La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma

El objetivo general de este procedimiento es generar un modelo tridimensional de piel humana reconstruida para estudios sobre la biología de los melanocitos, el melanoma y las células madre de la piel. Esto se logra primero recubriendo una inserción de placas de cultivo de tejidos con colágeno bovino neutralizado. El segundo paso consiste en elaborar el compartimento dérmico celular a partir de fibroblastos y colágeno.

A continuación, prepare el compartimento epidérmico a partir de queratinocitos mezclados con melanocitos o células de melanoma. El paso final del procedimiento consiste en obtener un tejido cutáneo reconstruido al día 18 y trasplantar dicho tejido reconstruido en un ratón. Finalmente, los análisis inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes del injerto muestran la arquitectura de la piel normal que contiene melanocitos, así como la migración y la diferenciación de células madre normales y fenotipos de melanoma específicos de cada etapa.

Desarrollamos el modelo de reconstrucción de la piel hace 20 años porque, desde el principio de nuestros estudios, observamos que los melanocitos normales o las células de melanoma cultivadas en una placa se comportan de manera muy diferente a las células que se encuentran en un contexto tisular. Por lo tanto, el modelo de reconstrucción de la piel es ideal para observar cómo las células se desplazan de un compartimento en la piel a cualquier otro lugar. La mezcla de colágeno acelular previamente preparada se coloca en hielo y luego se añade un mililitro de la solución amarillo paja en cada inserto de una placa de seis.

Incube la bandeja de cultivo de tejidos en placa durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que el gel se solidifique. Durante este tiempo, la solución debe cambiar de color de amarillo a rosa mientras el gel se solidifica. Incube los ojos con tripsina, fibroblastos humanos de su frasco de cultivo con tripsina-EDTA al 0,25 % durante cinco minutos. Añada DMEM que contenga 10 % de suero bovino fetal (FBS) para neutralizar el proceso de digestión enzimática.

Recolecte las células desprendidas mediante centrifugación durante cinco minutos a 200 G a temperatura ambiente, y luego resuspenda las células a 4,5 veces 10 a la quinta células por 1,5 mililitros de DMEM suplementado con 10 % FBS. A continuación, llene un tubo de 50 mililitros con la mezcla de colágeno y capa celular previamente preparada y coloque el tubo en hielo.

Añada 1,5 mililitros de la suspensión de fibroblastos al tubo y mezcle bien. Añada tres mililitros de la solución de capa celular amarillo paja a cada inserto recubierto con capa acelular. A continuación, incube la placa de cultivo de tejidos durante 45 minutos a 37 grados Celsius en un incubador de cultivo de tejidos con 5% de dióxido de carbono durante el período de incubación.

El color de la solución de la capa celular también debe cambiar de amarillo a rosa. Una vez que la capa superior del gel se solidifique, agregue dos mililitros de DMEM que contenga 10% de FBS al interior del inserto en la bandeja de cultivo de tejidos, y 10 mililitros al exterior del inserto. Incube las bandejas de cultivo de tejidos durante cuatro días.

El cuarto día, verifique que el gel se haya contraído; aspire el medio tanto del interior como del exterior de cada inserto. Añada dos mililitros de medio de lavado al interior y 10 mililitros al exterior de los insertos para eliminar el suero normal. A continuación, incube las placas durante una hora a 37 grados Celsius para la generación de la epidermis.

Primero, la tripsina actúa sobre los queratinocitos humanos. Luego, después de cinco minutos, utilice el inhibidor de tripsina de soja para neutralizar la tripsina tras centrifugar las células desprendidas a 200 ×g durante cinco minutos. Resuspenda nuevamente el sedimento celular a 4,17 × 10⁶ células por mililitro en piel.

Reconstruya el medio una vez que se hayan recolectado los queratinocitos. Incube los melanocitos humanos con tripsina en hielo durante uno o dos minutos. Nuevamente, neutralice la tripsina con inhibidor de tripsina de soja.

Luego, tras centrifugar las células en las mismas condiciones que antes, re suspenda el sedimento de melanocitos a 8,3 × 10⁵ células por mililitro en medio de reconstrucción cutánea uno. A continuación, retire el medio de lavado tanto del interior como del exterior de cada inserto de una bandeja de cultivo tisular con capa dérmica preparada.

Sustituya el medio de lavado añadiendo 1,5 mililitros de medio de reconstrucción dérmica, uno al interior y 10 mililitros al exterior de cada inserto. Luego mezcle 600 microlitros de la suspensión de células queratinocitos con 600 microlitros de la suspensión de melanocitos. Dispense 200 microlitros de la suspensión celular mixta.

Gota a gota, agregue al interior de cada inserto. Incube la placa de cultivo celular durante dos días a 37 grados Celsius. Después de la incubación, aspire el medio de reconstrucción de la piel uno tanto del interior como del exterior de cada inserto, y luego añada dos mililitros del medio de reconstrucción de la piel dos al interior y 10 mililitros al exterior del inserto.

Luego, incubar los reconstruidos otros dos días a 37 grados celsius. Después de la segunda incubación de dos días, aspirar el medio de reconstrucción de la piel dos desde el interior y el exterior de cada inserto. Ahora, añadir 7,5 mililitros del medio de reconstrucción de la piel tres únicamente al exterior de los insertos.

Coloque los reconstruidos nuevamente en el incubador y cambie el medio de reconstrucción cada dos días hasta el día 18. El día 18 de la incubación, aspire el medio del interior y del exterior de los insertos de una bandeja de cultivo de tejidos cargada con reconstrucciones dérmicas.

Retire los insertos de la bandeja con pinzas. Recorte el constructo incluyendo el filtro de policarbonato, trazando un círculo cercano al borde con una hoja de bisturí. Luego, coloque el reconstruido en el filtro sobre una superficie dura y córtelo por la mitad con la hoja.

Coloque una mitad del reconstruido sobre un papel de biopsia TBS negro y luego coloque el papel en un casete de histología. Sumerja todo el casete en formalina al 10% durante más de cuatro horas. A continuación, coloque el casete en etanol al 70% y guárdelo a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para procesar el reconstruido para inclusión en parafina.

Coloque la otra mitad del reconstruido en sacarosa al 50 % a cuatro grados Celsius durante una a dos horas. Luego cambie la sacarosa a dos molar y almacénela a cuatro grados Celsius durante otras una a dos horas. Llene un molde base hasta la mitad con temperatura óptima de corte, medio de congelación u OCT.

Evite cualquier burbuja. Sujete el borde del reconstruido con pinzas y retire el reconstruido del sacarosa. Colóquelo sobre toallas Kim hasta que se absorba la sacarosa.

Utilizando pinzas y una espátula, transfiera el reconstruido al barquillo encima del OCT. Cubra la parte superior del reconstruido con más OCT hasta que el barquillo esté completamente lleno. Nuevamente, evitando burbujas.

Coloque el barquito uniformemente sobre hielo seco triturado para permitir que el OCT se congele completamente. Luego envuelva el molde base y el aluminio y guárdelo a menos 70 grados Celsius hasta que esté listo para cortarlo con un criostato. Para prepararse para injertar un reconstruido de piel en un ratón, llene un recipiente con nitrógeno líquido y agregue cinco mililitros de DMEM a un tubo de 50 mililitros.

Llene un vaso de precipitados con 600 mililitros de agua del grifo y coloque el vaso sobre una placa calefactora para calentar. Luego seleccione un ratón hembra sin pelo, fuera de cría, de aproximadamente seis semanas de edad. Después de anestesiar el ratón con isoflurano.

Utilice un cono nasal para mantener la anestesia durante todo el procedimiento. Aplique un lubricante oftálmico estéril y proporcione soporte térmico para prevenir la hipotermia. A continuación, limpie la piel del ratón con tintura de benjuí compuesta y toallitas preparadas con alcohol.

Marque una línea en la parte superior de la espalda del ratón para mantener la misma posición durante la sutura posterior. Corte un lecho de herida circular en la espalda del ratón utilizando tijeras de iris y pinzas, y luego cubra el lecho de herida con gasas estériles. Coloque la piel redonda del ratón en el tubo de 50 mililitros con DMEM.

Sumerja el tubo en un recipiente con nitrógeno líquido hasta que todo el medio y el tejido estén completamente congelados. A continuación, descongele el tubo en un vaso de precipitados con agua caliente hasta que se haya descongelado por completo. Repita este procedimiento de congelación y descongelación tres veces.

Utilice una hoja quirúrgica para separar un reconstruido de piel de un inserto. Retire la membrana con mucha precaución y luego transfiera el reconstruido de piel a la parte superior del lecho de la herida del ratón. A continuación, coloque la piel del ratón encima del reconstruido de piel.

Asegúrese de que la primera sutura esté encima del marcador previamente etiquetado y que la segunda esté en la parte inferior. Luego use otras dos suturas en los lados de la reconstrucción de la piel para fijar la piel del ratón. Limpie la piel del ratón después del injerto y luego coloque al ratón en una jaula nueva.

Al día 18, la epidermis de los reconstruidos cutáneos está compuesta por capas estratificadas de queratinocitos; la capa basal indiferenciada y las capas diferenciadas secuenciales están orientadas verticalmente. Tinción de la sección de los reconstruidos con el marcador melanocítico.

S 100, tal como indican las flechas negras, muestra que los melanocitos están alineados en la capa basal de la epidermis y se comunican con múltiples queratinocitos mediante extensiones dendríticas. El compartimento dérmico contiene fibroblastos incrustados en una matriz de colágeno tipo uno; el colágeno tipo cuatro indica la membrana basal, que separa la epidermis de la dermis. Las siguientes figuras ilustran cómo se desarrollan múltiples capas de queratinocitos en la epidermis.

Cuando las células madre dérmicas marcadas con un vector lentiviral GFP se incluyen junto con fibroblastos en una matriz de colágeno tipo uno, migran hacia la epidermis y se diferencian en melanocitos al quinto día. Después de sembrar queratinocitos, células individuales comienzan a migrar desde las esferas.

Téngase en cuenta que la epidermis aún está compuesta por una sola capa. Al octavo día, algunas células alcanzan la interfaz entre la epidermis y la dermis.

Hacia el día 10, las células positivas para GFP están estrechamente alineadas en la posición de la membrana basal, como se puede observar aquí. Las células positivas para GFP que han migrado hacia la epidermis expresan el marcador melanocítico HMB 45. Cuando se incorporan líneas celulares de melanoma en diferentes estadios en reconstrucciones cutáneas, el comportamiento de las células refleja sus características in vivo.

Aquí se pueden observar melanocitos normales y células de melanoma cultivadas en cultivos en 2D en esta figura. La ubicación y la tasa de crecimiento de los melanocitos normales están estrictamente controladas en los reconstruidos cutáneos, como se observa aquí; los melanomas primarios en fase de crecimiento radial proliferan predominantemente en la epidermis, mientras que los melanomas en fase de crecimiento vertical crecen de forma invasiva hacia la dermis, como se ve en esta figura. Finalmente, aquí se puede observar cómo los melanomas metastásicos invaden agresivamente en profundidad hacia la dermis.

Nuestros estudios en piel normal proporcionan la base para un mejor conocimiento del desarrollo y la progresión del melanoma.