vista cercana del cuerpo del microscopio. (A) control de zoom (0,63 a 6.3x), (b) la rueda de filtros, (c) la imagen doblador (NA = 0,50 con un aumento óptico de 25X). C) Subetapa condensador de campo claro (Köhler) iluminación (Condensador NA = 0,55, distancia de trabajo = 27 mm). <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Completado ratón preparación cremáster. Ratón anestesiado en posición supina en la plataforma de calentamiento de aluminio recubierto de plástico (amarillo). La posición del cuerpo está asegurada con cinta adhesiva. El músculo cremáster se propaga radialmente en el pedestal de goma silastic transparente y articulada en los bordes. Solución de superfusión se introduce en el extremo proximal a través de un gotero de plástico (flecha blanca). Una línea de vacío (blanco punta de flecha) elimina la solución a través de una mecha Kimwipe. Dos micropipetas se muestran posicionado con sus consejos en el tejido. Un electrodo de referencia (hilo de plata) se fija en el borde inferior del músculo cremáster. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Ilustrar el rango de aumentos para la visualización de redes arteriolar expresar GCaMP2 en el endotelio. A) Imagen campo claro fluorescentes y B) tomadas en un aumento óptico de 3.2x para una ampliación total = 42X en el monitor de vídeo. [Campo de visión (FOV) = 4,375 x 3,470 m]. Barra de escala = 500 micras. Trabajar en este aumento facilita la colocación de micropipetas a los lugares deseados. C) fluorescentes y D) la imagen tomada en campo claro aumento óptico de 6.4X de magnificación total = 83x (FOV = 2.200 x 1.759 mm). Barra de escala = 200 micras. E) fluorescentes y F) de imágenes tomadas en campo claro aumento óptico de 12.6X para un aumento total = 165X (FOV = 1.100 x 885 mm). Barra de escala = 100 micras. G) Con doblador de la imagen, magnificación óptica = 25.2X. Barra de escala = 50 micras.

<ol><li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability%3A+an+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li>
<li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree%3A+a+topographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+%28Rat+Cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li>
<li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li>
<li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp, S. egal, S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li>
<li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li>
<li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li>
<li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+importance+of+the+endothelial+K%2B+channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li>
<li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li>
<li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagated+endothelial+Ca2%2B+waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo%3A+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation%3A+Role+of+conducted+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li>
<li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li>
</ol>

Todos los procedimientos y protocolos con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad de Missouri y realizado de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La producción de este video-artículo ha sido patrocinado por Stanford Fotónica.

A continuación se describe la preparación abierta cremáster muscular en el ratón para observar la microcirculación in vivo. Este procedimiento sigue el modelo de la preparación &quot;abierto&quot; cremáster describió por primera vez en la rata 4. Con la práctica del procedimiento quirúrgico se puede completar en menos de una hora. La versatilidad de esta preparación permite una variedad de manipulaciones experimentales y se adapta fácilmente a los hámsters y ratas, lo que permite una gran variedad de modelos experimentales para estudiar de manera similar. La preparación se limita a los machos y las mediciones deben realizarse hacia el centro del tejido, evitando las regiones dañadas cerca de los bordes del músculo 14. También hay que reconocer que, mientras que las distribuciones de presión y el flujo se altera cuando los vasos de interconexión del músculo cremáster se cortan 16 de microvasos mostrándose receptiva y adecuada para la recogida de datos reproducibles. La principal limitación a la visualización de la microcirculación en el músculo cremáster es la acumulación de tejido conectivo como animales maduros y aumentan de tamaño, especialmente en las ratas, sino también en los hámsteres. Además, como animales de engorda, se vuelve más difícil de controlar debido a la anestesia con pentobarbital es lipofílico y puede ser absorbido en el tejido adiposo. La mejor manera de proceder es ser paciente al tiempo que garantiza que la temperatura del · s de los animales del cuerpo se mantiene a ~ 37 ° C mientras que el tejido expuesto se riega continuamente con PSS.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo o dispositivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Pescador </td><td> S642-212 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de Potasio </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de magnesio </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> Sigma </td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de Sodio </td><td> Pescador </td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de sodio Nembutal </td><td> Lundbeck </td><td> NDC 67386-501-55 </td><td> También se conoce como el pentobarbital sódico </td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> Warner Instrumentos </td><td> TC-344B </td><td> Suplente: ajustable de 12V DC fuente de alimentación </td></tr><tr><td> Serie de plataforma de 20 kit de calefacción RH-2 </td><td> Warner Instrumentos </td><td> 64-0274 </td><td> Requiere de costumbre-construido placa de aluminio </td></tr><tr><td> Mega-10 Cámara </td><td> Stanford Fotónica </td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2xc lente </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10 soporte híbrido </td><td> Leeds </td><td> LBX-Hybrid </td><td></td></tr><tr><td> Piper Control de Software </td><td> Stanford Fotónica </td><td></td><td> Programa de Mega-10 cámara </td></tr><tr><td> Microscopio estéreo </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Sellador de silicona resistente al agua (Borrar) </td><td> General Electric </td><td> 47970-72643-LW5000 </td><td> Otros selladores de silicona claro también el trabajo </td></tr><tr><td> 60 x 15 mm Petri </td><td> Pescador </td><td> 08 a 757-13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras microdisección </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont Pinzas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> # 5 / 45 </td><td></td></tr><tr><td> GP Millipore Express PLUS membrana </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Minutiens Pines insectos </td><td> Austerlitz </td><td> Talla M 0,15 mm </td><td></td></tr><tr><td> Trimmer mascotas compacto </td><td> Wahl Clipper Corp. </td><td> Modelo 9966 </td><td> Limpia después de cada uso </td></tr></tbody></table>

el ratón cremaster preparación muscular for imaging intravital de la microcirculación

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

En todo el cuerpo, el mantenimiento de la homeostasis requiere el suministro constante de oxígeno y nutrientes concomitante con la eliminación de los subproductos metabólicos. Este equilibrio se consigue por el movimiento de la sangre a través de la microcirculación, que abarca las ramas más pequeñas de la vascularización en todos los tejidos y órganos. Las arteriolas de las arterias para formar redes que controlan la distribución y magnitud de la sangre oxigenada que fluye en la multitud de capilares íntimamente asociado con las células del parénquima. Capilares proporcionan una gran superficie para el intercambio de difusión entre las células del tejido y el suministro de sangre. Vénulas capilares recogen los efluentes y convergen a medida que regresan la sangre desoxigenada hacia el corazón. Para observar estos procesos en tiempo real requiere un enfoque experimental para la visualización y la manipulación de la microcirculación de vida. El músculo cremáster de ratas fue utilizado por primera vez como un modelo para el estudio de la inflamación mediante histología y microscopía electrónica de 1,2 post mortem. La primera en el informe in vivo de la exposición del músculo cremáster de ratas intactas investigado las respuestas a los fármacos vasoactivos microvascular con la luz reflejada 3. Sin embargo, la curvatura del músculo y la falta de iluminación enfocada limita la utilidad de esta preparación. El gran avance supuso la apertura de los músculos, separándolo del testículo y la difusión radial que como una hoja plana de la transiluminación con un microscopio compuesto 4. Mientras demostrado ser una valiosa preparación para estudiar la fisiología de la microcirculación en ratas y hámsters, 5 6, el músculo cremáster en ratones 7 ha demostrado ser particularmente útil en la disección de los mecanismos celulares implicados en la regulación de la función microvascular 8-11 y en tiempo real imágenes de intercelular señalización 12. El músculo cremáster se deriva de los músculos abdominales oblicuo interno y transverso ya que los testículos descienden a través del canal inguinal 13. Que sirve de apoyo (en griego: cremáster suspender =) y mantener la temperatura de los testículos. Como se describe aquí, el músculo cremáster se prepara como una fina hoja plana para la resolución óptica excepcional. Con el ratón mantiene a una temperatura corporal estable y el plano de la anestesia, preparación quirúrgica consiste en liberar el músculo del tejido circundante y los testículos, extendiéndola en pedestal transparente de goma de silastic y asegurar los bordes con alfileres de insectos, mientras que el riego continuo con solución salina fisiológica . El presente protocolo utiliza ratones transgénicos que expresan GCaMP2 en arteriolar las células endoteliales. GCaMP2 es genéticamente codificados indicador fluorescente de calcio 12 molécula. Campo amplio de imágenes y una intensificación de carga acoplada cámara del dispositivo permite el estudio in vivo de la señalización del calcio en el endotelio arteriolar.

A la preparación del tejido se describe para la visualización y la manipulación experimental de la microcirculación de vida. En los ratones macho anestesiado, el delgado y muy vascularizado músculo cremáster se prepararon para microscopía intravital para estudiar las redes microvasculares como las arteriolas, capilares y vénulas. Esta preparación se adapta fácilmente a las ratas y hámsters.

El ratón Cremaster preparación muscular for Imaging intravital de la microcirculación

En todo el organismo, el mantenimiento de la homeostasis requiere el suministro constante de oxígeno y nutrientes, junto con la eliminación de los desechos metabólicos...

El objetivo general de este procedimiento es preparar el músculo cremaster para estudiar la microcirculación viva de un ratón macho anestesiado. Esta cirugía comienza con una incisión en la superficie ventral del escroto. Una vez afeitado, el siguiente paso consiste en limpiar y separar el músculo cremaster del tejido circundante.Luego se realiza una orquiectomía y el tejido se extiende radialmente sobre la superficie de un pedestal transparente. Este preparado puede observarse mediante microscopía para obtener imágenes de la microcirculación dentro del músculo cremastérico. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran cómo se controla realmente el flujo sanguíneo y la entrega de oxígeno en sistemas vivos durante modelos de salud y enfermedad, y en respuesta a manipulaciones experimentales.Este método puede utilizarse para responder preguntas básicas en la investigación médica cardiovascular con énfasis en la microcirculación. En particular, cómo se puede regular el flujo sanguíneo y la entrega de oxígeno a nivel celular en un sistema intacto. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función in vivo de la microcirculación del ratón.También puede aplicarse a otros modelos de roedores, como hámsteres y ratas. Para estabilizar al ratón bajo el microscopio, será necesario preparar un nuevo equipo. Comience por construir una placa rectangular transparente de plexiglás que se ajuste a la platina del microscopio.A continuación, construya un pedestal transparente con el cigarro 180 4, vertiéndolo en una placa de Petri. Para adaptar los 15 milímetros, coloque el silguard vertido en una cámara de vacío durante una hora. Para eliminar las burbujas de aire y mejorar la transparencia, cure el silguard desgasificado en un horno a 50 grados Celsius durante aproximadamente cuatro horas.Una vez curado, corte el pedestal en forma de pentágono con una parte superior redondeada. A continuación, sujete el bloque del pedestal a la placa rectangular de plexiglás con una capa fina de adhesivo de silicona transparente e impermeable, y deje que la silicona cure durante la noche. Después, construya una plataforma en forma de cuña para colocar al ratón contra el pedestal.La plataforma en forma de cuña puede estar hecha de plástico acrílico, y se puede utilizar una lámpara de calor para mantener la preparación caliente. Alternativamente, se puede montar aluminio sobre una cuña de plástico. El aluminio se calienta mediante elementos calefactores resistivos conectados a una fuente de alimentación de corriente continua.Por último, el día del experimento, prepare el PSS tamponado con carbonato en agua ultrapura. Al mezclar las sales el día del experimento, se evita la precipitación de bicarbonatos. Mantenga el PSS en un baño de agua a 37 grados Celsius y, utilizando un dispersor de gas, equilibre el PSS con una mezcla de 5% de dióxido de carbono en nitrógeno durante 15 minutos.Esto ajusta el pH a aproximadamente 7,4 y además evita la precipitación de sales. Después de anestesiar un ratón adulto, afeite cuidadosamente el vello del abdomen inferior, la parte baja de la espalda, el escroto y las patas. Tenga especial cuidado alrededor del escroto y los testículos para evitar lesionar el músculo cremástero subyacente.Retire el vello suelto con una torunda de alcohol nueva. Verifique si la vejiga está llena. Si está llena, se sentirá como una pequeña uva a través de la pared abdominal; en ese caso, vacíela.Usando presión suave y sosteniendo la punta de una toalla desechable junto al pene para recoger la orina. Ahora, coloque al ratón boca arriba, acostado sobre la plataforma en forma de cuña con sus patas separadas a ambos lados del pedestal de sujeción, y luego asegúrelo con la ingle contra el pedestal. Para mantener la posición, coloque una tira de cinta adhesiva sueltamente sobre el pecho y fíjela a la plataforma.Comience la cirugía asegurando un alfiler a través del ápice de la bolsa escrotal y en el pedestal, ejerciendo tensión sobre la piel escrotal. A continuación, inicie y mantenga una superperfusión de PSS sobre el campo quirúrgico durante toda la disección. Para eliminar el PSS efluente, coloque una toalla Kim con un extremo junto a la bolsa escrotal y el otro junto a una línea de vacío.Usando tijeras de microdisección mientras sostiene la piel con pinzas anguladas, realice una incisión vertical a lo largo de la superficie ventral del saco escrotal si el testículo ha sido retraído hacia la cavidad abdominal por el músculo cremástero. Aplicar una presión suave sobre el abdomen inferior dirige el testículo hacia el saco. Ahora identifique la superficie del músculo cremástero, que recubre el testículo, y retire cuidadosamente el tejido conectivo entre este y la piel escrotal.Para exponer el músculo cremastérico, retire suavemente la piel escrotal detrás del borde proximal del pedestal y fíjela en cada lado. Con el alfiler, limpie ahora la superficie externa del músculo de tejido conectivo. Inserte un alfiler a través del ápice del músculo cremastérico para aplicar tensión y haga con mucha precaución una incisión longitudinal a lo largo de su superficie ventral, intentando minimizar la alteración del suministro vascular.El músculo cremáster principal está conectado mediante un ligamento delgado a los EPI. Debajo del testículo, refleje el testículo hacia un lado. Para exponer este ligamento, que se separa cuidadosamente de los EPI.Cerca del ápice del músculo cremástero se encuentra una pequeña arteria y vena emparejadas que se conectan al epidídimo. Sujete estos vasos con pinzas y sepárelos para minimizar el sangrado. Realice ahora una orquiectomía, incluyendo la almohadilla de grasa inguinal proximalmente, y ligue el testículo, el epidídimo, la arteria y la vena testiculares.Luego corte y deseche dichas estructuras. Elimine el tejido conectivo restante del músculo cremástero y extiéndalo radialmente sobre la superficie del pedestal. Fije los bordes con cinco o seis agujas para crear una lámina plana de músculo estriado con microcirculación intacta.Transfiera la preparación terminada al estadio de un microscopio intravital, mantenido continuamente a 34 grados centígrados, y equilibre durante 30 minutos antes de cualquier manipulación experimental o recopilación de datos. Utilizando un microscopio personalizado con iluminación de campo claro y epiluminiscencia, se adquirieron imágenes digitales de la preparación del cremáster bajo iluminación de campo claro. El músculo se visualizó a aumentos de 42 x, 83 x y 165 x en fluorescencia. El músculo se visualizó a aumentos de 42 x, 83 x, 165 x y 330 x tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en microcirculación estudiaran los mecanismos subyacentes a la regulación del tejido, flujo sanguíneo, entrega de oxígeno e inflamación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular delicadamente el tejido para asegurarse de que la reactividad microvascular permanezca intacta.

the-mouse-cremaster-muscle-preparation-for-intravital-imaging

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método nuevo y versátil para la observación de la microcirculación se presenta. Se considera adecuado para observación a largo plazo, y para la combinación con intervenciones biológicas pharmacophysiological o molecular.

En vivo la micro-circulación de medición en el músculo esquelético de Intra-vital Microscopía

Microscopia intravital para seguir los acontecimientos hemodinámicos e inflamatorios temporal y espacial en la microcirculación pial.

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

Microiontophoresis implica movimiento de los iones a partir de una micropipeta en respuesta a una diferencia de potencial eléctrico entre el interior y el exterior de la micropipeta. Moléculas biológicamente activas así son liberados en proporción a la corriente eléctrica. Nos ilustran microiontophoresis acetilcolina en conjunto con micromanipulación para estudiar vasodilatación dependiente del endotelio en la microcirculación.

Microiontophoresis y micromanipulación de imagen intravital de fluorescencia de la microcirculación

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Digital microscopía intravital epifluorescencia de vénulas post-capilares de la microcirculación cremastérico es un método conveniente para obtener información sobre la interacción...

En tiempo real de imágenes digitales de los leucocitos del endotelio interacción en el daño por isquemia-reperfusión (IRI) del músculo cremáster Rata

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Microscopía intravital del cremáster microcirculación ratón M. ofrece un único y bien estandarizada-modelo in vivo para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre en.

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

Microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite obtener imágenes diferentes procesos biológicos en los animales vivos. En este artículo, presentamos un método detallado para obtener imágenes de la dinámica de las estructuras subcelulares, tales como los gránulos de secreción, en las glándulas salivales de ratones vivos.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Este estudio demuestra la preparación quirúrgica del músculo cremaster de rata para la visualización de la capa libre de células in vivo. En este estudio se discuten factores considerables que afectan la precisión de la medición del ancho de la capa libre de celdas.

La visualización y cuantificación de la Capa libre de células en las arteriolas del músculo cremáster Rata

Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.

Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital

Aprende a preparar el músculo cremaster en ratones para microscopía intravital de la microcirculación. Este método permite visualizar redes microvasculares y estudiar el flujo sanguíneo en modelos de salud y enfermedad.

El ratón Cremaster preparación muscular for Imaging intravital de la microcirculación

Explorar más videos