Un alto rendimiento In situ Método de hibridación para caracterizar los patrones de expresión de ARNm en el ratón Fetal del tracto urogenital inferior

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los patrones de expresión de ARNm en tejidos en desarrollo del tracto urogenital inferior de ratón fetal. Esto se logra primero sintetizando una sonda de ribonucleótidos marcada con digoxigenina a partir de una plantilla generada por PCR. El segundo paso del procedimiento consiste en obtener secciones gruesas mediante un microtomo vibrante.

El tercer paso consiste en realizar una hibridación in situ en secciones del tracto urogenital inferior contenidas en canastillas personalizadas. Los ARNm se visualizan mediante la detección inmunohistoquímica de sondas de ARN marcadas utilizando el sustrato de fosfatasa alcalina BM purple que precipita. En última instancia, la microscopía puede mostrar la localización espacial y temporal de transcritos de ARNm de baja y alta abundancia en el tracto urogenital inferior del ratón fetal.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunohistoquímica es que las sondas de ARNr son fáciles de generar y pueden diseñarse para reconocer la mayoría de los ARNm en todo el genoma del ratón. Aunque este método proporciona información sobre los patrones de expresión de ARNm durante el desarrollo urinario genital fetal en el ratón, también puede aplicarse a otros sistemas orgánicos, especies y etapas de desarrollo. La demostración visual de este método es fundamental, ya que incrustar el tejido en auger puede ser difícil de aprender, y porque pequeñas variaciones en la orientación pueden llevar a resultados inconsistentes. Al menos un día antes de preparar el tejido, retire y deseche la membrana de una placa de cultivo celular milli de 12 milímetros de diámetro, mientras que el anillo restante funcionará como un molde; remoje los anillos durante la noche en solución inhibidora de ARN.

El día del protocolo, diseccionar el tracto urogenital inferior de un ratón que ha sido rehidratado con metanol en gradiente. Realizar lavados con PBS Tween, desechar aproximadamente dos tercios de la vejiga y almacenar el tejido restante del tracto urogenital inferior en PBS Tween. A continuación, colocar un molde anular tratado sobre un portaobjetos de vidrio y llenarlo con una solución al 4 % de agarosa de bajo punto de fusión a 62 grados Celsius, dejándolo enfriar durante aproximadamente dos minutos.

Ahora, bloquee el tejido del tracto urogenital inferior y sumérjalo en la solución de agarosa. Utilice pinzas para orientar el tejido de modo que quede suspendido a mitad de camino entre la parte superior e inferior del anillo. Incube en molde a cuatro grados Celsius hasta que la agarosa se haya solidificado.

Antes de cortar el tejido, prepare una cuchilla Wilkinson personalizada enjuagándola con disolventes y luego con agua. Separe la cuchilla doble longitudinalmente en dos cuchillas individuales. A continuación, sostenga la cuchilla Wilkinson con una cuchilla de micrótomo.

Para hacer esto primero, corte la cuchilla de micrótomo al tamaño de la cuchilla Wilkinson. Luego, utilizando un adhesivo Lock Tite, pegue la cuchilla de micrótomo a la cuchilla Wilkinson desplazada del filo unos tres a cuatro milímetros. Ahora monte la cuchilla reforzada en el microtomo vibrante y ajuste el ángulo de la cuchilla a 35 grados.

Prepare el baño de especímenes de lujo llenando el baño con PBS y colocando hielo húmedo alrededor. Antes de montar el tejido embebido en el tapón, retírelo del molde anular y seque ligeramente la superficie inferior. Luego, pegue la superficie seca al disco de montaje utilizando adhesivo Loctite.

Inserte el disco en el vibrátomo y ajuste el grosor de la sección a 50 micrones, la velocidad a dos y la amplitud de la cuchilla a cuatro. Mientras corta secciones de tejido, utilice pinzas romas para transferir cada sección a una placa de cultivo de 24 pocillos llena con medio mililitro de PBS tween frío. Después de cortar, elimine la mayor parte del aros alrededor de cada sección de tejido usando tijeras de resorte antes de comenzar la hibridación INI; las secciones pueden almacenarse hasta por 48 horas a cuatro grados Celsius en PBS tween que contenga azida sódica dos milimolar.

Primero, prepare canastillas personalizadas para muestras cortando el fondo de un tubo de microcentrífuga en la marca de 100 microlitros. Caliente el corte del tubo en una llama hasta que el plástico esté blando. Luego, presione firmemente el plástico blando sobre un cuadrado de malla.

Deje que endurezca y corte la malla sobrante. Complete los canastillos utilizando una aguja calentada de calibre 18 para perforar dos orificios en cada tapa de tubo. Haga una bandeja para sostener los canastillos de muestra perforando 24 orificios de 12 milímetros uniformemente espaciados en la tapa de una placa de 24 pocillos.

Cada orificio debe colocarse directamente sobre un pocillo antes de comenzar a precalentar una cámara de hibridación cubierta, llena con media pulgada de agua del grifo, hasta 60,5 grados Celsius. Inicie la hibridación in situ añadiendo dos mililitros de PBS tween a cada pocillo de la placa de cultivo de 24 pocillos. Cubra esta placa con la tapa preparada que contiene las cestas.

Ahora transfiera las secciones de tejido a las canastillas a temperatura ambiente con agitación, e incube las secciones en peróxido de hidrógeno al 6 % con PBS tween, seguido de una serie de lavados con PBS tween, una incubación con proteinasa K, otra fijación y más lavados. Para finalizar la preparación de las muestras, agregue dos mililitros del tampón de prehibridación previamente calentado a cada pocillo e incube la placa dentro de la cámara de hibridación calentada durante al menos una hora. Inicie la hibridación agregando 0,5 microgramos de sonda RIBA marcada a cada una.

A continuación, continúe la incubación durante la noche dentro de la cámara de hibridación calentada. Al día siguiente, lave los tejidos con la solución uno, cambiando gradualmente a la solución dos, luego trate con ARNs. A continuación, lave con la solución tres, seguido de lavados en TBS tween y tampón de bloqueo de tejidos mientras los tejidos se incuban en el tampón de bloqueo de tejidos.

Inicie una incubación de al menos dos horas del anticuerpo anti-dig en tampón de absorción de anticuerpos a cuatro grados Celsius después del período de incubación. Centrifugue la solución de anticuerpo a 10,000 RPM durante un minuto. Para eliminar los insolubles, agregue la Senna a dos mililitros de la solución de anticuerpo en tampón.

Ahora retire el tejido del tampón de bloqueo e incúbelo en la solución de anticuerpo preparada. Manténgalos en una cámara de hibridación durante la noche a cuatro grados Celsius el tercer día del procedimiento. Lave los tejidos varias veces en TBST con el ole.

Luego, utilizando una pipeta de vidrio para pasta, transfiera cuidadosamente los tejidos a tubos microcéntrifugos limpios. Lave los tejidos durante 10 minutos con un mililitro de NTM vacío.

Luego, reemplace la solución por TMT que contenga lava sole MBM morado. Coloque los tubos en la oscuridad y, durante los próximos días, controle el desarrollo del color y cambie la solución según sea necesario. Tras el desarrollo completo del color, lave brevemente los tejidos con TMT que contenga lava so y luego incúbelos durante la noche a cuatro grados Celsius en PBS que contenga paraformaldehído.

Al día siguiente, trate con lejía y lave los tejidos. Las secciones ya están listas para la obtención de imágenes. El tejido del tracto urogenital inferior se incrustó en agar de manera que la línea media de la uretra quedara paralela a la superficie plana del tapón de agar.

Esta orientación produjo secciones sagitales. Canastillas personalizadas protegieron las secciones de tejido delicadas del polvo y de partículas. Durante el procedimiento de hibridación in situ en dos fases que duró varios días.

También evitaron la pérdida de cualquier sección. Es difícil limitar la tinción de fondo durante las largas incubaciones necesarias para detectar ARNm de baja abundancia. Sin embargo, la adición de azida sódica y la filtración posterior parecen haber reducido la tinción de fondo.

Además, no hubo diferencias visibles en la tinción de fondo cuando las muestras se incubaron en la solución de desarrollo del color durante períodos prolongados de tiempo. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en seis días si se realiza adecuadamente. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica para determinar si el patrón de expresión de los ARNm se correlaciona con el patrón de expresión de las proteínas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar los patrones de expresión de ARNm y el tracto genital inferior en desarrollo del ratón.