Name: Un alto rendimiento In situ Método de hibridación para caracterizar los patrones de expresión de ARNm en el ratón Fetal del tracto urogenital inferior (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende un método de hibridación in situ de alto rendimiento para visualizar patrones de expresión de ARNm en el tracto urogenital inferior fetal del ratón. Esta técnica permite detectar transcritos de baja y alta abundancia.

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Los autores desean agradecer a la Dra. Lan Yi, Instituto del Cáncer de Nueva Jersey, para la asistencia técnica en la preparación de cestas de tejido. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones DK083425 y DK070219.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Utilizando el método descrito aquí, es posible detectar mRNAs en todos los principales tipos de células y los compartimentos de tejido de la LUT de ratón fetal hombres y mujeres incluyendo las pastillas de origen mesenquimal, urotelio, músculo liso, los brotes de próstata, conducto eyaculador y la vagina. Las secciones de 50 micras utilizado en este protocolo tiene la ventaja de ser lo suficientemente gruesa como para resolver la arquitectura del tejido (por ejemplo, los vasos sanguíneos), pero son lo suficientemente de...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Anticuerpo anti-digoxigenina, fragmentos Fab </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> El bloqueo de los reactivos </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Purple sustrato AP, lo que precipitó </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Placa de cultivo celular, 24 y </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenina-UTP 11 </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> De doble filo navaja de rasurar </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Modelo clásico </td></tr><tr><td> Eliminase RNasa removedor </td><td> Decon Laboratories </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Gel kit de extracción </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Glutaraldehído, solución al 25% en H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> La heparina, la sal de sodio </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> De peróxido de hidrógeno, solución al 30% en H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 configuración rápida adhesivo instantáneo </td><td> Henkel Corp. </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Ácido maleico </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga, 1,5 ml </td><td> Biologix Empresa de Pesquisa </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Cultura Millicell placa de inserción </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Resina molecular de molienda </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldehído, solución al 4% en tampón fosfato salino </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino sin Ca y Mg </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Malla de poliéster, de 33 micras, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Pequeñas piezas Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinasa K solución, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> Columnas QIAshredder </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Q solución </td><td> Qiagen </td><td> Siempre con la polimerasa de ADN Taq </td></tr><tr><td> RNasa </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> Inhibidor de RNasa </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNasa libre de DNasa </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque bajo punto de fusión de agarosa </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Suero de oveja </td><td> Sigma </td><td> S2263-500 ml </td></tr><tr><td> Stericup unidad de filtro, 0.22μm, polietersulfona, 500 ml </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Azida de sodio, granular </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Dodecilsulfato de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X solución </td><td> Investigación de Productos Internacionales </td><td> S24022-4000.0 </td></tr><tr><td> Superíndice III primer capítulo de síntesis del sistema </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasa </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq ADN polimerasa </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibración micrótomo con baño ejemplar de lujo </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> TRNA de levadura </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

un alto rendimiento in situ método de hibridación para caracterizar los patrones de expresión de arnm en el ratón fetal del tracto urogenital inferior

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Desarrollo del tracto urogenital inferior (LUT) es un proceso complejo. Esta complejidad se pone de manifiesto durante la formación de la próstata desde la uretra masculina fetal, que se basa en las señales de andrógenos y epitelio-mesenquimal 1,2 interacciones. Comprender los mecanismos moleculares responsables del desarrollo de la próstata pueden revelar los mecanismos de crecimiento que están inadecuadamente despertado tarde en la vida para dar lugar a enfermedades de la próstata como la hiperplasia prostática benigna y cáncer de próstata. La LUT en desarrollo es anatómicamente compleja. Por el momento incipiente de próstata comienza en 16,5 días después de la concepción (DPC), numerosos tipos de células están presentes. Vasos, nervios y el músculo liso de residencia en el estroma mesenquimal 3. Este estroma rodea un epitelio de varias capas y da lugar a la próstata del feto a través del receptor de andrógenos dependientes de las señales paracrinas 4. La identidad de la estroma del receptor de andrógenos que responden a los genes necesarios para el desarrollo de la próstata y el mecanismo por el cual la próstata formas epitelio ductal en respuesta a estos genes no se entiende completamente. La capacidad de identificar con precisión los tipos de células y localizar la expresión de factores específicos dentro de ellos es imprescindible para comprender mejor el desarrollo de la próstata. La hibridación in situ (ISH), permite la localización de los ARNm dentro de un tejido. Por lo tanto, este método puede ser utilizado para identificar patrón y el momento de la expresión de moléculas de señalización y sus receptores, con lo que los reguladores de dilucidar el potencial de desarrollo de próstata. Aquí se describe una técnica de alto rendimiento ISH para identificar los patrones de expresión de ARNm en el LUT ratón fetal con vibración micrótomo secciones de corte. Este método ofrece varias ventajas sobre otros protocolos de ISH. Realización de ISH en secciones delgadas adherido a una diapositiva es técnicamente difícil, con frecuencia tienen cryosections calidad estructural de los pobres, mientras tanto cryosections y secciones de parafina a menudo resultan en la resolución de la señal es débil. Realización de ISH sobre todo tejidos de montaje puede resultar en la captura de la sonda. Por el contrario, nuestra técnica de alto rendimiento utiliza corte grueso secciones que muestran la arquitectura del tejido detallada. Modificado tubos de microcentrífuga permiten un fácil manejo de las secciones durante el procedimiento de ISH. Un máximo de 4 transcripciones de ARNm pueden ser examinados a partir de una sola LUT 17.5dpc con un máximo de 24 transcripciones de ARNm detectados en un solo plazo, reduciendo así costes y maximizar la eficiencia. Este método permite que varios grupos de tratamiento para ser procesado de forma idéntica y como una sola unidad, eliminando así cualquier sesgo de interpretación de los datos. Más pertinente para los investigadores de la próstata, este método proporciona una ubicación espacial y temporal de las transcripciones de ARNm de alta y baja abundancia en la uretra del ratón fetal que da lugar a la red de próstata ductal.

Aquí se describe un rendimiento de alta eficiencia<em&gt; In situ</emHibridación&gt; (ISH) método para la visualización de patrones de expresión de ARNm en el desarrollo fetal del ratón secciones de tejido de próstata. El método puede ser fácilmente adaptado para visualizar los patrones de expresión de ARNm en tejidos de ratón o en otros tejidos de otras especies.

Un alto rendimiento In situ Método de hibridación para caracterizar los patrones de expresión de ARNm en el ratón Fetal del tracto urogenital inferior

El desarrollo del tracto urogenital inferior (TUI) es un proceso intrincado. Esta complejidad se evidencia durante la formación de la próstata a partir del macho fetal...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los patrones de expresión de ARNm en tejidos en desarrollo del tracto urogenital inferior de ratón fetal. Esto se logra primero sintetizando una sonda de ribonucleótidos marcada con digoxigenina a partir de una plantilla generada por PCR. El segundo paso del procedimiento consiste en obtener secciones gruesas mediante un microtomo vibrante.El tercer paso consiste en realizar una hibridación in situ en secciones del tracto urogenital inferior contenidas en canastillas personalizadas. Los ARNm se visualizan mediante la detección inmunohistoquímica de sondas de ARN marcadas utilizando el sustrato de fosfatasa alcalina BM purple que precipita. En última instancia, la microscopía puede mostrar la localización espacial y temporal de transcritos de ARNm de baja y alta abundancia en el tracto urogenital inferior del ratón fetal.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunohistoquímica es que las sondas de ARNr son fáciles de generar y pueden diseñarse para reconocer la mayoría de los ARNm en todo el genoma del ratón. Aunque este método proporciona información sobre los patrones de expresión de ARNm du

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Research

Investigación

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Biology

Biología

Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

Un método de transferencia de genes en el cerebro del ratón en desarrollo se describe mediante el uso de un método único quirúrgica y la forma especial de los electrodos. Esta técnica única permite la transfección de ADN de plásmido temporal y espacialmente, lo que ayudará a muchos neurocientíficos en el estudio de desarrollo del cerebro.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

La muerte fetal y perinatal es una característica común en el estudio de las alteraciones genéticas que afectan el desarrollo cardíaco. Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido ha mejorado en 2-D y resolución pueden proporcionar información relevante sobre el desarrollo cardíaco temprano y es un método ideal para detectar el impacto en la estructura y función cardíaca antes de la muerte.

La ecocardiografía fetal murino

Ultra-alta frecuencia de ultrasonido es una poderosa herramienta de imágenes en directo para examinar anormalidades cardíacas en animales pequeños. Su carácter no invasivo permite el mantenimiento del estado fisiológico de los embriones. En este documento, se muestra el uso del modo M ultrasonido para medir el ritmo cardíaco de los embriones en E18.5 en el útero.

En el útero de medición de la frecuencia cardíaca en el ratón por no invasiva Ecocardiografía en modo M

Ratones son ampliamente utilizados para estudiar biología gestacional. Sin embargo, interrupción del embarazo se requiere para este tipo de estudios que impide investigaciones longitudinales y hace necesario el uso de grandes cantidades de animales. Por lo tanto, describimos una técnica no invasiva de la ecografía de alta frecuencia para la detección precoz y seguimiento de eventos tras la implantación en el ratón embarazado.

Un nuevo uso de la ecografía tridimensional de alta frecuencia para la caracterización de embarazo temprano en el ratón

micro-RNAs (miRNAs) son cortas y altamente homólogas secuencias de ARN, que sirven como reguladores post-transcripcionales de mensajero RNAs (mRNAs). Los métodos actuales de detección de miRNA varían en sensibilidad y especificidad. Se describe un protocolo que combina en situ el hibridación y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón.

MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación In Situ

Reproducible, contar los números de los mRNAs de los ovocitos, in situ de la fluorescencia de una molécula de RNA hibridación (RNA-pescado) fue optimizado para las células no adherentes. Ovocitos se recolectaron, cruzado por hibridación con las sondas específicas de transcripción y cuantificaron utilizando un software de cuantificación de la imagen.

Uso de la sola molécula fluorescente en Situ del hibridación (SM-pescado) para cuantificar y Localize mRNAs en oocitos murinos

Aquí presentamos un método de secuenciación de ARNm de una sola célula multiplexado para perfilar la expresión génica en tejidos embrionarios de ratón. El método de secuenciación de mRNA de una sola célula basada en gotas (scRNA-Seq) en combinación con estrategias de multiplexación puede perfilar celdas individuales de varias muestras simultáneamente, lo que reduce significativamente los costos de reactivos y minimiza los efectos experimentales por lotes.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Describimos una técnica para perfilar microARN en embriones de ratón tempranos. Este protocolo supera el desafío de la entrada de células bajas y el enriquecimiento de ARN pequeño. Este ensayo se puede utilizar para analizar los cambios en la expresión de miRNA a lo largo del tiempo en diferentes linajes celulares del embrión de ratón temprano.

Preparación de pequeñas bibliotecas de ARN para la secuenciación de embriones de ratón tempranos

Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Aprende un método de hibridación in situ de alto rendimiento para visualizar patrones de expresión de ARNm en el tracto urogenital inferior fetal del ratón. Esta técnica permite detectar transcritos de baja y alta abundancia.

Un alto rendimiento In situ Método de hibridación para caracterizar los patrones de expresión de ARNm en el ratón Fetal del tracto urogenital inferior (Video) | JoVE Journal

Un alto rendimiento In situ Método de hibridación para caracterizar los patrones de expresión de ARNm en el ratón Fetal del tracto urogenital inferior

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