Name: La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprende a generar reconstrucciones tridimensionales de piel humana para estudiar melanocitos, melanoma y células madre dérmicas. Este modelo preclínico permite evaluar fármacos y analizar la progresión tumoral in vitro.

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Damos las gracias al Fondo del Instituto Wistar Animal, Servicio de Microscopía, el Fondo para Histotechnology y el Centro de Investigación de suministro. Este estudio fue financiado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de CA 076674, 098101 CA, CA y CA 10815 025874.

1. La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: <ol><li> Preparación de la capa acelular: Mezclar los siguientes reactivos en un tubo de 50 ml en hielo: 0,59 ml de EMEM 10 veces, 50 l 200 mM L-glutamina, 0,6 mL de SFB, 120 l de bicarbonato de sodio al 7,5% y 4,6 ml de colágeno bovino I. Añadir 1 ml de la mezcla en cada inserción de las bandejas de cultivo de tejidos. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente y permitir que el gel se seque. Color de la mezcla debe ser de color amarillo pajizo al color de rosa. </li><li> Trypsinize fibroblastos humanos de los frascos de cultivo con el 0,25% de tripsina / EDTA, añadir DMEM con 10% de SFB para neutralizar. Recoger las células por centrifugación y se resuspenden 0,45 x 10 6 células en 1,5 ml de DMEM con FBS al 10%. De las células madre dérmicas, recoger 6.600 esferas dérmica (cuando las células madre dérmicas crecer en medio de células madre, que forman las esferas de una manera similar a neuroesferas) tocando frasco para separar las esferas, la centrifugación. </li><li> Preparación de la capa celular: Mezclar los siguientes en un tubo de 50 ml en hielo: 1,65 ml de 10X EMEM, 150 l 200 mM L-glutamina, 1,85 ml de SFB, 350 l de bicarbonato de sodio al 7,5%, 14 ml de colágeno I bovino y 1,5 ml de suspensión de fibroblastos desde el paso 2 (otra alternativa es utilizar una combinación de 0,45 x 10 6 fibroblastos dérmicos y 6600 las esferas en 1,5 ml de la piel reconstruir medio que para las células madre dérmicas reconstruye), mezclar bien. Añadir 3 ml de la mezcla a cada capa acelular recubierto de inserción. Incubar durante 45 min a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejidos. Color de la mezcla debe ser de color amarillo pajizo con rosa. Después de que el gel se solidifica, añadir DMEM conteniendo FBS al 10% (2 ml en el interior y 10 exterior ml de insertar en cada pocillo de la piel reconstruir las bandejas). Incubar durante 4 días y asegurarse de que los contratos de gel. </li><li> Aspirar medio de dentro y fuera de cada inserción. Añadir lavado medio (HBSS con el 1% de SFB dializados) 2 ml en el interior y 10 ml en el exterior de inserción con el fin de lavar el suero normal. Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Preparación de la piel reconstruir medio: <ol><li> Por normal de las células madre de melanocitos dérmicos y reconstruye: Para medio básico (500 ml), mezclar los reactivos siguientes: 490 ml de queratinocitos medio libre de suero, 1,8 ml de extracto hipofisario bovino, 10 ml de suero fetal bovino dializado, 500 l de 10 mg / mL SCF, 562,5 l de 4 mg / mL bFGF y 500 l de 264 mg / mL ET-3. Medio I: Añadir 10 l de medio FEAG ml 100 mg / ml y 100 básica. Medio II: Añadir 2 FEAG l de 100 ml de medio básico. Medio III: Añadir 720 l de CaCl 2 1 M de 300 ml de medio básico. </li><li> Para la piel melanoma reconstruir: Para hacer media I (100 ml), mezclar los reactivos siguientes: 72,5 ml de DMEM, 24 ml de F12 (HAM), 2 ml de L-glutamina de 200 mm, 200 hidrocortisona l de 269 g / ml, 200 ITES l de 500X, 200 l O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 200 l de adenina de 90 mm, 200 l de progesterona 2 nM, 240 l de CaCl2 1 M, 200 triyodotironina l de 10 nm y 100 l de suero chelexed ternero recién nacido (disolver 3 g de Chelex 100 en 100 ml de suero, revolver 1,5 horas a 4 ° C, filtro de esterilización). Para hacer media II (100 ml), mezclar los reactivos siguientes: 72,5 ml de DMEM, 24 ml de F12 (HAM), 2 ml de L-glutamina de 200 mm, 200 hidrocortisona l de 269 g / ml, 200 ITES l de 500X, 200 l O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 200 l de adenina de 90 mm, 200 l de progesterona 2 nM, 240 l CaCl2 de 1 M, 200 triyodotironina l de 10 nm y 100 ul suero ternero recién nacido. Para hacer media III (300 ml), mezclar los reactivos siguientes: 142,5 ml de DMEM, 142,5 ml de F12 (HAM), 6 mL de L-glutamina de 200 mm, 600 hidrocortisona l de 269 g / ml, 600 ITES l de 500X , 600 l O-phosphorylethanolamine de 0,05 M, 600 l de adenina de 90 mm, 600 l de progesterona 2 nM, 720 l de CaCl2 1 M, 600 triyodotironina l de 10 nM y 6 ml de suero ternero recién nacido. </li></ol></li><li> Trypsinize queratinocitos humanos de los frascos de cultivo con 0,05% de tripsina / EDTA, neutralizar la tripsina de soja con inhibidor de tripsina (250 mg / L en 1x tampón fosfato salino), la desaceleración resuspender un sedimento celular de 4,17 x 10 6 células / ml en la piel de la reconstrucción a medio I. </li><li> Trypsinize melanocitos o células de melanoma de frascos de cultivo con 0,05% de tripsina / EDTA, neutralizar la tripsina de soja con inhibidor de la tripsina, la desaceleración resuspender un sedimento celular en 0.83 x 10 6 células / ml en la piel de la reconstrucción de mediano I. </li><li> Retirar la ropa medio de dentro y fuera de cada inserción. </li><li> Añadir la piel reconstruir medio I (1,5 ml para el interior y 10 ml en el exterior de cada inserción). </li><li> Tomar 600 l de suspensión celular de los queratinocitos y 600 l de suspensión de células melanocitos o células de melanoma, mezclar bien. Prescindir de 200 l gota mezclada suspensión de células por la caída en el interior de cada inserción. De las células madre dérmicas reconstruir, utilice 100 l de suspensión de queratinocitos solamente. Incubar durante 2 días a 37 º C. </li><li> Aspirar reconstruir la piel medio quetanto desde el interior y el exterior de cada inserción. Añadir la piel reconstruir medio II (2 ml para el interior y 10 ml en el exterior). Incubar durante 2 días a 37 º C. </li><li> Aspirar reconstruir la piel de mediano II desde el interior y el exterior de cada inserción, agregar 7,5 ml reconstruir la piel de mediano III sólo el exterior. Desde este punto, la superficie de la reconstruye empieza a ser expuesto al aire. Cambio de medio III en días alternos hasta el día 18. </li><li> La piel de la cosecha reconstruir el día 18: <ol><li> Aspirar los medios de comunicación desde el interior y el exterior de las inserciones. </li><li> Retire de la bandeja de inserciones con las pinzas. </li><li> Cortar la reconstrucción (incluyendo el filtro de policarbonato), trazando un círculo cerca del borde con una hoja de bisturí. </li><li> Cortar la reconstrucción y el filtro en la mitad sobre una superficie dura. </li></ol></li><li> Para las secciones de parafina: el lugar de la mitad de la reconstrucción en un cassette histología entre dos papeles de negro TBS biopsia y disfrutar de la cinta entera en formol al 10% por más de 4 horas. A continuación, coloque el cassette en el 70% de etanol y almacenar a 4 ° C hasta que esté listo para procesar la reconstrucción de inclusión en parafina. </li><li> Para las secciones de congelados: <ol><li> Coloque la otra mitad de reconstruir en el 50% de sacarosa a 4 ° C durante 1-2 horas, a continuación, cambiar la sacarosa 2M y lo almacenan a 4 ° C durante 1-2 horas. </li><li> Prescindir de los medios de comunicación de corte óptima temperatura de congelación (OCT) en un molde de base disponible para que ocupe el 50% de la embarcación. Evitar las burbujas en la OCT. </li><li> Agarra el borde de la reconstrucción con una pinza y retire la reconstrucción de la sacarosa. Colócalo en Kimwipes hasta el Kimwipes absorber la sacarosa. </li><li> La transferencia de la reconstrucción en la base del molde en la parte superior de la OCT, el uso de fórceps y una espátula. Cubra la parte superior de la reconstrucción de octubre con más hasta que la base del molde está completamente llena. Asegúrese de que usted no tiene todas las burbujas de octubre en el que se hará el corte difícil. </li><li> Coloque la base del molde de manera uniforme sobre el hielo seco triturado, y permitir que el octubre de congelar por completo. </li><li> Envuelva la base del molde en papel de aluminio y lo almacenan a -70 ° C hasta que esté listo para cortar con un criostato. </li></ol></li><li> Injerto de piel en la reconstrucción de un ratón: <ol><li> Preparar un tubo Falcon de 50 ml con 5 ml de DMEM (para congelar y descongelar la piel del ratón). </li><li> Use una hembra de ratón SCID outbred pelo alrededor de 6 semanas. </li><li> El ratón es anestesiados con (sistema de anestesia EZ) isoflurano: la anestesia inicial se realiza en la cámara de inducción con isoflurano 4% (antes de que el ratón se mueve en el lecho quirúrgico) y mantener la anestesia a través de un respiradero del cono de nariz durante el procedimiento (isoflurano: 1,5-2% ). El calor ayuda de un cojín calentado para prevenir la hipotermia y el lubricante oftálmica estéril aplicada para evitar lesiones oculares durante la anestesia. </li><li> Ponga 600 ml de agua en un vaso y dejar en la parte superior de un plato caliente para mantener la temperatura del agua entre 40 - 60 ° C. </li><li> Limpie la piel del ratón con la tintura de benjuí compuesta e hisopos con alcohol de preparación. </li><li> Marcar una línea en la parte superior de la espalda del ratón para mantener la misma posición de sutura después. </li><li> Corte un lecho de la herida alrededor de 1,2 cm de diámetro en la parte posterior superior del ratón usando tijeras y pinzas de Iris. Cubra la herida con gasas estériles. Poner la piel de ratón ronda en 5 ml de DMEM, luego dejar en el contenedor de nitrógeno líquido hasta que totalmente congelados. Descongelar el tubo en agua caliente en la parte superior de una placa caliente hasta que estén completamente descongeladas. Repetir 3 veces. </li><li> Separe la piel de reconstruir a partir de la Transwell con hoja de bisturí y quitar la membrana con mucho cuidado, la transferencia de la piel reconstruir (lado epidermis hacia arriba) en la parte superior del lecho de la herida. </li><li> Lugar de la piel del ratón (lado epidermis hacia arriba) en la parte superior de la piel reconstruir. </li><li> Hacer la primera sutura en el marcador antes marcados, el segundo en la parte inferior, a continuación, dos puntos de sutura más en los lados para fijar la piel de ratón. </li><li> Limpie la piel del ratón después del injerto. Quitar ojiva y mantener ratón en el teclado se calienta hasta que despierto y ambulatoria. </li><li> Poner el ratón en una jaula nueva. </li><li> Analgesia post-operatorio: Meloxicam (1 mg / kg) por vía subcutánea inmediatamente después de la cirugía, 24 y 48 horas después de la cirugía. </li></ol></li></ol> 2. Los resultados representativos: Reconstruye la piel con melanocitos normales y células dérmicas madre La piel se reconstruye se cultivan en un especial de 6 y bandeja con insertos. El compartimiento de la dermis se cultivaron en DMEM con FBS al 10% para los primeros cuatro días (Fig. 1A). La piel reconstruir medio que se utiliza cuando los queratinocitos se siembran con los melanocitos o células de melanoma (Fig. 1B). La epidermis es expuesto al aire en el día 9 y esto permite que los queratinocitos de diferenciar (Fig. 1C). En el día 18, la epidermis de la piel reconstruye está compuesto por capas estratificadas de queratinocitos. La capa basal indiferenciada y capas secuencialmente diferenciados se orientan verticalmente (Fig. 1D). Manchación de la sección reconstruye con la melanocíticos S100 marcador muestra que los melanocitos se alinean en la capa basal de la epidermis y se comunican con los queratinocitos a través de múltiples extensiones dendríticas (Fig. 1E). El compartimiento de la dermis contiene fibroblastos embebidos en una matriz de colágeno tipo I. Depositado colágeno IV indica la membrana basal, que separa la epidermis de la dermis (Fig. 1F). Cuando las células madre dérmicas (marcado con GFP lentiviral vector) se encajan con los fibroblastos en una matriz de colágeno I, emigran a la epidermis y se diferencian en melanocitos (1), (Fig. 2). Las múltiples capas de queratinocitos de la epidermis se desarrollan. Reconstruye la piel de los tumores de melanoma Los estudios clínico-patológicos indican que los melanomas progreso en una forma gradual: los nevos adquiridos comunes, nevos displásicos, RGP (fase de crecimiento radial) melanomas, VGP (fase de crecimiento vertical) y melanomas metastásicos melanomas (7). Las diferentes etapas de líneas celulares de melanoma son morfológicamente similares entre sí en 2-D de cultivo (Fig. 3A-D), pero cuando se incorporan en la piel reconstruye, el comportamiento de las células refleja sus características en vivo. La ubicación y la tasa de crecimiento de melanocitos normales son estrictamente controlados en la piel reconstruye (Fig. 3E). RGP principal melanomas WM35 proliferan sobre todo en la epidermis (Fig. 3F), mientras que los melanomas VGP WM793 crecer invasiva en la dermis (Fig. 3G). Metastásico melanomas 1205Lu agresiva invadir profundamente en la dermis (Fig. 3H). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Reconstruye la piel con melanocitos normales. El aspecto macroscópico de la piel reconstruye se muestra en la AC. Los fibroblastos A. mezclado con colágeno son cultivadas en DMEM con 10% de SFB y compartimiento de la forma cutánea. B. Los queratinocitos y los melanocitos se siembran en la parte superior de la dermis y crecer en la piel reconstruir medio. C. La epidermis es expuesto al aire en el día 9. D. H &amp; E manchadas de la piel se presenta la reconstrucción de la epidermis compuesta vertical, orientada a la capa basal, y de forma secuencial las capas de células diferenciadas estratificado. La dermis contiene fibroblastos embebidos en una matriz de colágeno tipo I. E. S100-positivo melanocitos (flechas en negro) se alinean en la membrana basal y se comunican con múltiples queratinocitos. F. El colágeno IV-tinción indica la membrana basal, que separa la epidermis de la dermis. Todos los marcajes en el DF se realizaron en fijado en formol e incluidos en parafina secciones. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Células de la dermis de la piel del tallo reconstruye migrar a la epidermis y se diferencian en melanocitos. En el día 5 después de la siembra de los queratinocitos, las células individuales GFP-positivo (verde) de iniciar la migración hacia fuera de las esferas. La epidermis está todavía compuesta de una sola capa. A los 8 días, unas pocas células llegar a la interfaz de la epidermis-dermis. El día 10, las buenas prácticas agrarias de células positivas están estrechamente alineadas en la posición de la membrana basal. La GFP-positivas las células migran en el marcador epidermis expresar melanocíticos HMB45 (rojo, como indican las flechas blancas). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). La epidermis se desarrolla en forma de capas múltiples. La membrana basal está indicada con líneas blancas punteadas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Reconstruye la piel de las diferentes etapas de los melanomas: AD. Melanocitos normales y células de melanoma en cultivos 2D. A. Los melanocitos del prepucio. B. RGP WM35 células. C. VGP WM793 células. D. las células del melanoma metastásico 1205Lu. E. melanocitos normales se encuentran en la membrana basal. F. RGP melanoma WM35 las células crecen en grupos de células en la epidermis. G. VGP melanoma WM793 células invaden la dermis a través de la membrana basal. H. melanoma metastásico 1205Lu agresiva células invaden profundamente en la dermis. Solución de problemas <table border="1"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Solución de problemas </td></tr><tr><td> Mezcla de colágeno no se solidifica </td><td> Color colágeno mezcla debe ser de color amarillo pajizo con rosa, de lo contrario el pH es malo y el colágeno no gel. Si el color es amarillo brillante, más bicarbonato de sodio se debe agregar gota a gota. </td></tr><tr><td> Colágeno antes de tiempo se precipita en la mixuture </td><td> Mantenga todos los componentes en el hielo hasta que la mezcla de colágeno se coloca en la inserción </td></tr><tr><td> Colágeno contratados ni siquiera es (un lado es más grueso que el otro lado) </td><td> Calibrar la plataforma de la incubadora </td></tr><tr><td> La epidermis está formada por al menos tres capas de queratinocitos. </td><td> Use los queratinocitos no diferenciados a menor pasajes </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li>
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No hay conflictos de interés declarado.

Hemos descrito la generación de la piel 3D reconstruye con melanocitos humanos normales, células de la piel del tallo y las células del melanoma. Cuando se cultiva en un cultivo monocapa, las células pigmentadas presentan una morfología similar (aplanado, eje o más dendríticas en forma), independientemente de su origen de la etapa clínica. En contraste, la piel 3D reconstruye recapitular etapa específica de las propiedades de las células del melanoma. Normal de melanocitos humanos residen en la membrana basal entre la epidermis y la dermis como células individuales. Las células de melanoma primario RGP crecer como pequeños grupos a lo largo de la membrana basal mientras que las células VGP más agresivo melanoma creciendo a medida que grandes grupos romper a través de la membrana basal en la dermis. Las células de melanoma metastásico crecer en todas direcciones e invadir profundamente en la dermis como células individuales o grupos. El análisis cuantitativo se puede realizar en este modelo, midiendo la profundidad de la invasión y el grado de proliferación. Además de la caracterización de las células melanocitos normales y malignos, utilizando el modelo que directamente puede inducir la diferenciación de las células madre dérmicas en los melanocitos madurado, que el hogar de la capa basal de la epidermis y establecer una comunicación de buena fe con los queratinocitos a través de la regulación positiva de la E-cadherina ( 6). Usando vectores virales, que son capaces de activar o desactivar la función del gen para una mejor comprensión de la dinámica y la importancia funcional de los genes expresados ​​por cada tipo de células en la piel reconstruye, que promete ser un modelo eficiente para estudiar no sólo los mecanismos de transformación de los melanocitos , sino también la progresión del melanoma (8). Observación a largo plazo de fenotipos de células ha sido posible a través de injertos de piel reconstruye a animales inmunodeficientes. Como un ser humano de la piel del ratón quimera es una excelente herramienta de investigación para estudiar melanomagenesis y metástasis de melanoma. Reconstruye la piel también puede ser una plataforma útil para la evaluación de medicamentos. Muchos medicamentos que erradicar células de cáncer en condiciones de cultivo 2D a menudo tienen poco efecto en solicitudes experimentales como clínicos. Como se observa en el tumor en vivo, las células del melanoma en cultivos de 3D ​​a menudo son resistentes a los fármacos que las células en cultivos de responder a las 2D, lo que sugiere que el microambiente modula las vías de señalización en el melanoma. Para el descubrimiento de fármacos con éxito, la piel 3D reconstruir el modelo es una herramienta ideal preclínicos para predecir los efectos de los compuestos in vivo (9,10). En resumen, la piel reconstruir modelos de cerrar la brecha entre in vitro e in vivo. Que conducirá a una mejor comprensión de cuáles son los genes involucrados en la transformación y cómo las células madre contribuyen a esa transformación.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> EMEM 10x </td><td> Bio Whittaker </td><td> 12-684F </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH-30071.02 </td></tr><tr><td> Tendón bovino extraídas con ácido colágeno </td><td> Organogénesis </td><td> 200/50 </td></tr><tr><td> Cultivo de tejidos de 6 pocillos bandejas con anillos </td><td> Organogénesis </td><td> 9285 </td></tr><tr><td> Queratinocitos medio libre de suero </td><td> Gibco </td><td> 17005042 </td></tr><tr><td> Suero de ternera fetal dializado </td><td> Hyclone </td><td> SH-30079.03 </td></tr><tr><td> recombinante madre humanas factor de células </td><td> Fitzgerald Industrias </td><td> RDI-307-255X </td></tr><tr><td> FGF básico </td><td> Fitzgerald Industrias </td><td> 30R-AF015 </td></tr><tr><td> La endotelina-3, humanos </td><td> Estadounidense péptido Co. </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> Sigma </td><td> C-7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRH Biosciences </td><td> 56430-10L </td></tr><tr><td> F12 (HAM) </td><td> Gibco </td><td> 11765-54 </td></tr><tr><td> Hidrocortisona </td><td> Sigma </td><td> H-0888 </td></tr><tr><td> La insulina, transferrina, etanolamina, selenio (ITES) </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O-Phosphorylethanolamine </td><td> Sigma </td><td> P0503 </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> Sigma </td><td> A9795 </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> Sigma </td><td> P-8783 </td></tr><tr><td> Triyodotironina </td><td> Sigma </td><td> T-5516 </td></tr><tr><td> De suero de ternero recién nacido </td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> 10% de tampón de formol </td><td> Surgipath </td><td> 00600 </td></tr><tr><td> Los medios de comunicación de corte óptimo de temperatura de congelación (OCT) </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Cintas de múltiples </td><td> Surgipath </td><td> 02293-BX </td></tr><tr><td> TBS biopsia papeles </td><td> Triángulo de Ciencias Biomédicas </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> TBS biopsia papeles </td><td> Triángulo de Ciencias Biomédicas </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> Moldes desechables Base </td><td> Pescador </td><td> 15 a 182-501C </td></tr><tr><td> Compuesto de tintura de benjuí </td><td> Desechables profesional, Inc, </td><td> S42450 </td></tr><tr><td> El alcohol de preparación hisopos </td><td> CVS Pharmacy </td><td></td></tr><tr><td> De seda trenzada 5-0 Negro </td><td> Ethicon </td><td> 682G </td></tr><tr><td> Esponjas de gasa (estéril) </td><td> CVS Pharmacy </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td> Iris tijeras </td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td> Hojas de bisturí </td><td> Pluma </td><td> 2976 </td></tr><tr><td> EZ anestesia </td><td> Euthanex Corp. </td><td></td></tr><tr><td> SCID ratón sin pelo outbred </td><td> Charles River </td><td></td></tr></tbody></table>

la piel humana tridimensional reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

La mayoría de los estudios in vitro en la biología de la piel experimentales se han realizado en los monocultivos de dos dimensiones (2D), mientras que la evidencia acumulada sugiere que las células se comportan de manera diferente cuando son cultivadas en un 3D matriz extracelular y también interactuar con otras células (1-5) . Los modelos de ratón han sido ampliamente utilizados para estudiar la morfogénesis de tejidos in vivo. Sin embargo ratón y la piel humana tiene diferencias significativas en la arquitectura celular y la fisiología, lo que hace difícil extrapolar los estudios en ratones a los seres humanos. Dado que los melanocitos de la piel del ratón son en su mayoría localizadas en los folículos pilosos, que tienen distintas propiedades biológicas de los humanos, que localizan principalmente en la capa basal de la epidermis. El desarrollo reciente de la piel humana en 3D los modelos ha permitido reconstruir el campo para investigar célula-matriz y célula-célula la interacción entre diferentes tipos de células. El reconstruye consistirá en una &quot;dermis&quot; con fibroblastos embebidos en una matriz de colágeno I, un &quot;epidermis&quot;, que se compone de queratinocitos estratificada y diferenciada y una membrana basal funcional, que separa la epidermis de la dermis. El colágeno proporciona andamios, transporte de nutrientes, y las posibilidades de interacción de célula a célula. Los modelos de piel en 3D que incorpora células melanocíticas recapitular las características naturales de la homeostasis de los melanocitos y la progresión del melanoma en la piel humana. Como in vivo, los melanocitos de la piel reconstruida se localizan en la membrana basal intercaladas con queratinocitos capa basal. Las células del melanoma exhiben las mismas características que reflejan la etapa del tumor original (RGP, VGP y células metastásicas de melanoma) en vivo. Recientemente, las células madre dérmicas han sido identificados en la dermis humana (6). Estas células madre multi-potentes pueden migrar a la epidermis y se diferencian de los melanocitos.

En este informe se describe la piel en tres dimensiones reconstruir el modelo que imita la piel humana en la arquitectura y la composición. Fisiología de los melanocitos, la progresión del melanoma y el destino de las células madre dérmicas han sido investigados con la piel reconstruir el modelo. El modelo es también útil como una herramienta para la evaluación preclínica de medicamentos.

La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma

La mayoría de los estudios in vitro en biología experimental de la piel se han llevado a cabo en monocultivos bidimensionales (2D), mientras que la evidencia acumulada sugiere que las células...

El objetivo general de este procedimiento es generar un tejido cutáneo humano tridimensional para estudios sobre la biología de los melanocitos, el melanoma y las células madre de la piel. Esto se logra primero recubriendo una inserción de bandejas de cultivo de tejidos con colágeno bovino neutralizado. El segundo paso consiste en formar el compartimento dérmico celular a partir de fibroblastos y colágeno.A continuación, prepare el compartimento epidérmico a partir de queratinocitos mezclados con melanocitos o células de melanoma. El paso final del procedimiento consiste en obtener un reconstituto de piel al día 18 y trasplantar dicho reconstituto sobre un ratón. En última instancia, los análisis inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes del injerto muestran la arquitectura de una piel normal que contiene melanocitos, así como la migración y diferenciación de células madre normales y fenotipos específicos del melanoma según la etapa.Desarrollamos el modelo de reconstrucción de la piel hace 20 años porque, desde el principio de nuestros estudios, descubrimos que los melanocitos normales o las células de melanoma cultivadas en un plato se comportan de manera muy distinta a las células que se encuentran en un contexto tisular. Por lo tanto, el modelo de reconstrucción de la piel es ideal para observar cómo las células se desplazan de un compartimento en la piel a cualquier otro lugar. La mezcla de colágeno acelular previamente preparada se mantiene en hielo y luego se añade un mililitro de la solución de color amarillo paja en cada inserto de una placa de seis.Incube la bandeja de cultivo de tejidos en pocillos durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que el gel se solidifique. Durante este tiempo, la solución debe cambiar de color de amarillo a rosa mientras el gel se solidifica. Pase las células fibroblastos humanas desde su frasco de cultivo con tripsina-EDTA al 0,25% tras cinco minutos. Añada DMEM que contenga 10% de SFB para neutralizar el proceso de disociación.Recolecte las células desprendidas mediante centrifugación durante cinco minutos a 200 G a temperatura ambiente, y luego resuspenda las células a 4,5 veces 10 a la quinta células por 1,5 mililitros. DMEM suplementado con 10 % FBS. A continuación, llene un tubo de 50 mililitros con la mezcla de colágeno y capa celular previamente preparada y coloque el tubo en hielo.Agregue 1,5 mililitros de la suspensión de fibroblastos al tubo y mezcle bien. Añada tres mililitros de la solución de capa celular amarillo paja a cada inserto recubierto con capa acelular. A continuación, incube la bandeja de cultivo de tejidos durante 45 minutos a 37 grados Celsius en un incubador de cultivo de tejidos con 5% de dióxido de carbono durante el período de incubación.El color de la solución de la capa celular también debe cambiar de amarillo a rosa. Una vez que la capa superior del gel se solidifique, agregue dos mililitros de DMEM que contenga 10% FBS al interior del inserto en la bandeja de cultivo de tejidos, y 10 mililitros al exterior del inserto. Incube las bandejas de cultivo de tejidos durante cuatro días.El cuarto día, compruebe que el gel se ha contraído; aspire el medio tanto del interior como del exterior de cada inserto. Añada dos mililitros de medio de lavado al interior y 10 mililitros al exterior de los insertos para eliminar el suero habitual. A continuación, incube las placas durante una hora a 37 grados Celsius para la generación de la epidermis.Primero, la tripsina se aplica a los queratinocitos humanos. Luego, después de cinco minutos, utilice el inhibidor de tripsina de soja para neutralizar la tripsina tras centrifugar las células desprendidas a 200 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el sedimento celular a 4,17 × 10⁶ células por mililitro en piel.Reconstruya el medio una vez que se hayan recolectado los queratinocitos. Incube los melanocitos humanos con tripsina en hielo durante uno o dos minutos. Nuevamente, neutralice la tripsina con inhibidor de tripsina de soja.Luego, tras centrifugar las células en las mismas condiciones que antes, re-suspenda el sedimento de melanocitos a 8,3 × 10⁵ células por mililitro en medio de reconstrucción cutánea. También re-suspenda el medio uno. A continuación, retire el medio de lavado tanto del interior como del exterior de cada inserto de una bandeja de cultivo tisular con capa dérmica preparada.Sustituya el medio de lavado añadiendo 1,5 mililitros de medio de reconstrucción dérmica, uno al interior y 10 mililitros al exterior de cada inserto. Luego mezcle 600 microlitros de la suspensión de queratinocitos con 600 microlitros de la suspensión de melanocitos. Dispense 200 microlitros de la suspensión mixta de células.Gota a gota en el interior de cada inserto. Incubar la bandeja de cultivo de tejidos durante dos días a 37 grados Celsius. Tras la incubación, aspirar el medio de reconstrucción de la piel, medio uno, tanto del interior como del exterior de cada inserto, y luego añadir dos mililitros del medio de reconstrucción de la piel, medio dos, al interior y 10 mililitros al exterior del inserto.Luego, incubar los reconstrucciones durante otros dos días a 37 grados celsius. Después de la segunda incubación de dos días, aspirar el medio de reconstrucción de la piel dos desde el interior y el exterior de cada inserto. Ahora, añadir 7,5 mililitros del medio de reconstrucción de la piel tres únicamente al exterior de los insertos.Coloque los reconstruidos nuevamente en el incubador y cambie el medio. Renueve el medio de los reconstruidos cada dos días hasta el día 18. En el día 18 de la incubación, aspire el medio del interior y del exterior de los insertos de una bandeja de cultivo de tejidos con reconstrucciones dérmicas.Retire los insertos de la bandeja con pinzas. Recorte el constructo incluyendo el filtro de policarbonato trazando un círculo cercano al borde con una hoja de bisturí. Luego, coloque el reconstructo en el filtro sobre una superficie dura y córtelo por la mitad con la hoja.Coloque una mitad del reconstruido sobre un papel de biopsia TBS negro y luego coloque el papel en una caja de histología. Sumerja toda la caja en formalina al 10% durante más de cuatro horas. A continuación, coloque la caja en etanol al 70% y almacénela a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para procesar el reconstruido para inclusión en parafina.Coloque la otra mitad del reconstruido en sacarosa al 50 % a cuatro grados Celsius durante una a dos horas. Luego cambie la sacarosa a dos molar y almacénela a cuatro grados Celsius durante otras una a dos horas. Llene un molde base hasta la mitad con temperatura de corte óptima, medio de congelación u OCT.Evite cualquier burbuja. Sujete el borde del reconstruido con pinzas y retire el reconstruido del azúcar. Colóquelo sobre toallitas Kim hasta que se absorba el azúcar.Utilizando pinzas y una espátula, transfiera el reconstruido al barco encima del OCT. Cubra la parte superior del reconstruido con más OCT hasta que el barco esté completamente lleno. Nuevamente, evitando burbujas.Coloque el barco uniformemente sobre hielo seco triturado para permitir que el OCT se congele completamente. Luego envuelva el molde base y el papel de aluminio y guárdelo a menos 70 grados Celsius hasta que esté listo para cortarlo con un criostato. Para prepararse para el injerto de un reconstruido cutáneo en un ratón, llene un recipiente con nitrógeno líquido y agregue cinco mililitros de DMEM a un tubo de 50 mililitros.Llene un vaso de precipitados con 600 mililitros de agua del grifo y coloque el vaso sobre una placa calefactora para calentar. Luego seleccione un ratón hembra sin pelo, fuera de cría, de aproximadamente seis semanas de edad. Después anestesie el ratón con isoflurano.Utilice un cono nasal para mantener la anestesia durante todo el procedimiento. Aplique lubricante oftálmico estéril y brinde soporte térmico para prevenir la hipotermia. A continuación, limpie la piel del ratón con tintura de bencina compuesta y toallitas preparadas con alcohol.Marque una línea en la parte superior de la espalda del ratón para mantener la misma posición durante la sutura posterior. Corte un lecho de herida circular en la espalda del ratón utilizando tijeras de iris y pinzas, y luego cubra el lecho de herida con esponjas de gasa estéril. Coloque la piel redonda del ratón en el tubo de 50 mililitros de DMEM.Sumerja el tubo en un recipiente con nitrógeno líquido hasta que todos los medios y el tejido estén completamente congelados. A continuación, descongele el tubo en un vaso de agua caliente hasta que se descongele por completo. Repita este procedimiento de congelación y descongelación tres veces.Utilice una hoja quirúrgica para separar un reconstruido de piel de un inserto. Retire la membrana con mucha precaución y luego transfiera el reconstruido de piel a la superficie del lecho de la herida en el ratón. A continuación, coloque la piel del ratón encima del reconstruido de piel.Asegúrese de que la primera sutura esté encima del marcador previamente etiquetado y de que la segunda esté en la parte inferior. Luego use otras dos suturas en los lados de la reconstrucción de la piel para fijar la piel del ratón. Limpie la piel del ratón después del injerto y luego coloque al ratón en una jaula nueva.En el día 18, la epidermis de los reconstrucciones cutáneas está compuesta por capas estratificadas de queratinocitos; la capa basal indiferenciada y las capas diferenciadas secuenciales están orientadas verticalmente. Tinción de la sección de las reconstrucciones con el marcador melanocítico.S 100, tal como indican las flechas negras, muestra que los melanocitos están alineados en la capa basal de la epidermis y se comunican con múltiples queratinocitos mediante extensiones dendríticas. El compartimento dérmico contiene fibroblastos incrustados en una matriz de colágeno tipo uno; el colágeno tipo cuatro indica la membrana basal, que separa la epidermis de la dermis. Las siguientes figuras ilustran cómo se desarrollan múltiples capas de queratinocitos en la epidermis.Cuando las células madre dérmicas marcadas con un vector lentiviral GFP se incorporan junto con fibroblastos en una matriz de colágeno tipo uno, migran hacia la epidermis y se diferencian en melanocitos al quinto día. Después de sembrar queratinocitos, células individuales comienzan a migrar desde las esferas.Téngase en cuenta que la epidermis aún está compuesta por una sola capa. Al octavo día, algunas células alcanzan la interfaz entre la epidermis y la dermis.Al día 10, las células positivas para GFP están estrechamente alineadas en la posición de la membrana basal, como se puede observar aquí. Las células positivas para GFP migradas en la epidermis expresan el marcador melanocítico HMB 45. Cuando se incorporan líneas celulares de melanoma en diferentes estadios en reconstrucciones cutáneas, el comportamiento de las células refleja sus características in vivo.Aquí se pueden observar melanocitos normales y células de melanoma cultivadas en cultivos 2D en esta figura. La ubicación y la tasa de crecimiento de los melanocitos normales están estrictamente controladas en los reconstrucciones de piel, como se observa aquí; los melanomas primarios en fase de crecimiento radial proliferan predominantemente en la epidermis, mientras que los melanomas en fase de crecimiento vertical crecen de forma invasiva hacia la dermis, como se ve en esta figura. Finalmente, aquí se puede observar la forma en que los melanomas metastásicos invaden agresivamente en profundidad hacia la dermis.Nuestros estudios en piel normal proporcionan la base para un mejor conocimiento del desarrollo y la progresión del melanoma.

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La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma (Video) | JoVE Journal

La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma

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