La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma

El objetivo general de este procedimiento es generar una reconstrucción de piel humana en 3D para estudios de la biología de los melanocitos, el melanoma y las células madre de la piel. Esto se logra recubriendo primero un inserto de bandejas de cultivo de tejidos con colágeno bovino neutralizado. El segundo paso es hacer el compartimento dérmico celular a partir de fibroblastos y colágeno.

A continuación, forme el compartimento epidérmico a partir de queratinocitos mezclados con melanocitos o células de melanoma. El paso final del procedimiento es recolectar una reconstrucción de piel en el día 18 e injertar una reconstrucción de piel en un ratón. En última instancia, los análisis inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes del injerto muestran la arquitectura de la piel normal que contiene melanocitos, la migración y la diferenciación de las células madre normales y los fenotipos de melanoma específicos de la etapa.

Desarrollamos el modelo de reconstrucción de la piel hace 20 años porque, al principio de nuestros estudios, descubrimos que los melanocitos normales o las células de melanoma que se cultivan en una placa se comportan de manera muy diferente a las células que se encuentran en un contexto tisular. Por lo tanto, el modelo de reconstrucción de la piel es ideal para que veamos cómo las células se mueven de un compartimento de la piel a cualquier otro lugar. La mezcla de colágeno de capa acelular previamente preparada en hielo, y luego agregue un mililitro de la solución de amarillo pajizo en cada inserto de un seis.

Bandeja de cultivo de tejidos Pozo: incube la bandeja durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que el gel se solidifique. Durante este tiempo, la solución debe cambiar de color de amarillo a rosa mientras el gel se solidifica en los ojos de tripsina, la fibra humana sale de su matraz de cultivo con 0,25% de EDTA después de cinco minutos. Agregue DMEM que contenga 10% de FBS para neutralizar el proceso de ización.

Recoja las células desprendidas por centrifugación durante cinco minutos a 200 g a temperatura ambiente y luego vuelva a suspender las células a 4,5 veces 10 a la quinta célula por 1,5 mililitros. DMEM suplementado con 10%FBS. A continuación, llene un tubo de 50 mililitros con la mezcla de colágeno de la capa celular previamente preparada y coloque el tubo en hielo.

Agregue 1,5 mililitros de la suspensión de fibroblastos al tubo y mezcle. Agregue tres mililitros de la solución de capa celular de color amarillo pajizo a cada inserto recubierto de capa acelular. A continuación, incubar la bandeja de cultivo de tejidos durante 45 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos con dióxido de carbono al 5% durante el período de incubación.

El color de la solución de la capa celular también debe cambiar de amarillo a rosa. Después de que el gel de la capa superior se solidifique, agregue dos mililitros de DMEM que contengan 10% de FBS en el interior del inserto en la bandeja de cultivo de tejidos y 10 mililitros en el exterior del inserto. Incubar las bandejas de cultivo de tejidos durante cuatro días.

Comprobar al cuarto día que el gel se contrae en el cuarto día de incubación, aspirar el medio tanto desde el interior como desde el exterior de cada inserto. Añade dos mililitros de medio de lavado en el interior y 10 mililitros en el exterior de los insertos para lavar el suero regular. A continuación, incubar las bandejas durante una hora a 37 grados centígrados para la generación de la epidermis.

La primera tripsina son los queratinocitos humanos. Luego, después de cinco minutos, use un inhibidor de tripsina de soja para neutralizar la tripsina después de centrifugar las células desprendidas a 200 g durante cinco minutos. Reus suspende el pellet de células a 4,17 veces 10 a las seis células por mililitro en la piel.

Reconstruya el medio uno después de que se hayan recolectado los queratinocitos. La tripsina congela los melanocitos humanos durante uno o dos minutos. Nuevamente, neutralice la tripsina con un inhibidor de tripsina de soja.

Luego, después de girar las células en las mismas condiciones que antes, vuelva a suspender la pelleta de melanocitos a 8,3 veces 10 a la quinta célula por mililitro en la piel. Reconstruye el medio uno también. A continuación, retire el medio de lavado tanto del interior como del exterior de cada inserto de una bandeja de cultivo de tejidos preparada con capa dérmica.

Reemplace el medio de lavado agregando 1,5 mililitros de medio de piel, reconstruya, uno en el interior y 10 mililitros en el exterior de cada inserto. A continuación, mezcle 600 microlitros de la suspensión de células de queratinocitos con 600 microlitros de la suspensión de melanocitos. Dispensar 200 microlitros de la suspensión de células mixtas.

Gota a gota en el interior de cada inserto. Incubar la bandeja de cultivo de tejidos durante dos días a 37 grados centígrados. Después de incubar las células, aspire la piel, reconstruya el medio uno tanto desde el interior como desde el exterior de cada inserto, y luego agregue dos mililitros de piel, reconstruya el medio, dos al interior y 10 mililitros al exterior del inserto.

Luego incubar las reconstrucciones durante otros dos días a 37 grados centígrados. Después de los segundos dos días de incubación aspire la piel, reconstruya el medio dos desde el interior y el exterior de cada inserto. Ahora agregue 7.5 mililitros de la piel, reconstruya el medio tres solo hasta el exterior de los insertos.

Vuelva a colocar las reconstrucciones en la incubadora y cambie la piel. Reconstruya el medio tres cada dos días hasta el día 18. En el día 18 de la incubación, aspire los medios desde el interior y el exterior de los insertos de una bandeja de cultivo de tejido cargada de reconstrucción cutánea.

Retire los insertos de la bandeja con pinzas. Corta la construcción, incluido el filtro de policarbonato, trazando un círculo cerca del borde con una hoja de bisturí. A continuación, coloque la reconstrucción en el filtro sobre una superficie dura y córtela por la mitad con la cuchilla.

Coloque la mitad de la reconstrucción en un papel negro para biopsia TBS y luego coloque el papel en un casete de histología. Remoje todo el casete en formalina al 10% durante más de cuatro horas. A continuación, coloque el casete en etanol al 70% y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para procesar la reconstrucción para la inclusión en parafina.

Coloque la otra mitad de la reconstrucción en sacarosa al 50% a cuatro grados centígrados durante una o dos horas. Luego cambie la sacarosa a dos molares y luego guárdela a cuatro grados centígrados durante una o dos horas más. Llene un molde base hasta la mitad con una temperatura de corte óptima, medios de congelación u OCT.

Evite las burbujas. Sujete el borde de la reconstrucción con pinzas y retire la reconstrucción de la sacarosa. Colócalo sobre las toallitas Kim hasta que se absorba la sacarosa.

Con unas pinzas y una espátula, transfiera la reconstrucción al bote en la parte superior de la OCT. Cubra la parte superior de la reconstrucción con más OCT hasta que el bote esté completamente lleno. De nuevo, evitando las burbujas.

Coloque el bote de manera uniforme sobre hielo seco picado para permitir que el OCT se congele por completo. A continuación, envuelve el molde base y el papel de aluminio y guárdalo a menos 70 grados centígrados hasta que estés listo para cortarlo con un criostato. Para prepararse para el injerto de una reconstrucción de piel en un ratón, llene un recipiente con nitrógeno líquido y agregue cinco mililitros de DMEM a un tubo de 50 mililitros.

Llene un vaso de precipitados con 600 mililitros de agua del grifo y colóquelo encima de una placa caliente para calentarlo. A continuación, seleccione un ratón hembra de raza exótica sin pelo de alrededor de seis semanas de edad. Después de anestesiar al ratón con isde flúor.

Use un cono nasal para mantener la anestesia durante todo el procedimiento. Aplique lubricante oftálmico estéril y proporcione soporte térmico para prevenir la hipotermia. A continuación, limpie la piel del ratón con tintura de benjuí compuesta e hisopos de preparación con alcohol.

Marque una línea en la parte superior de la parte posterior del ratón para mantener la misma posición para la sutura posterior. Corta un lecho redondo en el lomo del ratón con tijeras y pinzas para iris, y luego cubre el lecho de la herida con esponjas de gasa estériles. Coloque la piel redonda del ratón en el tubo de 50 mililitros de DMEM.

Sumerja el tubo en un recipiente de nitrógeno líquido hasta que todos los medios y tejidos estén totalmente congelados. A continuación, descongele el tubo en un vaso de precipitados con agua caliente hasta que esté totalmente descongelado. Repita este procedimiento, congele y descongele tres veces.

Use una cuchilla quirúrgica para separar una reconstrucción de piel de un inserto. Retire la membrana con mucho cuidado y luego transfiera la reconstrucción de piel a la parte superior del lecho de la herida del ratón. Ahora, coloque la piel del ratón encima de la reconstrucción de la piel.

Asegúrese de que la primera sutura esté en la parte superior del marcador previamente etiquetado y que la segunda esté en la parte inferior. A continuación, utilice dos suturas más en los lados de la reconstrucción de la piel para fijar la piel del ratón. Limpie la piel del ratón después del injerto y luego coloque al ratón en una jaula nueva.

A los 18 días. La epidermis de la piel reconstruida está compuesta por capas de queratinocitos estratificados, la capa basal indiferenciada y las capas diferenciadas secuencialmente están orientadas verticalmente. Tinción de la sección de reconstrucciones con el marcador melanocítico.

S 100, como lo indican las flechas negras, muestra que los melanocitos están alineados en la capa basal de la epidermis y se comunican con múltiples queratinocitos a través de extensiones de dendritas. El compartimento dérmico contiene fibroblastos incrustados en un colágeno de tipo uno, la matriz depositada en la matriz cuatro indica la membrana basal, que separa la epidermis de la dermis. Las siguientes figuras ilustran cómo se desarrollan múltiples capas de queratinocitos en la epidermis.

Cuando las células madre dérmicas marcadas con un vector lentiviral GFP están incrustadas con fibroblastos. En una matriz de colágeno tipo uno, migran a la epidermis y se diferencian en melanocitos al quinto día. Después de sembrar queratinocitos, las células individuales comienzan a migrar fuera de las esferas.

Tenga en cuenta que la epidermis todavía está compuesta por una sola capa. Al octavo día. Unas pocas células llegan a la interfaz de la epidermis dermis.

Para el día 10, las células positivas para GFP están estrechamente alineadas en la posición de la membrana basal, como se puede ver aquí. Las células GFP positivas migradas en la epidermis expresan el marcador melanocítico HMB 45. Cuando se incorporan diferentes etapas de las líneas celulares de melanoma en las reconstrucciones de la piel, el comportamiento de las células refleja sus características in vivo.

Aquí, se pueden ver en esta figura los melanocitos normales y las células de melanoma cultivadas en cultivos 2D. La ubicación y la tasa de crecimiento de los melanocitos normales están estrictamente controladas en las reconstrucciones de la piel, como se ve aquí, en la fase de crecimiento radial, los melanomas primarios proliferan predominantemente en la epidermis, mientras que los melanomas en fase de crecimiento vertical crecen de forma invasiva en la dermis, como se ve en esta figura. Finalmente, aquí se puede ver la forma en que los melanomas metastásicos invaden agresivamente la dermis.

Nuestros estudios en piel normal proporcionan la base para un mejor conocimiento del desarrollo y la progresión del melanoma.