Name: La extracción de ADN de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende a extraer ADN de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos hipersalinos mediante homogeneización y lisado celular. Este protocolo mejora la calidad y concentración del ADN para estudios metagenómicos funcionales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por el Programa Nacional Science Foundation Ambiental Genómica (Grant No. EF-0723707).

1. La extracción de células microbianas: <ol><li> Homogeneizar las alfombras microbianas con un mortero estéril molienda mezclando a fondo. Lugar aproximadamente a los 30 g (peso húmedo) de material de alfombra homogeneizada en un recipiente estéril de Waring batidora, añadir aproximadamente 100 ml de 1 M de NaCl (o una concentración específica de la muestra en uso), y la mezcla de tres veces a velocidad media durante 1 minuto con enfriamiento intermitente en un congelador a -20 ° C durante 1 min. La transferencia de la mezcla en una botella de 250 ml de centrífuga y llenar el volumen vacío restante con 1 M NaCl. Prepare una solución de NaCl en autoclave de agua DI y el filtro de esterilización de la misma. </li><li> Además desprender las células microbianas de la matriz por agitación (150 rpm) usando un vórtice (Vortex-Genie R 2) a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Centrifugar a baja velocidad (500x g) durante 15 min a 4 ° C. Suavemente transferir el sobrenadante a un matraz con el menor trastorno posible a los sedimentos. </li><li> Utilizando el sedimento pellets, repita los pasos de fusión y 1.2 y 1.3 cuatro veces más con la adición de NaCl fresco a cada uno de los sedimentos de pellets en la final de la etapa 1.3. El sobrenadante de cada extracción de NaCl se transfiere a un frasco de dulce. </li><li> Combine los sobrenadantes de la extracción de células y centrifugar 5 en alícuotas de 200 ml a alta velocidad (25.000 xg) durante 15 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante, resuspender cada pellet de células en 10 ml de hexametafosfato de sodio al 2%, se combinan pastillas y completar el volumen a 200 ml con hexametafosfato de sodio al 2%. Lavar las células de agitación (150 rpm) a temperatura ambiente durante 30 min. Al final de este paso, debe tener un solo tubo de células para proceder al siguiente paso. </li><li> Se centrifuga a alta velocidad (25.000 xg) durante 15 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante, resuspender sedimento celular en 200 ml de TE (50 mM EDTA), y lavar las células de agitación (150 rpm) a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Se centrifuga a alta velocidad (25.000 xg) durante 15 min a 4 ° C, descartar el sobrenadante, resuspender en 15 ml de TE (10 mM EDTA), y la tienda de 200 l alícuotas a -80 ° C hasta que sea necesario para la extracción de ADN. </li></ol> 2. Extracción de ADN y purificación: <ol><li> Añadir 200 l de NaCl 5 M, 200 l 10% de SDS, y 100 l 14,3 M β-mercaptoetanol a la alícuota microbiana de 200 l de células. Mezclar suavemente por inversión de 4.6 veces. </li><li> Someter la mezcla a 3 rondas de congelación-descongelación sumergiendo en nitrógeno líquido durante 2 min seguido de un descongelamiento en un baño de agua de 65 ° C durante 5 min. Ampliar última descongelación a 10 min. </li><li> Añadir 200 l de acetato de potasio 5 M (pH 5,5) y el lugar en hielo durante 10 min. Centrifugar a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C y la transferencia del sobrenadante a un nuevo tubo con una punta de la pipeta de gran calibre. Añadir 3 l de RNasa A y se incuba a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Añadir un volumen igual de cloroformo, agitar brevemente por inversión y centrifugar a 15.000 xg durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Transferir cuidadosamente la capa superior del sobrenadante a un tubo nuevo con una punta de la pipeta de gran calibre. Evite el pipeteo de la capa de interfaz de color blanco situado entre las capas superior e inferior. Repita el procedimiento de extracción de cloroformo. </li><li> Añadir un volumen igual de frío (a -20 ° C) isopropanol al sobrenadante e incubar en hielo durante 30 minutos para precipitar el ADN. </li><li> Centrifugar a máxima velocidad (20.800 xg) durante 10 min a 4 ° C para precipitar el ADN. </li><li> Descartar el sobrenadante y lavar el ADN precipitado con 1 ml de frío (a -20 ° C) de etanol al 70%. </li><li> Centrifugar a máxima velocidad (20.800 xg) durante 10 min a 4 ° C, descartar el sobrenadante, repetir el 70% de etanol de lavado y secado al aire pellet de ADN por 10 min. Repita el 70% de etanol de lavado. </li><li> Resuspender el ADN en 25 l TE (10 mM EDTA), caliente a 65 ° C durante 5 minutos, se combinan en un tubo si varios tubos se han utilizado, y el maquillaje volumen a 500 ml con TE. </li><li> Añadir 500 l helado (o menos 4 ° C) 20% de glicol polietileno (PEG) (preparado en 1,2 M NaCl). Mezclar suavemente por inversión e incubar en hielo durante 10 min y centrifugar a máxima velocidad durante 10 minutos a 4 ° C para precipitar el ADN. Retire y deseche el sobrenadante, lavar el ADN granulado con 1 ml de etanol frío al 70%, de secado al aire durante 10 minutos, y resuspender en 30-50 l TE o agua de grado molecular. Facilitar la resuspensión de ADN por calentamiento a 65 º C durante 5 minutos y el ADN de la tienda a -80 ° C. </li></ol> 3. La pureza del ADN, la concentración y determinación del tamaño: <ol><li> Determinar la calidad del ADN mediante la medición del A y A 260/280 260/230 ratios usando un espectrofotómetro Nanodrop 1000 o cualquier instrumentación apropiada. </li><li> Determinar la concentración de ADN utilizando Quant-iT kit de ADN de doble cadena de ensayo de acuerdo a las instrucciones del fabricante. </li><li> Determinar el tamaño de ADN utilizando el campo de pulsos electroforesis en gel. Prepare un 1% en gel de agarosa con TBE 0.5X y utilizar los siguientes parámetros en el CHEF Mapper XA sistema, el tiempo de cambio inicial de 0,35 s, un tiempo de cambio de final de 7,67 s, y 120 ° ángulo incluido de un gradiente de 6,0 V / cm en una r linealamplificación de los factores. Mancha de gel con 1 x SYBR Green I durante 30 minutos. Carga entre 700-1000 ng de ADN total en gel. Ver fig. 3 de una forma condensada de todo el protocolo. </li></ol> Los resultados representativos: Celda de extracción: Secuencial de los extractos de células microbianas (sobrenadantes) han demostrado que la turbidez de los extractos disminuye a medida que aumenta el número de extracciones. Esto sugiere una reducción en el número de células después de cada extracción de células sucesivas. Es importante señalar aquí es que cada paso célula de extracción adicional proporciona la oportunidad para la introducción de contaminantes, el número de extracciones de células debe ser minimizado para que el final precipitado de células es representativa de la comunidad microbiana en general. Otras fuentes de contaminación se controla mediante la adopción de técnicas adecuadas de laboratorio estéril. Por ejemplo, las soluciones se prepararon en autoclave agua desionizada y esterilizada filtro. Los contenedores fueron esterilizados con alcohol, autoclave, y se trata a la luz ultravioleta y la radiación ultravioleta reticulante. Concentración de ADN y la determinación de la calidad: El protocolo produjo aproximadamente 2 g de ADN de alto peso molecular (35-50 kb) (Fig. 4) por gramo de muestra de tapete con un A 260/280 ratio de 1,6, y un A 260/230 ratio de 0,7 (Tabla 1). Aunque la relación A 260 / 230 pareció ser baja, no hay inhibición de aguas abajo de base molecular de aplicaciones como PCR-amplificación de los genes del 16S rRNA se observó en un estudio separado 7. Es importante tener en cuenta que el ADN de las esteras hipersalinas tiene dos fuentes principales de contaminación, EPS y las sales. Por tanto, es posible que los restos de estos contaminantes pueden estar influyendo en la A 260/230 relaciones a pesar de los enormes esfuerzos para reducir sus efectos sobre las aplicaciones de aguas abajo. La determinación del tamaño del ADN: Electroforesis en gel de campo de pulsos utiliza un flujo de corriente pulsante con interruptores intermitentes de dirección que resulta en una prueba de ADN, como se muestra en la figura 3. Nuestro protocolo produjo un ADN de alto peso molecular de aproximadamente 35 a 50 kb. Mientras que algunos de tamaño de ADN puede ser menor de 30 kb, es importante que una parte de la mancha por encima de 35 kb, ya que la clonación fosmid requiere ~ 40 kb inserciones de ADN y grandes fragmentos de ADN proporcionan un mayor acceso a las vías de biosíntesis intacto. En nuestros estudios, la prueba de ADN por encima de 35 kb se cortó y se purifica para la clonación de vectores de gran inserción y otras aplicaciones molecular. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Microbianas hipersalinas alfombra sitio de muestreo (Laguna Grande) se encuentra en Eleuthera, Bahamas. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Una sección de la alfombra microbiana hipersalina utilizados en este estudio. El tapete microbiano se obtuvo de una laguna hipersalina situada en Eleuthera, Bahamas. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representación esquemática de los procedimientos involucrados en la extracción de células microbianas, la lisis celular, la extracción y purificación del ADN metagenómica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">Haga clic aquí para ver una imagen más grande.</a> <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Caracterización peso molecular del ADN extraído utilizando el campo de pulsos electroforesis en gel. Carril M es un marcador de alto peso molecular, y las calles 1 y 2 son repeticiones de ADN extraído de la metagenómica alfombra Eleuthera hipersalinos utilizando el protocolo anterior. <table border="1"><tbody><tr><td> Método de extracción </td><td></td><td> Concentración ng / g </td><td> A 260 / 280 </td><td> A 260 / 230 </td></tr><tr><td> PEG </td><td> Representante de una </td><td> 1806.1 </td><td> 1.64 </td><td> 0.76 </td></tr><tr><td></td><td> Rep 2 </td><td> 2010.8 </td><td> 1.61 </td><td> 0.75 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Medición de la concentración y la calidad del ADN extraído de alfombra microbiana hipersalinos.

<ol><li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms+in+intertidal+systems%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cont.+Shelf+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li>
<li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li>
<li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li>
<li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li>
<li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Soil+Ecol%22%5BJournal%5D)">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li>
<li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%3A+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+the+Soil+Metagenomic%3A+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li>
<li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Rhodopsin%3A+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li>
</ol>

Teniendo en cuenta que la eliminación total de las células de las muestras de alfombra complejos y muy variados microbiana no es práctico, la principal preocupación es qué tan bien las células extraídas representar a la comunidad microbiana alfombra en general. En un estudio previo, PCR-DGGE análisis de microorganismos genes del 16S rRNA mostró que la eliminación de cinco pasos de células utilizadas en este protocolo de extractos de células que son representativos de la comunidad microbiana alfombra en general 7.</...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilenglicol 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20% en 1,2 M NaCl </td></tr><tr><td> Acetato de potasio </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Quant-iT ensayo dsDNA kit </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa </td><td> Epicentro </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> BDH productos químicos </td><td> BDH8014 </td><td> Conc apropiado. </td></tr><tr><td> Dodecilsulfato de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03-500-509 </td><td> 10% en agua </td></tr><tr><td> hexametafosfato de sodio </td><td> EMD Chemicals </td><td> SX0583-3 </td><td> 2% en agua </td></tr><tr><td> TBE </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1333-1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF Mapper XA Sistema </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 espectrofotómetro </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vórtice </td><td> Scientific Industries Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Crosslinker ultravioleta </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mezclador Waring </td><td> Waring laboratorio </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

la extracción de adn de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Análisis de éxito y preciso y la interpretación de los datos de metagenómica depende de la extracción eficiente de alta calidad, la comunidad de ADN de alto peso molecular (HMW). Sin embargo, las muestras ambientales colchoneta a menudo plantean dificultades para la obtención de grandes concentraciones de alta calidad, de alto peso molecular del ADN. Tapetes microbianos hipersalinos contienen altas cantidades de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) 1 y las sales que pueden inhibir aplicaciones posteriores del ADN extraído. Los métodos directos y las duras a menudo se utilizan en la extracción de ADN de muestras de refractario. Estos métodos se utilizan normalmente debido a que la EPS en esteras, una matriz adhesiva, une el ADN 2,3 durante la lisis directa. Como resultado de los métodos de extracción más dura, el ADN se fragmenta en pequeños tamaños 4,5,6. El ADN se convierte en inadecuado para la reproducción de vectores de gran inserción. Con el fin de sortear estas limitaciones, se presenta una metodología mejorada para extraer el ADN de alto peso molecular de buena calidad y cantidad de tapetes microbianos hipersalinos. Se empleó un método indirecto, que supone la separación de las células microbianas de la matriz de alfombra de fondo a través de la mezcla y centrifugación diferencial. Una combinación de procedimientos mecánicos y químicos se utilizó para extraer y purificar el ADN de las células microbianas extraídos. El protocolo de los rendimientos de aproximadamente 2 g de ADN de alto peso molecular (35-50 kb) por gramo de muestra de alfombra, con un ratio de 1,6 260/280. Por otra parte, la amplificación de genes del 16S rRNA 7 sugiere que el protocolo es capaz de minimizar o eliminar los efectos inhibitorios de los contaminantes. Nuestros resultados proporcionan una metodología adecuada para la extracción de ADN de alto peso molecular de tapetes microbianos de los estudios de metagenómica funcional y puede ser aplicable a otras muestras ambientales de la extracción de ADN, que es un reto.

Ofrecemos un protocolo mejorado para la extracción de ADN de alto peso molecular de tapetes microbianos hipersalinos. Las células microbianas son separados de la matriz de alfombra antes de la extracción y purificación del ADN. Esto mejora la concentración, calidad y tamaño de la DNA. El protocolo puede ser utilizado para otras muestras de refractario.

La extracción de ADN de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos

El análisis e interpretación exitosos y precisos de los datos metagenómicos dependen de la extracción eficiente de ADN de alta calidad y de alto peso molecular...

El objetivo general de este procedimiento es extraer ADN de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos hipersalinos. Esto se logra primero homogeneizando y extrayendo las células microbianas del tapete microbiano. Luego, las células microbianas se lisan mediante ciclos de congelación-descongelación y metodología química.A continuación se realiza la eliminación de restos celulares y ARN mediante extracciones orgánicas y RNasas, seguida de la extracción de ADN. El paso final del procedimiento es la precipitación y purificación del ADN. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran ADN de alta calidad y concentración con peso molecular elevado.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los métodos directos y agresivos de extracción de ADN, es que utiliza ADN de alto peso molecular procedente de una muestra ambiental compleja para estudios funcionales de metagenómica. El metagenoma microbiano utilizado en este estudio se obtuvo de un estanque hipersalino ubicado en Eleutera, Bahamas. Para extraer las células microbianas de la matriz de la costra de fondo, primero se mezclan aproximadamente 30 gramos de costra completamente, sin triturar, con un mortero estéril. La costra se homogeniza completamente cuando no se observan grumos en la mezcla.A continuación, coloque el material mate homogeneizado en una licuadora y agregue aproximadamente 100 mililitros de cloruro de sodio. Licúe a velocidad media durante un minuto, seguido de un enfriamiento de un minuto a menos 20 grados Celsius. Repita este proceso, licuando y enfriando dos veces más. Cuando finalice la licuación, transfiera la suspensión a un frasco de centrífuga de 250 mililitros y complete el volumen restante con cloruro de sodio uno molar.Agite a temperatura ambiente durante 30 minutos; transcurridos 30 minutos, centrifugue la suspensión a baja velocidad durante 15 minutos a cuatro grados celsius. Luego, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un matraz, con el mínimo disturbio al sedimento. Añada cloruro de sodio fresco al sedimento pelletizado.Vuelva a mezclar y agite durante 30 minutos. Luego, centrifugue como antes y transfiera el sobrenadante a un nuevo matraz. Repita la adición de cloruro de sodio fresco, la mezcla, la centrifugación y la eliminación del sobrenadante otras tres veces.Combine los sobrenadantes de las cinco extracciones celulares y centrifugue alícuotas de 200 mililitros a alta velocidad durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Deseche el sobrenadante y resuspenda cada pellet celular en 10 mililitros de hexametafosfato de sodio. Combine las suspensiones celulares de los cuatro tubos y agregue hexametafosfato de sodio para completar el volumen hasta 200 mililitros.Lave las células agitándolas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de agitar, centrifugue las células a alta velocidad durante 15 minutos a cuatro grados Celsius, deseche el sobrenadante y resuspenda el botón celular en 200 mililitros de tampón de lavado. Vuelva a lavar las células agitándolas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Finalmente, centrifugue nuevamente a alta velocidad durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.Tras descartar el sobrenadante Resus, suspenda el botón celular en 15 mililitros del medio para preparar alícuotas de 200 microlitros de células microbianas. Las células microbianas pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius hasta que sean necesarias para extracciones de ADN. Para iniciar el procedimiento de extracción y purificación de ADN a partir de las células microbianas, agregue SDS de cloruro de sodio y etanol beamr capto a cada una de las alícuotas de 200 microlitros de células microbianas.Aliquotar ocho tubos en total. Mezclar suavemente invirtiendo de cuatro a seis veces, sumergir la mezcla en nitrógeno líquido durante dos minutos, seguido de descongelación a 65 grados Celsius durante cinco minutos; repetir la inmersión en nitrógeno líquido y la descongelación a 65 grados Celsius dos veces más.Amplíe el descongelamiento final a 10 minutos. Después de la tercera ronda de congelación y descongelación, agregue 200 microlitros de acetato de potasio a cada tubo y colóquelo en hielo durante 10 minutos. Luego, centrifugue a 10.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.A continuación, utilice una punta de pipeta de gran orificio para transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Añada tres microlitros de RNAsa e incube a 37 grados Celsius durante una hora. Tras la incubación de una hora, añada un volumen igual de cloroformo.Agite brevemente mediante inversión y centrifugue a 15.000 G durante 10 minutos. A temperatura ambiente, transfiera la capa superior del sobrenadante a un nuevo tubo. Repita el procedimiento de extracción con cloroformo.Una vez más, transfiera la capa superior del sobrenadante a un nuevo tubo. Añada un volumen igual de isopropanol frío al sobrenadante e incube en hielo durante 30 minutos. Para precipitar el ADN, centrifugue a velocidad máxima para formar el botón de ADN, deseche el sobrenadante y lave cada botón de ADN con un mililitro de etanol frío al 70 %.Repetir la centrifugación del lavado con etanol al 70 % a velocidad máxima durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Desechar el sobrenadante. Repetir el lavado con etanol al 70 % y secar al aire el pellet de ADN durante 10 minutos.ReSuspender cada pellet de ADN en aproximadamente 25 microlitros de te. Calentar a 65 grados Celsius durante cinco minutos, y luego combinar en un solo tubo y aforar a un volumen de 500 microlitros con te. Añadir polietilenglicol mezclando suavemente por inversión e incubar en hielo durante 10 minutos.Centrifugar para formar el pellet de ADN. Luego eliminar y desechar el sobrenadante tras lavar el ADN con etanol al 70 % enfriado. Secar al aire durante 10 minutos, resuspender en 30 a 50 microlitros de tampón TE o agua de grado molecular y calentar a 65 grados Celsius durante cinco minutos.Almacene el ADN a menos 80 grados Celsius. Esta tabla muestra los resultados de la medición de la concentración y calidad del ADN extraído de la alfombra microbiana hipersalina. El protocolo produjo aproximadamente dos microgramos de ADN por gramo de muestra de alfombra, con una relación A260/A280 de 1,6 y una relación A260/A230 de 0,7.Aunque la relación A260/A230 pareció ser baja, no se observó inhibición en aplicaciones moleculares posteriores, como la amplificación por PCR de los genes de ARN ribosómico 16S, en un estudio independiente. Cuando se determinó el tamaño del ADN mediante electroforesis en gel con campo pulsado, los resultados indicaron ADN de alto peso molecular o H-M-W-D-N-A de aproximadamente 35 a 50 kilobases. Aquí, la banda M es un marcador de alto peso molecular y las bandas uno y dos son réplicas de ADN metagenómico extraído de la matanza hipersalina de eleuthra. La mancha de ADN por encima de 35 kilobases puede ser cortada y purificada para la clonación en vectores de inserción grande u otras aplicaciones moleculares adecuadas.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la clonación P-C-R-D-G-G-E o la secuenciación de ADN para responder preguntas adicionales, como, cuál es la diversidad funcional de la comunidad microbiana bajo estudio.

extraction-of-high-molecular-weight-dna-from-microbial-mats

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe un método para la extracción de ADN de alto peso molecular genómico a partir de biomasa planctónica se concentró en 0,22 micras filtros Sterivex, seguido por centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio para la purificación.

Extracción de ADN de 0,22 M Filtros Sterivex y centrifugación de densidad de cloruro de cesio Gradient

Una metodología para aislar de alto peso molecular y ADN genómico de alta calidad de la comunidad microbiana del suelo se describe.

La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

Este video muestra el protocolo para la extracción de ADN de fijado en formol e incluido en parafina de material. Este es un procedimiento de varios días en los que las secciones de tejido se deparaffinized con xileno, rehidratada con etanol y se tratan con proteinasa K para purificar y aislar el ADN para su posterior análisis de genes específicos o en todo el genoma.

Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

Uso de la vía aérea fibrosis quística como un ejemplo, el manuscrito presenta un flujo de trabajo integral que comprende una combinación de enfoques de metagenómica y metatranscriptomic para caracterizar el microbiana y comunidades virales en muestras asociadas con animales.

Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

Aquí se describe un método para la extracción, purificación y control de calidad del ADN genómico del patógeno fúngico biotrófico obligado, el mildiú polvoriento, para su uso en la secuenciación del genoma de lectura larga.

Purificación de ADN de alto peso molecular genómico de oídio para Long-Read Sequencing

Presentamos el proceso de aislamiento, propagación y caracterización de bacterias degradadoras de hidrocarburos de hábitats acuáticos. El protocolo describe el aislamiento bacteriano, la identificación mediante el método de ARNr 16S y las pruebas de su potencial de degradación de hidrocarburos. Este artículo ayudaría a los investigadores a caracterizar la biodiversidad microbiana en muestras ambientales y, específicamente, a detectar microbios con potencial de biorremediación.

Aislamiento, propagación e identificación de especies bacterianas con propiedades metabolizadoras de hidrocarburos de hábitats acuáticos

Este artículo describe un protocolo para la extracción de ADN de diatomeas utilizando un kit de extracción de ADN común modificado.

Extracción de ADN de diatomeas a partir de muestras de agua y tejidos

Aquí, presentamos una técnica simple para evaluar la resistencia a los antimicrobianos (RAM) ambiental mediante el aumento de la proporción de ADN extracelular de bajo peso molecular. El tratamiento previo con PEG al 20%-30% y NaCl 1,2 M permite la detección de genes de AMR tanto genómicos como transferidos horizontalmente. El protocolo se presta a un proceso sin kits con optimización adicional.

Extracción mejorada de ADN de bajo peso molecular de aguas residuales para una evaluación integral de la resistencia a los antimicrobianos 

Este protocolo describe el método CTAB para extraer ADN de alta calidad de micobacterias, superando los desafíos que plantean sus duras paredes celulares ricas en ácido micólico. El proceso implica digestión enzimática, lisis celular con CTAB y purificación del ADN mediante extracción orgánica y precipitación de etanol. Este método produce ADN adecuado para estudios moleculares y es fiable para la investigación micobacteriana.

Extracción de ácido desoxirribonucleico de genoma completo de especies de Mycobacterium mediante la técnica de bromuro de cetiltrimetilatonio

Biología de las comunidades microbianas - Entrevista

Aprende a extraer ADN de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos hipersalinos mediante homogeneización y lisado celular. Este protocolo mejora la calidad y concentración del ADN para estudios metagenómicos funcionales.

La extracción de ADN de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos

Explorar más videos