La investigación de la motilidad células ciliadas externas, con una combinación de la estimulación externa alterna de campo eléctrico de alta velocidad y Análisis de Imágenes

El objetivo general de este procedimiento es presentar un método confiable para investigar las respuestas motoras de las células ciliadas externas o OHC, incluyendo la electromotilidad, la motilidad lenta y la flexión a frecuencias acústicas. Esto se logra primero recolectando huesos temporales de cobayas, ratones u otros animales mamíferos, y abriendo la bula para exponer la cóclea. El segundo paso consiste en sumergir la cóclea en Lebovits L 15, eliminando la región apical del caparazón óseo, el ligamento espiral y la estría vascular, y extrayendo el órgano de Corti.

Tras una incubación de cinco minutos del órgano de Corti en colagenasa al un miligramo por mililitro, se traslada a la cámara de registro utilizando una jeringa Hamilton de 50 microlitros, y las células se disocian pasándolas repetidamente a través de la aguja. A continuación, la cámara de registro se coloca bajo el microscopio para estimular las células con un campo eléctrico alterno externo y grabar mediante cámara de alta velocidad las respuestas motrices de las células ciliadas externas aisladas. Finalmente, la electro motilidad, la motilidad lenta y la flexión de las células ciliadas externas a frecuencias acústicas pueden evaluarse mediante análisis de imágenes asistido por ordenador.

Comience este procedimiento recolectando los huesos temporales de cobayas, ratones u otros modelos animales mamíferos. Luego abra los huesos temporales utilizando pinzas de alambre. Para exponer la cóclea, retire cuidadosamente el hueso excedente manteniendo intacta la cáscara ósea de la cóclea e inmersa en L-15 Livi.

Bajo el microscopio, abra la región apical de la cóclea. Retire el secador, los VASIs y el ligamento espiral con la punta de una hoja de bisturí, un pincel microscópico o una pinza fina. Extraiga el órgano de Corti del modiolo coclear usando la pinza.

A continuación, coloque el oído interno en colagenasa al uno miligramo por mililitro durante cinco minutos a temperatura ambiente. Si se requieren células ciliadas de las vueltas basales del oído interno, retire con la aguja la cubierta ósea que recubre la base del oído interno y separe la espira del hueso temporal utilizando la hoja de bisturí. Antes de retirar el órgano de Corti, transfiera el órgano de Corti a la cámara de registro usando una jeringa Hamilton de 50 microlitros. Luego, disocie las células pasándolas repetidamente a través de la aguja.

Aquí se muestra el diagrama del generador de campo eléctrico alterno externo y las conexiones con el sistema de captura de imágenes, los circuitos de control y el software implementado especialmente en el núcleo de ingeniería del Instituto Auditivo House Ear. El montaje experimental utilizado en este experimento consiste en un microscopio invertido Axia vert 1 3 5 TV con un sistema de iluminación alternativo basado en LED y dos micromanipuladores electrónicos. Hay tres informes de cámaras en el microscopio: una cámara fotónica ultrarrápida controlada por PC, Fast cam X 10 24 PCI, en el teleporte, que tiene alta resolución y captura imágenes a frecuencias elevadas de hasta 100.000 FPS.

Las imágenes proporcionadas por la cámara de alta velocidad se observan directamente en el monitor del PC. Una cámara CCD convencional adicional en el puerto ocular está conectada a un monitor de alta resolución. Una cámara fotográfica digital convencional en el puerto frontal permite la captura de fotogramas fijos; el software casero que se ejecuta en el mismo PC controla el disparador de la cámara de alta velocidad, el sistema de iluminación y el montaje del campo eléctrico alterno externo.

Los dos electrodos, que consisten en dos hilos de plata de 0,25 milímetros de diámetro con una distancia entre puntas de 0,8 milímetros montados en un micromanipulador eléctrico. A continuación, calibre el campo eléctrico utilizando un electrodo externo. Este electrodo mide el potencial eléctrico en diferentes puntos, generando un mapa del campo eléctrico.

Si una única célula ciliada externa aislada se coloca entre las puntas de los electrodos con su eje longitudinal paralelo al campo eléctrico alterno aplicado, esta se mueve alargándose y acortándose a la misma frecuencia que el campo eléctrico. Por ejemplo, aquí se muestra una célula estimulada a 50 hertzios y grabada a 1000 cuadros por segundo. Esta siguiente imagen muestra una célula estimulada a cuatro kilohercios y grabada a 18 000 cuadros por segundo.

Si la célula se coloca perpendicular al campo, se puede observar y estudiar un tipo diferente de doblado en la respuesta de las células ciliadas externas. Esta célula, por ejemplo, se dobla cuando se estimula a 50 hercios con un campo eléctrico perpendicular a su eje más largo. Las células ciliadas externas pueden mostrar cambios en la forma en respuesta a estimulación no eléctrica.

Esta respuesta se denomina motilidad lenta y también puede estudiarse con esta técnica. Seleccione diferentes estimulaciones entre los cuatro protocolos distintos. El primero es la frecuencia única continua.

Téngase en cuenta que se pueden seleccionar el modo de estímulo, la frecuencia, la amplitud y el tipo de onda, los cuales se indican mediante círculos rojos con el software de control casero. El segundo protocolo de estimulación es de frecuencia única en ráfagas, en el que la duración de las ráfagas y los intervalos entre ellas son ajustables. El tercero es la exploración lineal, en la que las frecuencias inicial y final son ajustables.

El cuarto protocolo de estimulación es la estimulación múltiple, que permite la combinación de diferentes modos de estímulo. Tras seleccionar los parámetros correspondientes, el software de control configura el sistema y permite al operador iniciar la grabación de video sincronizada con la luz y la estimulación celular pulsando un solo botón en la pantalla del ordenador. En esta película, las células ciliadas externas aisladas muestran cambios en la longitud o en la curvatura cuando se estimulan con un campo eléctrico alterno externo que es paralelo o transversal, respectivamente, a su eje longitudinal.

Las respuestas de las células ciliadas externas se analizan fuera de línea utilizando la función de seguimiento de características del software Pro Analysts. Aquí se muestra una célula ciliada externa estimulada a una frecuencia de 50 hertzios y registrada a 1000 cuadros por segundo. El software proporciona la distancia entre dos puntos cuadro a cuadro, como se muestra aquí durante el acortamiento celular. La distancia entre los puntos seleccionados en el ápice, indicado en rojo como placa cuticular, y en la base de la célula, indicado en verde como polo basal, es menor y aumenta con la elongación celular. El software realiza un análisis cuadro a cuadro de los cambios en la longitud de la célula ciliada externa.

El panel en la parte inferior de la imagen muestra el rastro del movimiento. En este ejemplo, el cambio total de longitud es de aproximadamente 6,5 píxeles. A continuación se muestra un ejemplo para demostrar que el borde celular puede detectarse y que el área de la sección óptica puede medirse automáticamente mediante la función de seguimiento de contornos con el software pro analys.

En este experimento, se agregan aleatoriamente microesferas de poliestireno a la solución del baño y se adhieren firmemente a la membrana plasmática. Se pueden seleccionar diferentes microesferas simultáneamente y el software puede rastrear automáticamente todas ellas cuadro por cuadro. De esta manera, las células pueden dividirse en secciones, y la movilidad de cada sección puede evaluarse independientemente.

Al seleccionar las microesferas ubicadas en los bordes laterales de la célula, se pueden evaluar independientemente los cambios en la imagen de la longitud de cada segmento y los cambios en el ángulo de un segmento con respecto al otro. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres horas si se lleva a cabo correctamente.

Por supuesto, se requiere tiempo adicional para el análisis fuera de línea de las películas grabadas. Sin embargo, con un software adecuado, este análisis puede completarse en aproximadamente tres horas más por cada película. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar las respuestas motrices de las células ciliadas externas, incluyendo la electromotilidad, la motilidad lenta y la flexión a frecuencias acústicas.