Name: Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-15T14:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprenda a dirigir la expresión génica en el bulbo olfativo de Danio rerio mediante electroporación in vivo combinada con líneas transgénicas. Este método permite estudios precisos de función neuronal en desarrollo.

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Este trabajo fue financiado a través de una NIH R15 AREA otorgar a John Horne (NIMH, R15MH083221).

1. Embriones transgénicos <ol><li> Aquí estamos utilizando una línea transgénica de peces cebra creado a través de un método de captura transposón mediada potenciador 8. El inserto transgénico incluye dos secuencias de codificación: KalTA4, una versión optimizada de pez cebra del activador transcripcional Gal4, y la proteína fluorescente de color rojo, mCherry. El potenciador de los rendimientos de la trampa método de líneas de pez cebra transgénico que expresa este casete transgénico bajo el control de una secuencia endógena potenciador. Así, dependiendo de la identidad específica de la secuencia potenciadora, la expresión de ambos KalTA4 mCherry y se localiza en regiones específicas del cerebro en desarrollo. Para la Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 línea que estamos utilizando aquí, la expresión se localiza en varios lugares de la parte posterior del cerebro, cerebro anterior, y, de particular importancia aquí, el bulbo olfatorio, 8 (véase también la Fig. 1.) . Dado este patrón de expresión, y la localización de la cinta dentro del genoma, los transgenes se prevé que estará bajo el control del promotor zic4 8 (véase también <a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ neuroimagen / lines_distel / main</a> .). </li><li> Et adultos (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 peces heterocigóticos para la inserción de transgénicos son típicamente acoplado con WT (AB) de pescado, lo que aproximadamente el 50% descendientes transgénicos. (Para un mayor porcentaje de descendencia transgénica, dos heterocigotos puede ser acoplado.) </li><li> Con el fin de bloquear la formación de pigmento y facilitar la proyección de imagen fluorescente, el tratamiento de embriones transgénicos con 100 mM N-feniltiourea (PTU) a partir de las 08.06 HPF. </li></ol> 2. Embriones de montaje <ol><li> En HPF 24-28, la transferencia de embriones al agua huevo sin PTU. Identificar los embriones transgénicos por la expresión de mCherry utilizando un microscopio de fluorescencia. Quitar la membrana coriónica a partir de embriones transgénicos utilizando unas pinzas finas. Transferencia de embriones libres de sus corion a una placa de Petri que contiene el tampón de electroporación, más el 0,02% tricaína [buffer de electroporación: 180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH 7.2] 4. Deje pasar 2 minutos para que el anestésico entre en vigor antes de proceder a la etapa de montaje. </li><li> Prepare una solución al 0.5% de bajo punto de fusión de agarosa en tampón de electroporación más tricaína en el microondas la solución, y luego colocar la solución en una incubadora de 34 a 37 ° C. Una vez que la temperatura de la solución de agarosa se haya equilibrado, se coloca una gota de gran tamaño (~ 500 l) de la solución de agarosa al centro de 60 mm placa de Petri. Añadir 6-8 embriones anestesiado a esta caída de agarosa. </li><li> Con unas pinzas finas (o bien los extremos de corte de puntas de pipeta microloader), la posición de los embriones de forma que todos ellos están orientados en la misma dirección y alineados en una fila vertical. Para solidificar la agarosa, y atrapar a los embriones en su lugar, colocar el plato en una gran placa de Petri con 2.3 mm de hielo. </li><li> Una vez que la agarosa se ha solidificado, inundar el plato con la electroporación de amortiguación más tricaína, asegurando que la solución cubre por completo la caída de agarosa solidificada. </li></ol> 3. Micro-inyección de la expresión del ADN plásmido <ol><li> Prepare la expresión GFP plásmido utilizando un kit de aislamiento de plásmido midi o maxi-prep-(por ejemplo, Qiagen). Suspender el plásmido a una concentración final de 0,5 mg / l en agua estéril, más 0.03% de rojo fenol. Para el experimento bulbo olfatorio de selección descrito aquí, estamos usando un plásmido de expresión con la secuencia de codificación de EGFP bajo el control de múltiples sitios de unión Gal4 (14 tándem secuencias UAS y el promotor basal de pescado, E1b). El uso de este plásmido células, sólo transgénica que expresa el factor de transcripción KalTA4 será capaz de expresar las buenas prácticas agrarias, por lo que, mediando la expresión específica de las buenas prácticas agrarias. Nota: aquí estamos utilizando rojo de fenol para la visualización de las inyecciones de ADN, que debe ser aplicable para la selección de otras regiones del cerebro en desarrollo, siempre y cuando la región se puede acceder desde los ventrículos. Para la orientación de otros tipos de células que requieren visualización fluorescente, Bodipy o colorantes Quantam punto podría ser utilizado para visualizar las inyecciones bajo iluminación fluorescente. </li><li> Pipetas de microinyección se pueden fabricar utilizando un extractor de pipeta horizontal o vertical. Los ajustes de calor y resistencia a la tracción, puede variar dependiendo del tipo de extractor, el tipo de elemento de calefacción, y el tipo de tubos capilares. El uso de un Sutter P-30 extractor vertical, use un ajuste de calor de 980 y un sofá-force de 960 para producir mucho, pipetas afilado, agudo de paredes delgadas de vidrio de borosilicato con filamentos capilares [Instrumento Sutter # BF100-78-10]. Pipetas Microinjetion tiró con estos ajustes son cerrados y ser rotos antes de la inyección. </li><li> Utilice una punta de la pipeta microloader agregar 1.2 l de solución de ADN plásmido para la pipeta de inyección. </li><li> Montaje yasegurar la pipeta cargada en el soporte de pipeta de inyección a presión del sistema. </li><li> Ruptura de regreso por la pipeta cargada con unas pinzas finas hasta pulsos de presión de inflado produce la liberación de la solución de ADN de color rojo. Por otra parte, consejos pueden ser rotos por la rápida penetración una sumergida, doblado Kimwipe laboratorio. Nota: debido a las pipetas de inyección están inicialmente cerrados y ser rotos de forma manual, el tamaño de la punta y el volumen de inyección son variables. Ideal pipetas de inyección debe requerir 3-5 pulsos de inyección para llenar completamente el ventrículo del cerebro anterior en desarrollo de 24 HPF embriones (100 pulsos de inyección ms a 40 psi). </li><li> Inyectar la solución de ADN plásmido en los ventrículos del cerebro en desarrollo, que el ADN se ve obligada junto a, y intercalados en la región del cerebro destinada a formar el bulbo olfatorio. El bulbo olfatorio se deriva de las células en la pared más anterior del ventrículo del cerebro anterior. De este modo, mediante la inserción de la pipeta de inyección en los ventrículos de forma que la pipeta está apuntando hacia la parte anterior del cerebro en desarrollo, las fuerzas de inyección a presión en el ADN y al lado del bulbo olfatorio posibles. Inyectar ADN hasta tinte rojo es claramente visible en el extremo anterior del ventrículo del cerebro anterior. Debido a que el ADN comienza a difundirse de inmediato, diluyendo el ADN, es importante continuar con el paso de la electroporación, tan pronto como sea posible después de la inyección (por ejemplo, a los 10 segundos). </li></ol> 4. Electroporación <ol><li> La electroporación se realiza mediante la auto-construidas a partir de electrodos electrodos de platino hierba subdérmico (Hierba Tecnología # E2). Los electrodos están conectados a una sonda de mano, y la distancia final entre los electrodos de platino debe ser de 1 mm (para más detalles sobre la construcción ver 9). Pulsos de onda cuadrada de electroporación se producen mediante la conexión de los electrodos a una hierba SD-9 estimulador (hierba Technology, modelo SD-9). </li><li> Establecer el estimulador SD-9 para producir solo 5 pulsos electroporación ms a 70 voltios. Posición de los electrodos de forma que el electrodo positivo se coloca al lado del extremo anterior del embrión, mientras que el electrodo negativo es posterior a la cabeza del embrión. Iniciar manualmente ~ 7-8 pulsos electroporación utilizando el interruptor de modo único de la SD-9 estimulador, separando cada pulso de ~ 1 seg. Voltajes apropiados variarán en función de la edad de los embriones y la fuente de voltaje que se utiliza. Embriones más jóvenes requieren voltajes más bajos para evitar el daño del embrión, mientras que los mayores embriones requieren voltajes más altos para iniciar la electroporación 7. </li><li> Permita que los embriones para recuperar por lo menos durante 10 minutos después de la electroporación antes de liberarlos de la agarosa. </li><li> Con unas pinzas finas, sin que los embriones de la agarosa con cuidado trazando el contorno de los embriones y evitar el contacto real con los propios embriones. </li><li> Una vez liberado, el retorno de los embriones de huevo con el agua (con PTU, si es necesario). Mantenerlos a 28 ° C hasta que se fotografió por la expresión de GFP. </li></ol> 5. Embriones de montaje de imágenes <ol><li> La transferencia de embriones a partir de agua de huevo con el agua más PTU huevo más 0,02% tricaína. Espere varios minutos para que el anestésico entre en vigor antes de proceder a la etapa de montaje. </li><li> Prepare una solución al 0.5% de bajo punto de fusión de agarosa en el huevo de agua más tricaína en el microondas la solución, y luego colocar la solución en una incubadora de 34 a 37 ° C. Una vez que la temperatura de la solución de agarosa se haya equilibrado, se coloca una gota de gran tamaño (~ 300 l) de la solución de agarosa al centro de 35 mm placa de Petri. Añadir un embrión anestesiado a esta caída de agarosa. </li><li> Con unas pinzas finas (o bien los extremos de corte de puntas de pipeta microloader), la posición de los embriones que están en posición vertical, por lo que es posible visualizar una vista dorsal del cerebro en desarrollo con un microscopio vertical (ámbitos invertido se requiere una geometría de embriones diferentes, y un plato diferente que permite la visualización desde abajo, ver 12). Solidificar la agarosa mediante la colocación de la antena sobre una gran placa de Petri con 2.3 mm de hielo. Reorientación con unas pinzas finas probable que sea necesario durante la solidificación para asegurarse de que el embrión no se caiga hacia un lado. </li><li> Una vez que la agarosa se ha solidificado, inundar el plato con el huevo de agua más tricaína asegurar que la solución cubre por completo la caída de agarosa solidificada. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Aunque la expresión de GFP se puede observar como a las 6 horas después de la electroporación, aquí estamos mostrando imágenes de un embrión cuatro días después de la electroporación de tal manera que la estructura de las neuritas de las células afectadas ha desarrollado lo suficiente. El Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgénicos línea de trampas potenciador muestra la expresión constitutiva de mCherry (y KalTA4) en la parte posterior del cerebro, el cerebelo, cerebro anterior, y el bulbo olfatorio en los embriones de 5 días después de la fertilización (Fig. 1A y 1C). Los embriones que han tenido una expresión de UAS-GFP plásmido incorporado por electroporación objetivo (como se describió anteriormente), la expresión de mostrar las buenas prácticas agrarias que se limita a las células del bulbo olfatorio en desarrollo (Fig. 1B, 1D y 1E). Sólo las células transgénica que expresa el factor de transcripción KalTA4 son capaces de activar la expresión de este plásmido UAS-GFP. La incorporación de este plásmido en la no-transgénicos embriones no conduce a ninguna expresión de GFP detectable. Por lo tanto, es la acción combinada de la electroporación objetivo de UAS-GFP y expresión localizada transgénicos del conductor KalTA4 que conduce a la expresión exclusiva de la GFP en las células del bulbo olfatorio en desarrollo. La GFP-células que expresan el show típico proyecciones axonales de las células de bulbo olfatorio mitral (Fig. 1B y 1D) 10. Con el fin de visualizar las proyecciones del axón, las imágenes en la figura 1B y 1D tenía que estar expuesto a altos niveles de tal manera que la región de los cuerpos de las células eran muy sobreexpuesta. Un menor nivel de exposición (Fig. 1E) muestra que los cuerpos celulares que expresan GFP son, en efecto localizado en el bulbo olfatorio (véase la Fig. 1C y 1E;. Línea gris marca la frontera del bulbo olfativo). <img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dirigida expresión de GFP en el bulbo olfatorio de un embrión de pez cebra DPF 5. El Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgénicos línea de trampas potenciador, muestra la expresión constitutiva de mCherry en la parte posterior del cerebro, el cerebelo, cerebro anterior, y el bulbo olfativo (A y C, mCherry fluorescencia en rojo). Esta expresión de mCherry está mediada por transgénicos Gal4 expresión. Los embriones que han sido electroporated con un vector de expresión de UAS-GFP a las 28 HPF, mostrar la expresión dirigida GFP en el bulbo olfatorio a los 5 días posteriores a la fecundación (B, D y E, la fluorescencia de GFP se muestra en verde. Embrión mismo que en A y C). Una imagen de la exposición más baja en la parte inferior (E) muestra que la expresión de GFP se limita a los cuerpos de las células del bulbo olfatorio. La línea gris indica la frontera del bulbo olfatorio. Campo claro (en escala de grises), la fluorescencia verde (verde), y el rojo imágenes de fluorescencia (rojo) eran tener con un microscopio de fluorescencia Olympus BX60.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Aquí hemos descrito un método de electroporación in vivo en el pez cebra, que utiliza un potenciador trampa Gal4 línea transgénica para dirigir la expresión del transgén electroporated a una población específica de células en el bulbo olfatorio de desarrollo. Este enfoque combina la excelente resolución temporal de la electroporación in vivo en el 7 con la expresión de células de tipo específico mediado por potenciador trampa de las líneas transgénicas 8. Aunque aquí hemos descrito los ataques del bulbo olfatorio, en la electroporación in vivo puede ser utilizada para combatir otras regiones del sistema nervioso en desarrollo 7.2, y potenciador de las líneas de trampas están disponibles con expresión específica de Gal4 en muchos tipos diferentes de células o tejidos específicos 8, 11. Por supuesto, esta técnica de electroporación también debe ser adecuado para otros enfoques combinatioral genéticos, como la serie LEXA Tet o sistemas de 13, 14, 15. Una gran ventaja de la electroporación es que no hay necesidad de hacer otras líneas transgénicas, ya que una adecuada Gal4-line está disponible. Esto permite ahorrar seis meses. En la electroporación in vivo permite la incorporación de los oligonucleótidos en las neuronas y de sus precursores en cualquier etapa específica del desarrollo del sistema nervioso es de interés del 7. Esta resolución temporal es particularmente ventajoso para el análisis de la pérdida de la función, ya que puede evitar los problemas con los genes de orientación que tienen funciones esenciales en las primeras etapas de desarrollo. El método que describimos aquí también se puede utilizar para incorporar la pérdida de la función de los reactivos incluidos oligonucleótidos RNAi o construcciones y morpholino oligonucleótidos antisentido 4, 7. Plásmido impulsado por reactivos como dominante negativo de plásmidos de expresión de proteínas o de corto horquilla plásmidos RNAi también se puede colocar bajo control de un Gal4 UAS, teniendo en cuenta el tipo específico de célula exacta expresión hemos demostrado aquí para la expresión de GFP.

Reactivos: <ul><li> Agarosa de bajo punto de fusión (Sigma, A9414) </li><li> Kit de plásmido midi o maxi-prep-(por ejemplo, Qiagen, # 12643] </li><li> Rojo fenol (Sigma, P3532) </li></ul> Equipos: <ul><li> Capilar de vidrio de filamento; ID = 0,78 mm; OD = 1,0 mm (Sutter Instruments, # BF100-78-10) </li><li> Hierba SD-9 estimulador (hierba Technology, modelo SD-9) </li><li> Electrodos de platino hierba subdérmico, de aguja recta (Tecnología de la hierba, # E2) </li><li> Micro-cargador de puntas de pipeta (Eppendorf, # X22703R) </li><li> Pipeta extractor (por ejemplo, Sutter, modelo P-30) </li><li> Pipeta extractor (por ejemplo, Sutter, modelo P-30) </li></ul>

orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado en vivo la electroporación y gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

En la electroporación in vivo es un poderoso método para la entrega de los plásmidos de expresión de ADN, reactivos RNAi, y los oligonucleótidos antisentido morfolino a regiones específicas de los embriones en desarrollo, incluidos los de C. elegans, pollo, Xenopus, pez cebra y el ratón 1. En el pez cebra, en la electroporación in vivo se ha demostrado que tiene una excelente resolución espacial y temporal de la prestación de estos reactivos 2-7. La resolución temporal de este método es importante porque permite la incorporación de estos reactivos en determinadas fases de desarrollo. Por otra parte, porque la expresión de vectores electroporated se produce dentro de 6 horas 7, este método es más oportuna que los enfoques transgénicos. Aunque la resolución espacial puede ser muy precisa cuando la orientación de una sola célula 2, 6, a menudo es preferible incorporar los reactivos en una población de células específicas dentro de un tejido o estructura. Al dirigirse a las células múltiples, en la electroporación in vivo es eficiente para la entrega a una región específica del embrión, sin embargo, especialmente en el sistema nervioso en desarrollo, es difícil dirigirse a tipos específicos de células únicamente a través de electroporación espacialmente discretas. Por otra parte, potenciador trampa de las líneas transgénicas ofrecen una excelente celular tipo específico de expresión de transgenes 8. A continuación se describe un enfoque que combina transgénicos Gal4 basado en líneas de trampa potenciador 8 con espacialmente discretos en vivo electroporación 7, 9 para dirigirse específicamente a las neuronas en desarrollo del bulbo olfatorio de pez cebra. El Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 (antes GA80_9) potenciador trampa línea 8 se ha descrito anteriormente, muestra la expresión transgénica de mediación dirigido por un pez cebra mCherry optimizado Gal4 (KalTA4) activador de la transcripción en múltiples regiones del cerebro en desarrollo, incluyendo parte posterior del cerebro, cerebelo, cerebro anterior y el bulbo olfatorio. Para hacer referencia a la expresión de GFP específicamente al bulbo olfativo, un plásmido con la secuencia de codificación de la GFP bajo el control de múltiples sitios de unión Gal4 (UAS) se electroporated en la parte anterior del cerebro anterior en 24-28 horas posteriores a la fecundación (HPF). Aunque este método incorpora el plásmido de ADN en múltiples regiones del cerebro anterior, la expresión de GFP es sólo inducida en las células transgénicamente expresar el factor de transcripción KalTA4. Por lo tanto, utilizando la línea de GA080_9 transgénicos, este enfoque condujo a la expresión de GFP exclusivamente en el bulbo olfatorio de desarrollo. Las células que expresan GFP dirigida a través de este enfoque mostró típico proyecciones axonales, como se ha descrito anteriormente para las células mitrales del bulbo olfativo 10. Este método también se podría utilizar para la ejecución selectiva de otros reactivos incluidos los plásmidos corto horquilla de expresión de ARN de interferencia, lo que proporciona un método para el análisis espacial y pérdida de función temporal discreto.

La resolución temporal y espacial de las manipulaciones genéticas determina el espectro de los fenómenos biológicos que puedan perturbar. Aquí usamos temporal y espacialmente discretos<em&gt; In vivo</emElectroporación&gt;, en combinación con las líneas transgénicas de pez cebra, para inducir la expresión de un transgén GFP específicamente en las neuronas del bulbo olfativo desarrollo.

Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra

La electroporación in vivo es un método potente para la entrega de plásmidos de expresión de ADN, reactivos de RNAi y oligonucleótidos antisentido de morfolino a específicos...

Este método ilustra cómo la combinación de la electroporación in vivo temporal y espacialmente discreta con líneas transgénicas de pez cebra puede dirigirse selectivamente a regiones del embrión en desarrollo para la expresión de transgenes. Comience con peces transgénicos cal TA cuatro, derivados mediante el método de atrapamiento de potenciadores, para restringir la expresión génica y los tipos celulares de interés. En este caso, en el bulbo olfativo en desarrollo en un momento específico del desarrollo, inyecte el plásmido reportero GFP en el extremo anterior del prosencéfalo in vivo y realice electroporación para facilitar la entrega de ADN; los resultados obtenidos mediante imágenes de fluorescencia in vivo indican una localización precisa del transgen en un momento y proceso específicos del desarrollo.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la inyección de plásmido en la etapa de una sola célula, es que la expresión se dirige a tipos celulares específicos dentro de una región determinada del cerebro en desarrollo. Utilice la línea transgénica de pez cebra creada mediante un método de atrapamiento de potenciadores mediado para inducir la expresión tanto del factor de transcripción calt A cuatro como de la proteína reportera M cherry en regiones específicas del cerebro en desarrollo. Prepare el apareamiento de peces adultos heterocigotos para la inserción transgénica con peces de tipo silvestre para obtener aproximadamente un 50 % de descendencia transgénica.Ahora trate los embriones transgénicos con 100 micromolares de fenil tio, comenzando entre las seis y ocho horas posteriores a la fertilización, para bloquear la formación de pigmento y facilitar la obtención de imágenes fluorescentes entre las 24 y 28 horas posteriores a la fertilización. Transfiera los embriones a agua de huevo sin PTU y, bajo un microscopio fluorescente, identifique los embriones transgénicos mediante la expresión de M cherry en el microondas. Prepare una solución al 0,5 % de agarosa de punto de fusión bajo en tampón de electroforesis más trica, y luego equilibre la solución.En un incubador a 34-37 grados Celsius, coloque una gota grande, aproximadamente 500 microlitros de la solución agro, en el centro de una placa de Petri de 60 milímetros. Utilizando pinzas finas, retire la membrana coriónica de los embriones transgénicos. Transfiera los embriones liberados a una placa de Petri que contenga tampón de electroforesis más anestésico trica al 0,02% durante dos minutos.Ahora transfiera seis a ocho embriones anestesiados a la gota preparada de aros utilizando puntas de pipeta cortadas de Michael loader. Coloque los embriones de manera que todos estén orientados en la misma dirección y alineados en una fila vertical. Inmovilice los embriones en posición solidificando el aros con una placa de Petri grande que contenga dos o tres milímetros de hielo.Inunde la placa con tampón de electroforesis más trica, asegurándose de que la solución cubra completamente la gota solidificada de aros. Prepare el plásmido purificado de expresión de GFP con colorante rojo de fenol para la inyección. Ahora fabrique pipetas de microinyección utilizando una punta de pipeta cargadora micro.Agregue uno o dos microlitros de solución de plásmido de ADN a la pipeta de inyección, luego monte y asegure la pipeta cargada en el porta-pipetas del sistema de inyección por presión. Rompa la punta de la pipeta cargada insertándola rápidamente a través de una toalla de papel absorbente sumergida hasta que los pulsos de presión produzcan la liberación POF de la solución roja de ADN, con la pipeta orientada hacia el extremo anterior del cerebro en desarrollo. Inyecte la solución de ADN plasmídico en los ventrículos del cerebro en desarrollo mediante inyección por presión.Introduzca el ADN en una posición adyacente al bulbo olfatorio en desarrollo. Inyecte ADN hasta que el colorante rojo sea claramente visible en el extremo anterior del ventrículo del prosencéfalo. Proceda inmediatamente al paso de electroforesis para evitar la difusión y dilución del ADN.Configure el estimulador SD nine para producir pulsos únicos de electroporación de cinco milisegundos a 70 voltios. Coloque los electrodos de manera que el electrodo positivo quede adyacente al extremo interior del embrión, mientras que el electrodo negativo quede posterior a la cabeza del embrión.Inicie manualmente ocho pulsos de electropermeabilización utilizando un solo interruptor de mota del estimulador SD nine. Separe cada pulso por un segundo. Permita que los embriones se recuperen durante al menos 10 minutos.Ahora, utilizando pinzas finas, siga suavemente el contorno de los embriones evitando el contacto directo con los embriones mismos. Luego, libere los embriones del agar. Devuelva los embriones al agua de huevo y almacénelos a 28 grados Celsius hasta el análisis de la expresión de GFP.Transfiera los embriones al agua de huevo con anestésico trica al 0,02 % durante varios minutos como antes, pero al centro de una placa de Petri más pequeña de 35 milímetros. Añada una gota grande de solución al 0,5 % de agarosa de punto de fusión baja en agua de huevo con trica. Ahora añada un embrión anestesiado a esta gota de agarosa utilizando puntas de pipeta microloader cortadas.Coloque el embrión en posición vertical para facilitar una vista dorsal del cerebro en desarrollo bajo un microscopio invertido. Solidifique los aros en hielo y utilice puntas de micropipeta cortadas para mantener la orientación del embrión. Finalmente, inunde el recipiente con agua de huevo más trica, asegurándose de que la solución cubra completamente la gota de aro solidificada.Este ejemplo combina la resolución temporal de la electroporación in vivo con una expresión específica de tipo celular mediada por líneas transgénicas de trampa de potenciador para dirigirse al bulbo olfativo en desarrollo. La línea transgénica de trampa de potenciador muestra expresión constitutiva de m-cherry y calt A cuatro en el cerebelo del encéfalo posterior, cuatro brainin y bulbo olfativo en embriones a cinco días post fertilización. Importante, cuatro días después de la electroporación, las células que expresan GFP muestran proyecciones axónicas típicas de las células mitrales del bulbo olfativo.Esta comparación de las señales de M Cherry y la menor exposición de GFP demuestra que los cuerpos celulares que expresan GFP están efectivamente localizados en el bulbo olfatorio utilizando construccos de ARN de horquilla corta. Este procedimiento también puede utilizarse para inducir la pérdida de función en tipos celulares específicos del cerebro en desarrollo.

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Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

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