Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias
26 de octubre de 2011
Este artículo se centrará en la generación de endodermo hepático humano de las poblaciones humanas con células madre embrionarias.
El objetivo general del siguiente experimento es producir niveles homogéneos de hepatocitos humanos para estudiar la biología del hígado humano in vitro. Esto se inicia conduciendo células madre embrionarias humanas o ESC humanas al endodermo definitivo utilizando estímulos fisiológicos activos en A y WINT tres A.As un segundo paso, el endodermo definitivo es conducido de manera altamente eficiente al endodermo hepático. Siguiente El endodermo hepático derivado de ESC humana se madura in vitro para producir hepatocitos humanos funcionales.
Los resultados de la PCR Western blot, la inmunofluorescencia, Eliza y el metabolismo de los fármacos indican que este método deriva hepatocitos de ESC humanas con una eficiencia de alrededor del 90%Con esta técnica, podemos, en teoría, generar suministros inagotables de hepatocitos humanos primarios, que exhiben niveles apreciables de función hepática humana. En el futuro, esto beneficiará la predicción precisa de la toxicidad de los medicamentos y proporcionará apoyo al hígado humano. El truco consiste en impulsar la diferenciación solar y la densidad del núcleo de las células humanas.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que la densidad celular central es esencial para generar una población celular homogénea. Hemos capacitado a más de 15 personas en cuatro sitios a nivel internacional para realizar esta técnica con éxito. Comenzar con un cultivo de células madre embrionarias humanas y propagarlas en placas recubiertas de matrigel con fibroblastos embrionarios de ratón ORM cm de medios condicionados con FGF básico.
Es importante caracterizar cuidadosamente las ESC humanas mantenidas antes de la diferenciación hepática. Por ejemplo, estas células exhiben morfología ESC humana. También expresan los marcadores de células madre pluripotentes, OCT cuatro y nano en niveles comparables a la línea ESC humana de control positivo H seven.
Además, las ESC humanas son positivas para SS EEA cuatro. Cuando las ESC E humanas alcanzan un 30 a 60% de fluidez, reemplace el ME CM con un medio de diferenciación recién preparado. Para iniciar la diferenciación hepática, el medio debe reemplazarse cada 24 horas durante tres días.
Después de tres días, las células adquieren una apariencia triangular a medida que comienzan a diferenciarse hacia un fenotipo endodérmico. Cambie el medio a la diferenciación SR DMSO. Cultivo medio durante cuatro a cinco días.
Sustitución del medio cada 48 horas. Después de este período de cinco días, las células comenzarían a adquirir una apariencia poligonal característica de las células hepáticas. La diferenciación de la ESC humana en el endodermo hepático se refleja en una serie de cambios morfológicos profundos hacia el noveno día.
Además, la expresión de Octa cuatro a lo largo del curso de nueve días disminuye progresivamente. Por el contrario, las transcripciones hepáticas de una PF y la albúmina aumentan a partir del séptimo día. Continuar madurando las células y manteniendo el fenotipo hepático en medio final durante nueve días con medio fresco cada 48 horas.
Por último, monitorizar las células cultivadas mediante microscopía de contraste de fase para detectar cambios morfológicos graduales desde una forma triangular puntiaguda hasta una morfología hepática característica que muestra un aspecto poligonal para evaluar cuantitativamente el ensayo de función del endodermo hepático. Para el citocromo P cuatro 50 actividad enzimática, específicamente SIP tres A cuatro o SIP uno A dos. Primera incubación día 17.
Células del endodermo hepático derivadas de ESC humanas con el sustrato específico que realizan reacciones por triplicado. Recuerde utilizar medios de cultivo de tejidos como control negativo para incubar a 37 grados centígrados durante cinco horas. Recoja los sobrenadantes y mida los niveles relativos de actividad enzimática basal como se detalla en las instrucciones del fabricante.
Ahora, para cada muestra, calcule la actividad enzimática por miligramo de proteína según lo determinado por A-B-C-A-S. Tinción inmunológica de cultivos típicos derivada de este método de maduración in vitro del endodermo hepático. Demostrar la expresión homogénea de tres marcadores hepáticos humanos, albúmina a FP y ein.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diferenciar de manera eficiente las células madre humanas y de aprendizaje en hepatocitos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar a diario con un compromiso de alrededor de dos minutos y medio por millón de células. Es muy importante comprobar los cambios morfológicos a diario durante el proceso de diferenciación.
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Descripción general
Este artículo se centra en la generación de endodermo hepático humano a partir de células madre embrionarias humanas (ESCs). El proceso tiene como objetivo producir hepatocitos humanos funcionales para estudiar la biología hepática in vitro.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de Células Madre
- Diferenciación de Hepatocitos
- Modelos de Hígado In Vitro
Antecedentes
- Las células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse en diversos tipos celulares.
- El endodermo definitivo es un precursor del endodermo hepático.
- La generación eficiente de hepatocitos es crucial para la investigación hepática.
- Los métodos actuales buscan mejorar el rendimiento de hepatocitos funcionales.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para producir hepatocitos humanos a partir de células madre embrionarias (ESC).
- Estudiar la función hepática humana y el metabolismo de fármacos in vitro.
- Proporcionar una fuente de hepatocitos humanos primarios para la investigación.
Métodos Utilizados
- Inducir células madre embrionarias hacia endodermo definitivo mediante estímulos fisiológicos.
- Convertir eficientemente el endodermo definitivo en endodermo hepático.
- Maduración in vitro del endodermo hepático para producir hepatocitos.
- Utilizar PCR, inmunotransferencia (Western blotting), inmunofluorescencia y ELISA para el análisis.
Resultados principales
- El método logra una eficiencia de alrededor del 90 % en la obtención de hepatocitos.
- Los hepatocitos generados exhiben una función hepática humana significativa.
- Esta técnica podría permitir un suministro inagotable de hepatocitos.
- Las aplicaciones potenciales incluyen la predicción de toxicidad de fármacos y el soporte hepático.
Conclusiones
- El estudio presenta un enfoque viable para generar hepatocitos humanos funcionales.
- Este avance podría mejorar la investigación hepática y las pruebas de fármacos.
- Estudios futuros podrían explorar aplicaciones adicionales de esta técnica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La producción escalable de hepatocitos humanos funcionales a partir de células madre pluripotentes aborda un cuello de botella crítico en la toxicología predictiva al proporcionar un modelo renovable y relevante para la evaluación temprana de la seguridad de fármacos. Este enfoque reduce la dependencia de hepatocitos primarios variables y de sistemas no humanos, mejorando la confianza en la traslación de los datos preclínicos de seguridad hepática. Protocolos de diferenciación eficientes permiten la integración en cascadas de cribado de alto rendimiento para la optimización de fármacos líderes y la reducción mecanicista de riesgos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de vías específicas de los hepatocitos y de las deficiencias metabólicas en un contexto celular humano.
- Valor operativo: Proporciona un sustrato celular consistente para evaluar los mecanismos de hepatotoxicidad inducida por compuestos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona células semejantes a hepatocitos con actividad de citocromo P450 medible para el perfilado metabólico funcional.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante una diferenciación de alta eficiencia (~90 %) y una expresión homogénea de marcadores (albúmina, AFP, ENaC).
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Conecta la biología de células madre con la seguridad preclínica al producir células con función hepática humana considerable para la identificación de metabolitos.
- Valor operativo: Permite la evaluación longitudinal de la maduración y estabilidad de hepatocitos in vitro bajo condiciones de cultivo definidas.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
Este método posiciona la producción de hepatocitos derivados de células madre embrionarias humanas como una entrada escalable en etapas iniciales para la biología de descubrimiento, el desarrollo de ensayos y la evaluación preclínica de seguridad, apoyando la continuidad desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la prueba de hipótesis sobre dianas específicas del hígado y vías metabólicas mediante un modelo celular humano diferenciado.
- Cribado: Proporciona células hepatolíticas listas para ensayos, con morfología y expresión de marcadores reproducibles, para la selección de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Permite lecturas cuantitativas del metabolismo de fármacos (por ejemplo, actividad de CYP3A4, CYP1A2) y de la función hepática mediante ELISA, PCR e inmunofluorescencia.
- Investigación Traducional: Apoya la continuidad con modelos preclínicos al ofrecer un sistema relevante para humanos que permite reducir el riesgo mecanicista de compuestos hepatotóxicos.
- Reutilización Empresarial: Establece un sistema de producción celular diferenciable y guiado por protocolos, aplicable en múltiples proyectos y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la evaluación de hepatotoxicidad mediante funciones metabólicas relevantes para el ser humano.
- Valor operativo: Protocolo de diferenciación estandarizado con alta eficiencia y tiempo mínimo de manipulación manual (~2,5 minutos por millón de células).
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar compuestos al reducir la ambigüedad mecanicista en el perfilado de seguridad hepática.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basándose en datos de metabolismo de hepatocitos humanos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de cultivo y diferenciación de células madre.
- Depende de componentes definidos del medio (por ejemplo, FGF básico, SR/DMSO) y de la matriz extracelular (Matrigel).
- Necesita protocolos estandarizados para la densidad de siembra celular y el momento del cambio de medio.
- Las consideraciones de adaptación incluyen la variabilidad en la respuesta de las líneas de ESC y la eficiencia de la inducción de endodermo.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de validación funcional (por ejemplo, actividad de CYP, secreción de albúmina) para confirmar la madurez de los hepatocitos.
