Modelado neuronal de señalización inmune de la migraña episódica y crónica mediante la depresión propagada In Vitro

El objetivo de este video es ilustrar cómo se pueden usar los cultivos de cortes de hipocampo para descifrar la señalización inmune neuronal que modula la susceptibilidad a la propagación de la depresión, la causa subyacente más probable del aura de la migraña y quizás de la migraña. La propagación de la depresión se evoca fácilmente en los cultivos de cortes de hipocampo. Dado que los cultivos se mantienen in vitro durante semanas, el comportamiento de los tipos de células individuales se puede medir, imitar y modular durante períodos prolongados.

Esto es especialmente importante para el estudio de la señalización inmunitaria neuronal. Dado que los trozos de cerebro maduros del hipocampo alcanzan un estado inmunológico inactivo, las respuestas inmunes de la depresión en expansión se pueden evaluar sin los efectos potencialmente confusos de la anestesia utilizando técnicas biológicas moleculares modernas. En consecuencia, se puede determinar la detección sensible de la señalización de citocinas desde tan solo 50 células hasta aproximadamente 90.000 células en un corte.

Los cultivos de cortes de cerebro en el hipocampo son ideales para su uso en el desarrollo de nuevas terapias inmunológicas neuronales para aliviar la migraña. Mi nombre es Yian Berg y soy Aya Puss y Heidi Mitchell del laboratorio de Richard Craig y del Departamento de Neurología del Centro Médico de la Universidad de Chicago. Hoy demostraremos el uso del hipocampo de ratas, piojos, cultivos y el estudio de la señalización inmune de bajo nivel de la depresión en expansión.

La depresión extendida es un evento neuronal paroxístico que se desencadena por un estallido de aumento de la actividad sináptica que luego es seguido rápidamente por una pérdida transitoria de toda la actividad. Cada vez hay más pruebas de que la señalización inmunitaria de bajo nivel puede influir y, a su vez, ser influenciada por la actividad sináptica dentro del cerebro. Nuestra hipótesis es que las citocinas modulan la susceptibilidad a la propagación de la depresión y, como resultado, al aura de migraña y quizás también a la migraña.

Los procedimientos que describimos aquí están diseñados para minimizar la activación potencialmente confusa de las células inmunitarias y aumentar nuestra capacidad para detectar señales inmunitarias de bajo nivel. Esto nos permite detectar la gama más amplia de señales neuromunitarias y sus interacciones con la propagación de la depresión. Para comenzar este procedimiento, haga electrodos de tierra cortando tubos de vidrio de 4,5 milímetros de longitud.

A continuación, pule brevemente al fuego las secciones cortadas en ambos extremos. A continuación, ponga a hervir 100 mililitros de cloruro de potasio molar y agregue 3,5 gramos de agar y 0,5 gramos de EDTA. Revuelva la mezcla continuamente para producir una solución amarilla clara.

Coloque un trozo de tubo corto y flexible sobre cada tubo de vidrio. A continuación, extraiga la solución agrícola de cloruro de potasio tibia en el tubo de vidrio y una corta distancia en el tubo flexible. Libere la succión y permita que el agar cloruro de potasio gotee lentamente por la punta abierta del tubo de vidrio.

A medida que el agar gotea, toque un trozo de hielo con la punta del tubo de vidrio abierto, lo que hará que el agar se gelifique en la punta del electrodo y no se gelifique después de retroceder hacia el tubo de vidrio del tubo. Una vez que el agar esté gelatinizado, retire suavemente el tubo flexible sin alterar la posición del agra. En los tubos de vidrio, coloque 0,5 mililitros de cloruro de potasio molar en cada pocillo de un estante de tubos de centrífuga de 1,5 mililitros.

A continuación, coloque la punta de cada tubo de vidrio de cloruro de potasio en pocillos individuales para mantener las puntas húmedas. A continuación, sostenga un alambre de plata de calibre 15 de 80 centímetros de largo con un hemostático. Limpie cada uno de los cuatro lados raspando el alambre a través de una lima sujeta a la encimera.

Después de eso, corte el alambre en longitudes de cuatro centímetros. Colóquelos en un frasco de centelleo lleno de lejía durante 20 a 30 minutos. Para colocar una capa firme de cloruro de plata a plata sobre la superficie de plata limpia, doble el alambre por la mitad e insértelo en el tubo de vidrio lleno de agar cloruro de potasio dejando expuestos de cuatro a seis milímetros.

Luego cubra la punta del tubo de vidrio que contiene el alambre de plata y una pequeña extensión del alambre con pegajoso, un pegamento flexible y resistente al agua para evitar que el agar cloruro de potasio se seque, repita para todos los electrodos y deje que el pegamento se seque durante la noche. Después de estirar, guarde los electrodos en viales de centelleo con cinco mililitros de cloruro de potasio molar y 25 miligramos de EDTA. Alrededor de cinco a seis electrodos por vial a cuatro grados centígrados.

Fabricación de electrodos de grabación con tubos de vidrio de silicato bo con filamentos. A continuación, haga un electrodo estimulante cortando una longitud de unos 20 centímetros de meridio platino recubierto de teflón. Luego dobla la longitud por la mitad, ata los extremos sueltos en un nudo cuadrado suelto, dejando unos dos centímetros desde el nudo hasta los extremos del alambre.

Asegure el nudo en el mandril de un taladro de lata eléctrica colocado sobre una mesa mientras sostiene el otro extremo del cable con un hemostático. Enciende y apaga brevemente el taladro hasta que el cable esté firmemente retorcido. Para unir los alambres trenzados de platino meridio a los cables conductores, primero pegue el alambre trenzado de platino meridio a una mesa de trabajo y deje caer un charco de ácido clorhídrico concentrado sobre un extremo libre del alambre trenzado.

Luego, coloque el extremo pelado en un cable conductor adyacente al extremo del cable trenzado y aplique calor de un soldador de punta fina y luego suelde hasta que los dos cables estén firmemente unidos. Deslice un trozo corto de tubo termorretráctil sobre la conexión del cable expuesto y condúzcalo con fuego de calor. Pula la punta de una pipeta de 15 centímetros más allá y guía el alambre de meridiano de platino retorcido por la pipeta.

Use un epoxi repelente al agua para sellar ambos extremos del electrodo. Finalmente, conecte enchufes tipo banana a los extremos del cable conductor para la conexión al aislador de estímulo bajo observación estereoscópica. Coloque la punta del electrodo en PBS y busque burbujas producidas electrolíticamente que provengan solo del extremo cortado de las puntas de los electrodos si hay burbujas que provengan de los lados de los cables retorcidos.

Corte el electrodo transversalmente con una cuchilla de afeitar de un solo filo para restablecer el aislamiento intacto a los ejes largos de los cables. Al solucionar problemas para resolver los efectos de estímulo aberrantes, intente hacer una punta de electrodo recién cortada. Otro paso importante es preparar las placas de grabación, que consisten en un inserto de cultivo en rodajas y una placa de cultivo de 35 milímetros que se asienta sobre dos varillas de vidrio de 1,0 x 12 milímetros espaciadas aproximadamente 1,0 centímetros entre sí.

Las varillas de vidrio se unen a la base del plato calentando los tubos de vidrio y luego presionándolos en la base con pinzas. Para condiciones de grabación estática, agregue 1,5 mililitros de medio a la plato. Después de esto, remoje un trozo de algodón estéril de 10 milímetros de ancho y de tres a cuatro centímetros de largo.

En medios de 1,0 mililitros, doble el algodón por la mitad a lo largo del eje largo y colóquelo a lo largo de la pared interior del inserto. Con pinzas estériles, el algodón húmedo ayuda a mantener la humedad del plato. Tres piezas de tubo compresibles de cuatro milímetros de largo están igualmente espaciadas alrededor del inserto.

Cubra el plato herméticamente con una película de cloruro de polivinilo para permitir el intercambio de gases. Luego corte alrededor de su pared vertical media con una hoja de afeitar de un solo filo para eliminar el exceso de cloruro de polivinilo. La película evoca un potencial de campo de aproximadamente tres con pulsos de 100 microsegundos a 0,2 hercios, comenzando con una corriente de aproximadamente uno a cinco microamperios que es suficiente para desencadenar una respuesta.

Mueva el electrodo registrador en incrementos a lo largo del eje largo de la neurona parametálica hasta que el potencial de campo sea máximo. A continuación, aumente la corriente con un electrodo de registro en esta posición y observe la respuesta de corriente máxima de aproximadamente 10 a 20 microamperios. Por último, utilice la mitad de la intensidad máxima del estímulo para los experimentos con el fin de determinar el umbral de la depresión de propagación evocada transsinápticamente.

Cambie el paradigma de estimulación para evocar manualmente ráfagas individuales de 100 microsegundos por pulso a 10 hercios. Aumente progresivamente la intensidad de la corriente por ráfaga de estímulo hasta que se desencadene la propagación de la depresión. El umbral de depresión en los lums desencadena la propagación de la depresión cada nueve minutos durante una hora.

Registre los cambios de potencial rápido y lento de tres áreas a través de sistemas de procesamiento de señales digitales separados. Después de la última depresión que se extendió, devuelva el inserto de cultivo a las condiciones normales de incubación y marque la tapa de la placa de cultivo. Para observar la cultura que experimentó la depresión en expansión, cambie los medios cada tres o cuatro días hasta la cosecha del cultivo.

Comience este procedimiento diluyendo la selectina ISO a 20 microgramos por mililitro en el medio de crecimiento. Luego, incube los cultivos en rodajas en condiciones normales de incubación de cuatro a 10 horas antes de la obtención de imágenes, encienda la cámara del microscopio, el control de la temperatura con luz ultravioleta y los gases al menos una hora antes de la toma de imágenes. A continuación, configure el software de metamorfosis para la obtención de imágenes, luego coloque el inserto en un plato de cultivo de 35 milímetros con dos varillas de vidrio de un milímetro en la parte inferior.

A continuación, coloque tres piezas de tubo de goma de dos milímetros entre las paredes del inserto y la placa de cultivo. Para estabilizar aún más el inserto, coloque un trozo de algodón de 10 milímetros de ancho empapado en un mililitro adicional de medio dentro del inserto. Para mantener un ambiente humidificado, cubra herméticamente la parte superior de la placa de cultivo con una película de cloruro de polivinilo.

Para evitar la pérdida de líquido, asegúrese de que el foco de la imagen esté en la capa de celda parametálica CA tres. Observe la orientación de los cortes al tomar imágenes de fase a cinco x 10 x y 20 x en la ventana de enfoque fino, establezca el rango actual en ocho y la precisión en un solo clic, encuentre el enfoque para garantizar una imagen enfocada en la ventana de lapso de tiempo de adquisición. Seleccione el intervalo de tiempo de un minuto y la duración de seis horas para capturar con precisión los movimientos de la microglía.

Las imágenes no deben ser menos frecuentes que una vez por minuto al final de la película. Compruebe la presencia de lesiones celulares mediante el cribado CY talk para experimentos de PCR. Sumerja los insertos de cultivo en rodajas en dos o tres mililitros de ARN más tarde y guárdelos a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres días hasta su posterior procesamiento.

Para recolectar, retire el tejido extraño con un cuchillo de vidrio, coloque las rodajas en ARN individuales. Tubos de centrífuga de 1,5 mililitros libres de ADN que contienen 0,5 mililitros de solución salina estéril tamponada con fosfato. Usando un pincel de punta fina, haga girar las 10, 000 RPM durante un minuto de manera estereotipada para que todas las rodajas se adhieran al mismo lado de sus tubos.

Retirar el sobrenadante PBS y resuspender la muestra en 500 microlitros de triol. Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados o manténgalas en hielo hasta la extracción del ARN. Los cambios en la expresión de proteínas a partir de la eliminación del ARN del SI se pueden evaluar con sensibilidad mediante la mejora de la inmunotinción tradicional de DAB mediante la intensificación de la plata y la posterior cuantificación densimétrica. Aquí se muestra el paradigma de registro electrofisiológico de cultivo en corte en el que se coloca un microelectrodo de registro en la capa de neuronas parametálicas CA tres y se coloca un electrodo estimulante bipolar en el giro dentado.

Aquí hay un ejemplo de los tres potenciales de campo de CA evocados por la estimulación del giro dentado, que se utiliza para establecer la respuesta máxima media, aquí se muestran las respuestas de potencial de campo de CA a las ráfagas de 10 hercios restantes que se incrementaron progresivamente en una intensidad para finalmente desencadenar una depresión en expansión. En la parte inferior derecha. Aquí se muestra una célula inmunitaria vital ejemplar.

Esta imagen demuestra por primera vez que una fracción de la microglía se mueve largas distancias en un patrón de búsqueda óptimo, como se indica en rojo, conocido como vuelos de levy que son inversamente proporcionales a la actividad sináptica. La amplificación preemintiva de CDNA permite la detección de IFN gamma en cultivos de cortes de hipocampo. Inicialmente, la TC para un gen de referencia RPL 13 A era de 20,5 y el IFN gamma era indetectable en la izquierda.

Sin embargo, después de la amplificación de Preem indicada a la derecha, el IFN gamma se detectó fácilmente a 29.0. Con RPL 13 A registrado en 14.1 para indicar un aumento de 12 veces de la amplificación de la señal, se muestra la confirmación inmunohistoquímica de una eficiencia. La intensificación diferenciada de la plata diferenciada de la inmunotinción de bencina peroxidasa diamina se utiliza para cuantificar la reducción significativa de la producción de ciclofilina B en cultivos de corte de hipocampo tratados con siRNA una vez dominados.

Las técnicas descritas en este video se pueden realizar durante varios días. Deseamos enfatizar que nuestros cultivos de cortes de hipocampo se aproximan mucho a su contraparte in vivo y son ideales para estudiar la señalización inmune y la propagación de la depresión. Sin embargo, es esencial mantener el entorno inmunitario inactivo bajo control y las condiciones simuladas.

Para minimizar la activación inmunitaria confusa, los cultivos deben mantenerse en condiciones estériles. No deben exponerse a perturbaciones químicas, mecánicas o térmicas excesivas. Dado que la señalización fisiológica de citocinas se produce a nivel femtomolar, se deben aplicar técnicas de medición altamente sensibles y reproducibles.

Utilizamos tecnología PCRA y técnicas proteómicas sensibles. Por último, las citocinas son pleiotrópicas y redundantes. En consecuencia. Las dianas de citocinas multiplex medidas a lo largo del tiempo son útiles para estudiar cómo la señalización inmunitaria modula la susceptibilidad al esguince, la depresión y, por extensión, la migraña.