Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra
15 de agosto de 2011
La resolución temporal y espacial de las manipulaciones genéticas determina el espectro de los fenómenos biológicos que puedan perturbar. Aquí usamos temporal y espacialmente discretos In vivo, en combinación con las líneas transgénicas de pez cebra, para inducir la expresión de un transgén GFP específicamente en las neuronas del bulbo olfativo desarrollo.
Este método ilustra cómo la combinación de la electroporación in vivo temporal y espacialmente discreta con líneas transgénicas de pez cebra puede dirigirse selectivamente a regiones del embrión en desarrollo para la expresión de transgenes. Comience con peces transgénicos cal TA cuatro, derivados mediante el método de atrapamiento de potenciadores, para restringir la expresión génica y los tipos celulares de interés. En este caso, en el bulbo olfativo en desarrollo en un momento específico del desarrollo, inyecte el plásmido reportero GFP en el extremo anterior del prosencéfalo in vivo y realice electroporación para facilitar la entrega de ADN; los resultados obtenidos mediante imágenes de fluorescencia in vivo indican una localización precisa del transgen en un momento y proceso específicos del desarrollo.
La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la inyección de plásmido en la etapa de una sola célula, es que la expresión se dirige a tipos celulares específicos dentro de una región determinada del cerebro en desarrollo. Utilice la línea transgénica de pez cebra creada mediante un método de atrapamiento de potenciadores mediado para inducir la expresión tanto del factor de transcripción calt A cuatro como de la proteína reportera M cherry en regiones específicas del cerebro en desarrollo. Prepare el apareamiento de peces adultos heterocigotos para la inserción transgénica con peces de tipo silvestre para obtener aproximadamente un 50 % de descendencia transgénica.
Ahora trate los embriones transgénicos con 100 micromolares de fenil tio, comenzando entre las seis y ocho horas posteriores a la fertilización, para bloquear la formación de pigmento y facilitar la obtención de imágenes fluorescentes entre las 24 y 28 horas posteriores a la fertilización. Transfiera los embriones a agua de huevo sin PTU y, bajo un microscopio fluorescente, identifique los embriones transgénicos mediante la expresión de M cherry en el microondas. Prepare una solución al 0,5 % de agarosa de punto de fusión bajo en tampón de electroforesis más trica, y luego equilibre la solución.
En un incubador a 34-37 grados Celsius, coloque una gota grande, aproximadamente 500 microlitros de la solución agro, en el centro de una placa de Petri de 60 milímetros. Utilizando pinzas finas, retire la membrana coriónica de los embriones transgénicos. Transfiera los embriones liberados a una placa de Petri que contenga tampón de electroforesis más anestésico trica al 0,02% durante dos minutos.
Ahora transfiera seis a ocho embriones anestesiados a la gota preparada de aros utilizando puntas de pipeta cortadas de Michael loader. Coloque los embriones de manera que todos estén orientados en la misma dirección y alineados en una fila vertical. Inmovilice los embriones en posición solidificando el aros con una placa de Petri grande que contenga dos o tres milímetros de hielo.
Inunde la placa con tampón de electroforesis más trica, asegurándose de que la solución cubra completamente la gota solidificada de aros. Prepare el plásmido purificado de expresión de GFP con colorante rojo de fenol para la inyección. Ahora fabrique pipetas de microinyección utilizando una punta de pipeta cargadora micro.
Agregue uno o dos microlitros de solución de plásmido de ADN a la pipeta de inyección, luego monte y asegure la pipeta cargada en el porta-pipetas del sistema de inyección por presión. Rompa la punta de la pipeta cargada insertándola rápidamente a través de una toalla de papel absorbente sumergida hasta que los pulsos de presión produzcan la liberación POF de la solución roja de ADN, con la pipeta orientada hacia el extremo anterior del cerebro en desarrollo. Inyecte la solución de ADN plasmídico en los ventrículos del cerebro en desarrollo mediante inyección por presión.
Introduzca el ADN en una posición adyacente al bulbo olfatorio en desarrollo. Inyecte ADN hasta que el colorante rojo sea claramente visible en el extremo anterior del ventrículo del prosencéfalo. Proceda inmediatamente al paso de electroforesis para evitar la difusión y dilución del ADN.
Configure el estimulador SD nine para producir pulsos únicos de electroporación de cinco milisegundos a 70 voltios. Coloque los electrodos de manera que el electrodo positivo quede adyacente al extremo interior del embrión, mientras que el electrodo negativo quede posterior a la cabeza del embrión.
Inicie manualmente ocho pulsos de electropermeabilización utilizando un solo interruptor de mota del estimulador SD nine. Separe cada pulso por un segundo. Permita que los embriones se recuperen durante al menos 10 minutos.
Ahora, utilizando pinzas finas, siga suavemente el contorno de los embriones evitando el contacto directo con los embriones mismos. Luego, libere los embriones del agar. Devuelva los embriones al agua de huevo y almacénelos a 28 grados Celsius hasta el análisis de la expresión de GFP.
Transfiera los embriones al agua de huevo con anestésico trica al 0,02 % durante varios minutos como antes, pero al centro de una placa de Petri más pequeña de 35 milímetros. Añada una gota grande de solución al 0,5 % de agarosa de punto de fusión baja en agua de huevo con trica. Ahora añada un embrión anestesiado a esta gota de agarosa utilizando puntas de pipeta microloader cortadas.
Coloque el embrión en posición vertical para facilitar una vista dorsal del cerebro en desarrollo bajo un microscopio invertido. Solidifique los aros en hielo y utilice puntas de micropipeta cortadas para mantener la orientación del embrión. Finalmente, inunde el recipiente con agua de huevo más trica, asegurándose de que la solución cubra completamente la gota de aro solidificada.
Este ejemplo combina la resolución temporal de la electroporación in vivo con una expresión específica de tipo celular mediada por líneas transgénicas de trampa de potenciador para dirigirse al bulbo olfativo en desarrollo. La línea transgénica de trampa de potenciador muestra expresión constitutiva de m-cherry y calt A cuatro en el cerebelo del encéfalo posterior, cuatro brainin y bulbo olfativo en embriones a cinco días post fertilización. Importante, cuatro días después de la electroporación, las células que expresan GFP muestran proyecciones axónicas típicas de las células mitrales del bulbo olfativo.
Esta comparación de las señales de M Cherry y la menor exposición de GFP demuestra que los cuerpos celulares que expresan GFP están efectivamente localizados en el bulbo olfatorio utilizando construccos de ARN de horquilla corta. Este procedimiento también puede utilizarse para inducir la pérdida de función en tipos celulares específicos del cerebro en desarrollo.
Descripción general
Este estudio demuestra un método para la expresión génica dirigida en el bulbo olfativo en desarrollo del pez cebra mediante electroforesis in vivo. Al combinar esta técnica con líneas transgénicas, los investigadores pueden lograr un control preciso espacial y temporal sobre la expresión génica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Manipulación Genética
- Biología del Desarrollo
Antecedentes
- La electroforesis in vivo permite la administración dirigida de ADN a regiones específicas de embriones en desarrollo.
- Las líneas transgénicas de pez cebra pueden restringir la expresión génica a tipos celulares específicos.
- El bulbo olfatorio es una zona crítica para estudiar el desarrollo neuronal.
- La resolución temporal y espacial en las manipulaciones genéticas es esencial para comprender los procesos del desarrollo.
Objetivo del estudio
- Ilustrar un método para inducir la expresión génica en neuronas específicas del bulbo olfatorio de pez cebra.
- Comparar la eficacia de este método con las técnicas tradicionales de inyección de plásmidos.
- Explorar el potencial para estudios de pérdida de función mediante el uso de construcciones de ARN de horquilla corta.
Métodos Utilizados
- Utilización de líneas de pez cebra transgénicas derivadas de métodos de atrapamiento de potenciadores.
- Inyección del plásmido reportero GFP en el prosencéfalo seguida de electroforesis.
- Imagen de fluorescencia para confirmar la localización de la expresión del transgén.
- Parámetros de electroforesis ajustados para lograr una entrega óptima de ADN.
Resultados principales
- Localización exitosa de la expresión de GFP en el bulbo olfatorio en etapas específicas del desarrollo.
- Proyecciones axónicas demostradas de las células mitrales del bulbo olfatorio que expresan GFP.
- La comparación de las señales de M Cherry y GFP confirmó la localización de la expresión del transgén.
- Se estableció el potencial para inducir la pérdida de función en tipos celulares específicos.
Conclusiones
- El método proporciona una herramienta poderosa para estudiar la función génica en poblaciones neuronales específicas.
- Ofrece ventajas sobre los métodos tradicionales al permitir una expresión dirigida en regiones definidas.
- Este enfoque puede mejorar nuestra comprensión de los procesos de desarrollo en el cerebro.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite un control espacial y temporal preciso de la expresión de transgenes en poblaciones neuronales definidas, lo que apoya la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento en neurociencia. Al combinar la electroforesis in vivo con líneas de captura de potenciadores, proporciona un sistema reproducible para investigar la función génica en circuitos relevantes para la enfermedad. El enfoque mejora la confianza predictiva en la selección de dianas al reducir los efectos fuera de diana y permitir estudios de pérdida de función en tipos celulares específicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en poblaciones neuronales definidas del bulbo olfatorio.
- Valor operativo: Proporciona expresión transgénica espacialmente restringida para aclarar la función génica en tipos celulares específicos.
- Valor predictivo: Apoya la reducción de riesgos biológicos al vincular la modulación del blanco con fenotipos axonales en células mitrales.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de fluorescencia para evaluar la inducción de transgenes y los patrones de proyección axonal.
- Valor operativo: Permite la preparación estandarizada de embriones electroporados para obtener imágenes y análisis consistentes.
- Escalabilidad: Facilita la prueba de reactivos multiplexados mediante la co-electroporación de ARNi o construcciones CRISPR en fondos transgénicos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Dirigido a neuronas del bulbo olfativo, un sistema relevante para modelos de trastornos neurodesarrolladores y neurodegenerativos.
- Continuidad traslacional: Conecta la validación inicial de dianas con el cribado fenotípico en modelos preclínicos de pez cebra.
- Reducción del riesgo mecanicista: Permite el análisis de pérdida de función mediante shRNA para evaluar la necesidad de la diana en la formación de circuitos neuronales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, permitiendo la verificación de hipótesis sobre dianas antes de la identificación de compuestos líderes y apoyando la preparación de ensayos para cribados fenotípicos en modelos vertebrados.
- Biología del Descubrimiento: Facilita pruebas basadas en hipótesis de la función génica en poblaciones neuronales específicas mediante la expresión espacial y temporalmente controlada de transgenes.
- Selección: Genera salidas de fluorescencia estandarizadas y cuantificables que permiten la evaluación reproducible de compuestos o perturbaciones genéticas.
- Análisis: Permite la comparación de patrones de proyección axonal y la localización celular como lecturas cuantitativas del compromiso del blanco.
- Investigación Traducional: Conecta la validación temprana del blanco con ensayos fenotípicos en modelos de pez cebra de enfermedades neurológicas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para dirigirse a múltiples regiones cerebrales utilizando diferentes líneas de trampas de potenciadores y coordenadas de electrotransferencia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la expresión transgénica específica de tipo celular y lecturas fenotípicas.
- Valor operativo: Normalización de la preparación de embriones, parámetros de electroforesis e protocolos de imagen entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías neuronales diana.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en la validación funcional en circuitos neuronales relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Experiencia en embriología de pez cebra, microinyección y técnicas de electroforesis.
- Acceso a microscopía fluorescente y líneas transgénicas de trampa de potenciadores con patrones de expresión definidos.
- Normalización del diseño de constructos de ADN y condiciones del tampón para electroforesis para lograr reproducibilidad.
- Consideraciones de adaptación para dirigirse a otras regiones cerebrales utilizando líneas alternativas de trampa de potenciadores.
- Las limitaciones incluyen una eficiencia variable de la electroforesis y la necesidad de optimizar la concentración de ADN y los parámetros del pulso.
