Introducción a la técnica de ultrasonido enfocado destrucción de microburbujas

UTMD significa destrucción dirigida por ultrasonido de microburbujas. UTMD puede utilizarse para dirigir la administración específica de moléculas bioactivas, incluyendo genes terapéuticos, a órganos diana accesibles mediante ultrasonido, como el corazón y el hígado. En UTMD, moléculas bioactivas como plásmidos con carga negativa, vectores de ADN que codifican un gen de interés, se añaden a las cubiertas catiónicas de agentes de contraste de microburbujas lipídicas; las microburbujas unidas al vector pueden administrarse por vía intravenosa o directamente en el ventrículo izquierdo del corazón.

En animales más grandes, también pueden administrarse mediante un catéter coronario intracoronario con o sin período de permanencia. La administración subsiguiente desde la circulación hasta un órgano diana ocurre de forma óptima mediante la cavitación acústica a una frecuencia resonante de las microburbujas. Parece probable que la energía mecánica generada por la destrucción de las microburbujas resulte en la formación transitoria de poros en las células endoteliales o entre ellas, en la microvasculatura de la región diana.

Como resultado de este efecto de sauna parion, se incrementa la eficiencia de transfección dentro y a través de las células endoteliales, y los vectores que codifican transgenes pueden depositarse en el tejido circundante de interés. El ADN plasmático que permanece en la circulación se degrada rápidamente por las nucleasas en la preparación de microburbujas en sangre. Una alícuota de una solución stock de microburbujas preparada que contiene glucosa, solución salina tamponada con fosfato, fosfatidilcolina de dietilglicerol tres y dietilglicerol tres.

Primero, se incuba la fosfatidil etanolamina a 40 grados Celsius durante 15 minutos. Luego, se transfiere la solución de microburbujas calentada a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros que contiene glicerol y entre uno y dos miligramos de ADN plasmático purificado que codifica un constructo de expresión para el gen de interés. Se añade solución salina tamponada con fosfato hasta alcanzar un volumen final de 500 microlitros.

A continuación, el aire en el microtubo se reemplaza con gas de octafluoropropano. Luego, el microtubo se agita vigorosamente en un amalgamador dental durante 20 segundos. La calibración del equipo antes del primer uso: el transductor de cavitación UTMD de un megahercio debe calibrarse para garantizar un índice mecánico y una repetición de pulsos adecuados.

Un transductor sumergido de un megahercio está conectado a un generador de formas de onda mediante un amplificador de potencia. El transductor se coloca en un recipiente de plástico lleno de agua, orientado directamente hacia un hidrófono, que ha sido conectado a un osciloscopio mediante un amplificador de carga; la frecuencia de la forma de onda, la amplitud, el ciclo de ráfaga y la amplificación de potencia pueden modificarse para obtener el ciclo de trabajo adecuado y el índice mecánico óptimo para cavitación de las microburbujas. En este montaje, hemos calibrado el sistema a un índice mecánico equivalente a aproximadamente 1,3 a un megahercio para la administración de microburbujas y UTMD antes de la administración de microburbujas y U-T-M-D-C 57 BL seis ratones son anestesiados con 100 miligramos por kilogramo de ketamina y cinco miligramos por kilogramo de xilacina mediante inyección IP.

La administración de microburbujas se realiza por vía intravenosa mediante una inyección directa en el ventrículo izquierdo del corazón o a través de la cateterización de la vena caudal, lo cual se mostrará más adelante para la inyección cardíaca directa. Se inyecta un volumen de hasta 100 microlitros de la solución de microburbujas cargada con ADN plasmídico mediante una aguja de calibre 30 insertada en el espacio intercostal anterior cuarto bajo visualización ultrasonográfica, dentro del ventrículo izquierdo del corazón. El bolo de la solución de microburbujas resultante de la inyección intraventricular izquierda se visualiza utilizando un transductor de ultrasonido de alta frecuencia de Visual Sonics colocado en posición fija sobre el tórax del ratón en una vista de eje largo.

Inmediatamente después de la inyección, se realiza la destrucción de microburbujas durante aproximadamente cinco minutos, utilizando un segundo transductor de menor tamaño y baja frecuencia, de 1,0 megahercios, colocado directamente sobre el órgano deseado para dirigir la destrucción a esta región. Se administra ultrasonido al hígado con una frecuencia de repetición de pulsos de 1,0 megahercios, un índice mecánico equivalente a aproximadamente 1,3 a 1,5 y un período de repetición de pulso de 100 milisegundos cada 20 ciclos, o bien el pulso puede sincronizarse con el ECG del ratón mediante ráfagas de tres cuadros de ultrasonido cada cuatro a seis ciclos cardíacos. Para el método de administración de microburbujas por vena caudal, el ratón se anestesia de la misma manera que con una jeringa que contiene el plásmido.

Las microburbujas unidas al ADN se conectan a un catéter intravenoso en la vena de la cola con aguja de 27 gauge. El catéter se inserta en el tercio distal de una de las venas laterales, derecha o izquierda, que recorren la cola del ratón. La jeringa que contiene las microburbujas se coloca en una bomba de infusión que administrará automáticamente un volumen predeterminado uniforme de solución durante un periodo de tiempo establecido.

El análisis de la bioluminescencia de UTMD permite evaluar la eficacia de la entrega de ADN plasmático mediada por UTMD mediante diversos métodos, dependiendo de los genes codificados en el constructo. En particular, la imagen de bioluminescencia in vivo es un método que permite monitorear la presencia y duración de la expresión génica en ratones transfectados con el plásmido que codifica un gen reportero de bioluminescencia, como la luciferasa.

El sistema de imagen in vivo Enogen se utiliza para la bioluminescencia. Por lo general, se obtienen imágenes de todos los ratones el primer día después de la transfección mediada por UTMD, y se repite cada tres o cuatro días hasta que la expresión génica de bioluminiscencia ya no sea visualmente detectable mediante el sistema. Para preparar a los ratones para la imagen bioluminiscente, primero reciben una inyección IP de la sonda repórter luciferasa Lucifer.

Luego, los ratones son anestesiados. Aproximadamente tres minutos después, se permite que la distribución biológica del sustrato de luciferina prosiga durante unos 10 minutos antes de colocar al animal o a los animales en la cámara de imagen Xeno Gen y realizar una exploración de imagen corporal completa durante la adquisición, los fotones emitidos por la reacción fotoquímica de luciferasa de luciferina son determinados por el sistema tras obtenerse cada imagen.

Utilizando el sistema de imagen in vivo Xeno, el software del sistema se emplea para medir y cuantificar la región visible de interés luminiscente.