Name: Inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprende a inducir hipoxia en cultivos celulares usando cloruro de cobalto y cámaras de hipoxia. Evalúa el estado hipóxico mediante la detección de HIF-1 alpha por western blot y ensayos de luciferasa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. La hipoxia inducida por CoCl 2 solución Cobalto (II) hexahidratado Cloruro (CoCl 2 • 6H 2 O, PM = 237,9) es un inductor químico del factor inducible por hipoxia 1,3 8. Este producto es soluble en agua (100 mg / ml), dando una solución clara, de color rojo. <ol><li> Prepare una solución madre 25 mM en agua estéril dd, (prepararse inmediatamente antes de su uso) </li><li> Use CoCl 2 en la concentración final de 100μM en sus medios regulares de cultivo de células para inducir la hipoxia. </li><li> Agregue el CoCl 2 medios que contienen a las células y se incuban los cultivos durante 24 horas en una incubadora convencional (37 ° C, 5% C0 2). </li></ol> A la concentración de obras para las líneas celulares que hemos probado, pero cada línea celular debe ser probado en diferentes concentraciones (para establecer una curva dosis-dependiente), así como en diversos tiempos de incubación con el fin de limitar la toxicidad relacionada con las drogas y optimizar el ensayo. 2. Hipoxia inducida en Modular cámara de la incubadora <ol><li> Preparar al menos dos cultivos celulares idénticos (la cultura twin). Los cultivos de células pueden ser en cofres, los platos o la cultura. Para abrir la cámara, abrir por primera vez las dos abrazaderas de plástico blanco se encuentra en los tubos conectados a la cámara (tubos utilizados para la inyección / purgar el gas hipóxico) y abra suavemente el anillo de sujeción de acero. </li><li> Suelte la abrazadera. La tapa y bandejas de ahora se puede quitar. </li><li> Coloque el cultivo de células en la cámara de hipoxia. También colocar una placa de Petri que contiene agua estéril en la cámara para proporcionar humidificación adecuada de los cultivos. </li><li> Coloque el "gemelo" de cultivo de células en normoxia como control. </li><li> Asegúrese de que las bandejas están garantizados y no se mueve, y luego cerrar la cámara con su tapa. Correctamente la posición del anillo de sujeción de acero para garantizar el cierre hermético de la cámara y ciérrelo. </li><li> Para crear la hipoxia, conectar el tubo a un "tanque de hipoxia", que contiene un 1% O 2 mezcla de gases. Si usted tiene un medidor de flujo conectado al tanque de su cámara se puede conectar directamente a él (el tanque de gas de flujo metros de la cámara). Nosotros utilizamos un medidor de flujo incorporado en nuestro organismo regulador. </li><li> Es importante para la mayoría, si no eliminar todos los presentes oxígeno en la cámara y en sus medios de comunicación, para hacerlo al ras de la cámara mediante la apertura del tanque de gas con un caudal de 20 litros por minuto durante 7-10 minutos, y luego rápidamente apagar el flujo de gas y se cierra completamente la cámara mediante el cierre de dos pinzas blancas. </li><li> Devolver la cámara a una incubadora convencional para el período de tiempo deseado. Si utiliza grandes culturas, que el material de las culturas de gas de 1 a 2 horas y luego repetir color. Los pasos anteriores se basan en las recomendaciones constructor '(Billups-Rothenberg, Inc). Asegúrese de que el tanque de gas se fijan correctamente en todo momento. </li></ol> Notas: <ul><li> Con el fin de eliminar el O 2 contenido en los medios de comunicación, se aconseja volver a la cámara de gas una vez después de 3 horas 1. </li><li> Para el tiempo de incubación más largo que 48 horas también se recomienda a la cámara de re-gas. </li><li> Los sensores de oxígeno (electrodos / manómetro) que permiten la medición de la O 2 contenido en células / cámara proporcionará una medición más precisa de la O intracelular / cámara de 2 contienen). </li><li> El cultivo de células en diferentes longitudes de tiempo para hacer una curva de tiempo-podría ayudar a determinar el momento óptimo de expresión de HIF-1α en células específicas. </li></ul> 3. Evaluación de la hipoxia <ol><li> HIF-1 α detección por Western blot. <ol><li> Volver a abrir su cámara como se describe en la sección 2.2 e inmediatamente colocar sus cultivos en el hielo. </li><li> Lisis de la hipoxia células tratadas y no tratadas con 5% de solución de SDS en las placas luego transferir el lyzate celular a los tubos, ultrasonidos, spindown los restos celulares y recoger el sobrenadante. </li><li> Mediciones de concentración de proteínas utilizando BCA kit, preparar la muestra mediante la adición de tampón de carga y la calefacción a 95 º C durante 5 min. </li><li> Electroforesis de proteínas en un 8% SDS-gel de poliacrilamida y la transferencia a membranas de nitrocelulosa. </li><li> Bloquear la membrana en PBS que contenía 5% sin grasa leche en polvo y 0,1% Tween 20 a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 ° C durante la noche en la coctelera. </li><li> Durante la noche con anti-HIF-1α anticuerpo monoclonal primario (1 / 600) en el mismo buffer inmunoblot a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 veces en PBS que contenía 0,1% de Tween 20 a temperatura ambiente, 5 minutos cada vez y se incuban con HRP-secundaria de anticuerpos (1 / 2000) en PBS + 0,1% Tween 20 durante 45 minutos. </li><li> Lavar 3 veces en PBS que contenía 0,1% de Tween 20 a temperatura ambiente, 5 minutos / hora. </li><li> Use Pierce ECL kit y películas de rayos X para mostrar la banda de la proteína </li></ol></li><li> Elemento Sensible hipoxia (HRE). HIF-1α regula numerosos genes (es decir, VEGF, OEP), mediante la unión a una secuencia denominada Elemento de Regulación de hipoxia (HRE). Educación en derechos humanos asociados al uso de un gen marcador it es posible detectar la actividad de HIF 9. Para utilizar este método, primero que hay que transfectar las células con un plásmido de luciferasa HRE mediante un método de transfección adaptado a las células. Por ejemplo, podemos utilizar Lipofectamine 2000. Las células necesitan para ser transfectadas por lo menos 4 horas antes de ser incubados en hipoxia y normoxia. Este tiempo permite que el ADN de entrar en las células de modo que este primer paso no se ve afectada por la hipoxia. La señal de luciferasa se detectó mediante un Kit de ensayo de luciferasa. <ol><li> Incubar la educación en derechos humanos, las células transfectadas en la hipoxia en la cámara modular o el uso de EDH-transfectadas las células se incubaron con CoCl 2, incluir un control de normoxia. </li><li> Después del período de incubación se desea, eliminar el medio de cultivo de las células. </li><li> Enjuague las células en PBS, retire la PBS. </li><li> Dispensar 400μl del reactivo de lisis 1X en placa de cultivo y raspar las células adheridas, y luego los transferirá a un tubo de micro. </li><li> Pellet los escombros por centrifugación breve. </li><li> 20μl mezcla de lisados ​​celulares sobrenadante con 100μl del reactivo de ensayo de luciferasa y medir la luminiscencia usando un luminómetro. </li></ol></li></ol> 4. Los resultados representativos: En las células K562 (línea de células humanas de leucemia) cultivadas en dos días con poco oxígeno, en comparación con normoxia, la hipoxia induce un aumento de HIF-1α proteína que se detectó por Western blot (Figura 1). Utilizando HRE-luciferasa modificados células 293 (línea de células embrionarias de riñón) se cultivan en la hipoxia, un significativo aumento de HIF-1α se detectó actividad en las células hipóxicas (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Aumento de HIF-1α en células hipóxicas. K562 células fueron la cultura en normoxia e hipoxia (cámara de hipoxia) durante 48 horas y se analizaron por Western blot utilizando un anticuerpo específico para HIF-1α. Un anticuerpo específico para la actina se utilizó para el control de carga. <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: HIF-1α actividad. Educación en derechos humanos-luciferasa modificados 293 células fueron cultivadas en hipoxia y normoxia durante 48 horas y luego se lisaron para detectar la señal de luciferasa utilizando un kit de ensayo de luciferasa y un luminómetro. Los resultados se expresan como la unidad de luminiscencia relativa (RLU).

<ol><li>Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+hypoxia+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).</li>
<li>van Laarhoven, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+in+relation+to+vasculature+and+proliferation+in+liver+metastases+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).</li>
<li>Hockel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+pO2+predicts+survival+in+advanced+cancer+of+the+uterine+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix.</a> Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1+and+human+disease%3A+one+highly+involved+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">HIF-1 and human disease: one highly involved factor.</a> Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1%3A+master+regulator+of+O2+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.</a> Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).</li>
<li>Tatum, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%3A+importance+in+tumor+biology%2C+noninvasive+measurement+by+imaging%2C+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).</li>
<li>Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">HIF at a glance.</a> J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).</li>
<li>Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoCl2%2C+a+chemical+inducer+of+hypoxia-inducible+factor-1%2C+and+hypoxia+reduce+apoptotic+cell+death+in+hepatoma+cell+line+HepG2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2.</a> Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).</li>
<li>Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+regulates+p300-dependent+hypoxia-inducible+factor+1+transcriptional+activity+through+Forkhead+transcription+factor+3a+%28FOXO3a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La proliferación celular y la viabilidad en condiciones de hipoxia varían mucho en función de los tipos de células. Por lo tanto, usted debe ajustar el número de células o el número de placas de cultivo se comienza con asegurarse de que tendrá suficientes células / proteínas para sus experimentos. El método de cloruro de cobalto tiene la ventaja de ser barato y rápido. Este producto reproduce mediante la inducción de hipoxia HIF-1/3α pero también pueden regular otros genes, asegúrese de que este producto se adapta a su proyecto mediante la comprobación de lo que otros efectos que podría tener sobre la función y el fenotipo de las células en particular, independientemente de la &quot;imitar- hipóxica &quot;efecto. Otro medicamento también se utiliza para imitar la hipoxia es el mesilato de deferoxamina (DFO, que se utiliza en 100 mM concentración final). El uso de estos fármacos permite al experimentador para abrir la placa de cultivo / plato / frasco muchas veces sin afectar a la &quot;condición de hipoxia&quot;. El nivel de oxígeno contenido en la mezcla de gas puede variar en función de sus experimentos y tipos de células como los valores de la hipoxia varían dependiendo de los tejidos y tipos celulares. De hecho, algunas células hipóxicas en el 5% O 2 necesidad de otras menos del 1% de O 2 a la hipoxia. 5% de CO 2 se añade a la mezcla de gases para estabilizar el pH de los cultivos, el resto del gas es generalmente nitrógeno. Cámaras hipóxicas tiene la ventaja de no utilizar medicamentos que pueden alternar el comportamiento celular, independientemente de la tensión de oxígeno. Sin embargo, no todos los tipos de experimentación se puede hacer como el oxígeno vuelve a entrar en la cámara en cada abertura y por lo tanto disminuye la hipoxia. Debe tener en cuenta este factor en sus experimentos, la hipoxia / re-oxigenación es una condición específica que puede afectar a algunos tipos de células. Una alternativa es el uso de estaciones de trabajo de la hipoxia (conectados a los tanques de gas premezclado o los sistemas de mezcla de gases) o mayores hipoxia incubadora (cámara de tratamiento con la hipoxia de la guantera), que permite la experimentación de cambiar los medios de comunicación y de manipular las células en el ambiente hipóxico continua. Varias cámaras de hipoxia se han comercializado durante la última década y se debe elegir de acuerdo a su laboratorio utilizados, los proyectos, el espacio, tamaño y presupuesto. Asegúrese siempre de que el buen uso y condición de su cámara para garantizar las condiciones correctas de la cultura. En general cuando se utiliza una cámara, el nivel de hipoxia puede ser modulada por la selección de las mezclas de gases diferentes (es decir, un 1%, 5% al ​​10% de oxígeno). En cuanto a la detección de HIF-1α, es importante saber que algunas líneas celulares cancerosas expresan HIF-1α en normoxia. Por tanto, es fundamental utilizar un normoxia-control para determinar el nivel basal de HIF en estas líneas celulares. HIF-1α también pueden estar presentes en normoxia en las células no malignas después de la estimulación de células o el estrés. Esto también podría ocurrir si estas células están hambrientas, asegúrese de que los cultivos celulares se alimentan adecuadamente y se mantiene.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Anti-HIF-1α </td><td> Invitrogen </td><td> 458400 </td></tr><tr><td> Cobalto (II) Cloruro </td><td> Sigma </td><td> C8661-25G </td></tr><tr><td> Incubadora de la Cámara </td><td> Billups-Rothenberg </td><td> MIC-101 </td></tr><tr><td> Educación en derechos humanos-Luciferase plásmido </td><td> Adgene </td><td> Plásmido 26731 </td></tr></tbody></table>

inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

La hipoxia se define como la reducción o falta de oxígeno en órganos, tejidos o células. Esta disminución de la tensión de oxígeno puede ser debido a una reducción del suministro de oxígeno (causas incluyen la red insuficiente de los vasos sanguíneos, los vasos sanguíneos defectuosos, y anemia) o de un mayor consumo de oxígeno en relación con la oferta (causado por una tasa más alta proliferación de las células) . La hipoxia puede ser fisiológico o patológico como en tumores sólidos, etc 1-3, aterosclerosis artritis reumatoide, ... Cada uno de los tejidos y las células tienen una capacidad diferente para adaptarse a esta nueva condición. Durante la hipoxia, la hipoxia inducible factor alfa (HIF) se estabiliza y regula varios genes como los que participan en la angiogénesis o el transporte de oxígeno 4. La estabilización de esta proteína es una característica de la hipoxia, por lo tanto, la detección de HIF se utiliza habitualmente para la detección de la hipoxia 5-7. En este artículo, se proponen dos métodos sencillos para inducir la hipoxia en cultivos celulares de mamíferos y pruebas sencillas para evaluar el estado de hipoxia de estas células.

Aquí proponemos métodos sencillos para inducir la hipoxia en cultivos de células y pruebas sencillas para evaluar el estado de hipoxia de los cultivos.

Inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular

La hipoxia se define como la reducción o falta de oxígeno en los órganos, tejidos o células. Esta disminución de la tensión de oxígeno puede deberse a un suministro reducido en...

El objetivo general de este procedimiento es inducir hipoxia en cultivos celulares. Esto se logra primero cultivando las células en presencia de un inductor químico del factor inducible uno de hipoxia, o cultivando las células en un incubador o cámara de hipoxia llenos con una mezcla especial de gases. A continuación, se detecta la hipoxia mediante la verificación del nivel de expresión de HIF uno alfa en extractos proteicos celulares, o mediante la medición de su actividad utilizando un vector ENC que codifica secuencias de unión a hi uno alfa.En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un aumento en los niveles de expresión y la actividad de HIF one alpha mediante inmunotransferencia (western blotting) y detección de luminiscencia. Mi nombre es Danny U. Soy investigador en el laboratorio de Patrizia Inda. Hoy demostraré este procedimiento para inducir hipoxia con cloruro de cobalto.Comience preparando una solución stock de cloruro de cobalto 25 milimolar en agua doblemente destilada estéril. Añada la solución a las células y cultive a una concentración final de 100 µM. Incube las células durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono para inducir hipoxia.Utilizando una cámara de incubación modular, prepare al menos dos cultivos celulares idénticos. Sin embargo, se recomienda realizar un triplicado para cada condición. Abra la cámara de incubación modular abriendo primero las dos abrazaderas de plástico blanco ubicadas en los tubos conectados a la cámara, y retire la tapa y las bandejas.Coloque el cultivo celular en la cámara hipóxica con una placa de Petri que contenga agua estéril dentro de la cámara para proporcionar una humedad adecuada a los cultivos. Coloque el segundo cultivo celular en normoxia como control para inducir hipoxia. Conecte el tubo a un tanque de hipoxia que contenga una mezcla de gas con 1% de oxígeno.Si un medidor de flujo está conectado a su tanque, la cámara se conectará directamente a este. Utilizamos un medidor de flujo incorporado en nuestro regulador para eliminar todo el oxígeno presente en la cámara y en el medio. Purifique la cámara abriendo el tanque de gas a un flujo de 20 litros por minuto durante cuatro a siete minutos.Luego, apague rápidamente el flujo de gas y cierre completamente la cámara, cerrando ambas pinzas blancas. Devuelva la cámara a un incubador convencional durante el período de tiempo deseado.Si se utilizan cultivos grandes, deje el medio y los cultivos en DGAs durante una a dos horas, y luego repita el lavado para evaluar la hipoxia. Mediante la detección de HIF-1α por inmunotransferencia, abra nuevamente la cámara como se demostró anteriormente y coloque inmediatamente los cultivos sobre hielo. Licee las células tratadas y no tratadas con hipoxia con una solución de SDS al 5 %.Luego, transfiera los lisados a tubos y someta a sonicación para extraer las proteínas, centrifugue para sedimentar los restos celulares y recoja el sobrenadante. A continuación, mida la concentración de proteína utilizando un kit BCA. Luego, prepare una muestra para gel añadiendo tampón de carga y calentando a 95 grados Celsius durante cinco minutos.Separar las proteínas en un gel de poliacrilamida SDS al 8% y transferirlas a una membrana de nitrocelulosa. Bloquear la membrana en PBS que contenga leche descremada en polvo al 5% y Tween 20 al 0,1% a temperatura ambiente durante una hora o a cuatro grados Celsius durante la noche, en agitación. Incubar el revelado durante la noche con un anticuerpo primario monoclonal anti HIF uno alfa en el mismo tampón a cuatro grados Celsius.Al día siguiente, lave la transferencia tres veces durante cinco minutos cada vez en PBS que contenga 0,1 % tween 20 a temperatura ambiente, luego incube con un anticuerpo secundario conjugado con HRP en PBS más 0,1 % tween 20 durante 45 minutos. Lave tres veces durante cinco minutos cada vez en PBS que contenga 0,1 % tween 20 a temperatura ambiente.Luego incube la membrana en soluciones de detección quimioluminiscentes y expóngala a una película de rayos X para medir la actividad de luciferasa. Retire el medio de crecimiento de las células cultivadas. Enjuague las células con PBS.Luego, agregue 400 microlitros de reactivo de lisis 1x al recipiente de cultivo. Raspe las células adheridas y transfiéralas a un tubo micro. Pelote los restos mediante una breve centrifugación.Mezcle 20 microlitros de sobrenadante del lisado celular con cien microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa, y mida la luminiscencia utilizando un luminómetro. Las células K 5 62 se cultivaron en normoxia o hipoxia durante 48 horas y se analizaron mediante blot de western utilizando un anticuerpo específico para H uno alfa. Se utilizó un anticuerpo específico para beta actina como control de carga.Los resultados muestran un aumento en la HIF-1α en células hipóxicas. Las células 293 modificadas con luciferasa bajo el control de HRE se cultivaron en hipoxia o normoxia durante 48 horas y luego se analizaron para detectar la señal de luciferasa mediante un kit de ensayo de luciferasa y un luminómetro aquí. También se detectó un aumento en la actividad de la HIF-1α en células hipóxicas.Los resultados se expresan como luminiscencia relativa. Unidades No olvide que trabajar con gases precisos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como asegurar adecuadamente el tanque de oxígeno a la pared o al banco, abrir y cerrar correctamente el tanque de oxígeno, así como controlar la presión, durante la realización de este procedimiento.

induction-and-testing-of-hypoxia-in-cell-culture

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Imágenes de bioluminiscencia de inducible por hipoxia-1α factor de actividad se aplica al seguimiento del desarrollo de la hipoxia tumoral intracraneal en un modelo de ratón de cáncer de mama metástasis cerebrales.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

Aquí se describe una metodología para llevar a cabo un siRNA dirigidos pantalla "ubiquitome" para identificar nuevos ubiquitina y reguladores-ubiquitina de la respuesta celular mediada HIF1A a la hipoxia. Esto puede ser adaptado a cualquier vía biológica, donde una lectura robusta de la actividad del indicador está disponible.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

En este artículo se describe la metodología para la administración de cortos períodos de hipoxia intermitente para postnatales días 1-8 de ratón o rata crías. Este enfoque suscita efectivamente un nivel de tejido robusto "efecto priming" en células progenitoras neurales cultivadas que se cosechan en los 30 minutos de exposición a la hipoxia.

Entrega de<em&gt; En Vivo</em&gt; Aguda intermitente hipoxia neonatal en roedores a derivados de la Zona Prime subventricular progenitoras neurales Cultivos Celulares

Este manuscrito presenta un modelo in vitro único de células de citotrofoblasto velloso humano inmunopurificadas cultivadas bajo hipoxia/reoxigenación. Este modelo es adecuado para estudiar los efectos protectores de tratamientos prometedores, como la melatonina, sobre las complicaciones del embarazo asociadas con el aumento del estrés oxidativo y la alteración de la función placentaria.

Trofoblasto humana primaria cultivo celular modelo para estudiar los efectos protectores de la melatonina contra la hipoxia / reoxigenación interrupción inducida

Este manuscrito describe el desarrollo de un modelo animal que permite probar directamente los efectos de la hipoxia tumoral sobre la metástasis y descifrar los mecanismos de su acción. Aunque los experimentos que se describen aquí se centran en el sarcoma de Ewing, se puede aplicar un abordaje similar a otros tipos de tumores.

Modelo In Vivo para Pruebas Efecto de la hipoxia sobre la metástasis tumoral

Introducimos un nuevo sistema de cámara hipóxico para su uso con organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema es simple, robusto, rentable y permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia in vivo y hasta 48 horas. Presentamos 2 métodos reproducibles para monitorear la efectividad de la hipoxia.

Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra

Aquí se describe un protocolo de co-inmunoprecipitación para estudiar interacciones de proteínas entre las proteínas nucleares endógenas bajo condiciones hipóxicas. Este método es conveniente para la demostración de las interacciones entre los factores de transcripción reguladores Co transcripcionales a hipoxia.

Ensayo de co-inmunoprecipitación utilizando proteínas nucleares endógenas de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas

La distancia espacial es un parámetro clave en la evaluación de la lesión por hipoxia/reoxigenación en un modelo de cocultivo de capas separadas de células endoteliales y cardiomiocitarias, lo que sugiere, por primera vez, que la optimización del entorno espacial de cocultivo es necesaria para proporcionar un modelo in vitro favorable para probar el papel de las células endoteliales en la protección de los cardiomiocitos.

Desarrollo de un modelo de cocultivo celular para imitar la isquemia/reperfusión cardíaca in vitro

Presentamos un novedoso dispositivo para medir las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en cultivos epiteliales de pigmento de retina (EPR). El dispositivo puede medir el OCR durante semanas seguidas en RPE cultivado en placas de cultivo celular estándar con medios estándar mientras las placas están en una incubadora de cultivo celular estándar.

Monitorización a largo plazo de las tasas de consumo de oxígeno en cultivos epiteliales de pigmento retiniano altamente diferenciados y polarizados

Aquí describimos un protocolo in vitro para modelar el daño por hipoxia/reoxigenación en las células epiteliales tubulares proximales, altamente metabólicas. Este modelo está diseñado para inducir daños inducidos por estrés metabólico, que pueden medirse mediante la expresión de marcadores de daño proximal de los túbulos y la evaluación de la función respiratoria mitocondrial.

Modelado de la hipoxia/lesión por reoxigenación en células epiteliales tubulares proximales

Aprende a inducir hipoxia en cultivos celulares usando cloruro de cobalto y cámaras de hipoxia. Evalúa el estado hipóxico mediante la detección de HIF-1 alpha por western blot y ensayos de luciferasa.

Inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular

Explorar más videos