Name: Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprenda a generar hepatocitos funcionales a partir de células madre embrionarias humanas con eficiencia del 90%. Este método permite estudiar biología hepática in vitro y predecir toxicidad de fármacos.

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Dr. Hay fue apoyado por una beca RCUK, el Dr. West fue apoyado por el Departamento de Cirugía, el Dr. Medine fue apoyado por una subvención del Fondo central BHF, el Sr. Baltasar-Lucendo Villarín fue apoyado por una Studenship MRC PhD. El Dr. Zhou fue apoyado por una beca del gobierno chino.

<ol><li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+era+for+hepatology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li>
<li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li>
<li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li>
<li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li>
<li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li>
<li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li>
<li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling%5BTitle%5D)+AND+%22+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li>
<li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos desarrollado un modelo simple, homogéneo y altamente reproducible in vitro para generar niveles escalables de HLC humanos. Nuestro modelo ha sido validado por una serie de laboratorios colaboradores externos. Nosotros habitualmente caracterizan a las células madre derivadas HLC con nuestra caja de herramientas en la casa de las pautas del desarrollo y el hígado específicas ensayos funcionales (la mayoría de los cuales están disponibles en el mercado). Las etapas críticas en nuestro proceso son: el manteni...

Matrigel placas de revestimiento y frascos <ol><li> Matrigel (10 ml, BD Biosciences, Reino Unido); almacenar a -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C. </li><li> Placas de cultivo tisular (6 y 12 de bien, Corning, Reino Unido) </li><li> Frasco de cultivo de tejidos (25 cm2 con ventilación, Corning, Reino Unido) </li></ol> células madre de mantenimiento <ol><li> Medio fibroblastos de embriones de ratón acondicionado (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, EE.UU.), almacenar a -20 ° C. </li><li> BSA solución (50 ml, Sigma Aldrich, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C. </li><li> Fibroblastos humanos básicos del factor de crecimiento (100 mg, Peprotech, EE.UU.), almacenar a -20 ° C. </li></ol> HESCs pases con colagenasa <ol><li> Así confluentes o frasco de hESCs. </li><li> Matrigel recubierto pozos o recipientes, según corresponda. </li><li> Solución salina tamponada con fosfato (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), guárdelo a temperatura ambiente. </li><li> Colagenasa IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C. </li><li> Medio fibroblastos de embriones de ratón acondicionado (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, EE.UU.). </li><li> Factor humano de crecimiento de fibroblastos (100 mg, Peprotech, EE.UU.). </li></ol> La diferenciación de hESCs a endodermo hepática <ol><li> RPMI 1640 (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C. </li><li> Suplemento B27 (10 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido); almacenar a -20 ° C. </li><li> Activina A (2 mg, Peprotech, EE.UU.), almacenar a -20 ° C. </li><li> Recombinante Wnt3a ratón (2 mg, R &amp; D Systems, EE.UU.), almacenar a -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido); almacenar a -20 ° C. </li><li> No aminoácidos esenciales (100 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C. </li><li> β-mercaptoetanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, Reino Unido), guárdelo a temperatura ambiente </li><li> Leibovitz L-15 del medio de cultivo (500 ml, Sigmuna Aldrich, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C. </li><li> Triptosa fosfato de caldo (100 ml, Sigma Aldrich, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C. </li><li> Fetal suero bovino, inactivado por calor (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido); almacenar a -20 ° C. </li><li> Hidrocortisona 21-hemisuccinato (100 mg, Sigma Aldrich, Reino Unido); almacenar a -20 ° C. </li><li> La insulina (páncreas bovino) (100 mg, Sigma Aldrich, Reino Unido); almacenar a -20 ° C. </li><li> L-glutamina (100 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido); almacenar a -20 ° C. </li><li> El ácido ascórbico (25 g, Sigma Aldrich, Reino Unido); almacenar a -20 ° C. </li><li> HGF humano (10 mg, Peprotech, EE.UU.), almacenar a -20 ° C. </li><li> Humana Recombinante oncostatina M (OSM) (50 mg, R &amp; D Systems, EE.UU.), almacenar a -20 ° C. </li><li> Jeringa unidad accionada por filtro de 0,22 micras (Millipore, Reino Unido) </li></ol> Caracterización de las células madre derivadas endodermo hepática Inmunotinción <ol><li> Tampón fosfato salino (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido); stovolver a temperatura ambiente. </li><li> PBST, PBS hizo con 0,1% de Tween 20 (Sigma-Aldrich, Reino Unido). </li><li> Paraformaldehído (PFA) (Sigma-Aldrich, Reino Unido) se compone de PBS, tienda de -20 ° C. </li><li> Glicerol (Sigma-Aldrich, Reino Unido), almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Tris base (Sigma-Aldrich, Reino Unido), almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Etanol </li><li> Suero (ABD Serotech, Reino Unido), almacenar a -20 ° C. </li><li> Anticuerpo secundario, fluoróforos Alexa (Molecular Probes, Invitrogen, Reino Unido). </li><li> Mowiol 4-88 (Polysciences Inc, EE.UU.) se compone de Tris HCL y glicerol como instrucciones de los fabricantes. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) se añade a la solución de Mowiol en una dilución 1:1000. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Anticuerpos primarios </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Antígeno * </td><td> Tipo </td><td> Proveedor </td><td> Dilución </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoclonal de ratón </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 5.100 </td></tr><tr><td> E-cadherina </td><td> Monoclonal de ratón </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-fetoproteína </td><td> Monoclonal de ratón </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Monoclonal de ratón </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoclonal de ratón </td><td> Dako </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Anticuerpos secundarios </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón conjugado con FITC </td><td> Monoclonales de cabra </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Los anticuerpos utilizados para células madre derivadas inmunotinción endodermo hepática, las concentraciones utilizadas, las especies desarrolladas en las empresas y la que se compra. Análisis funcional del endodermo hepática y normalización (por mg de proteína) <ol><li> p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Juegos y luminómetro (Promega, EE.UU.). </li><li value="1"> Blanco fondo plano placa de ensayo y 96 (BD Biosciences, Reino Unido). </li><li> Kit de ensayo BCA (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Reino Unido). </li><li> Transparente 96 y placa de ensayo (Iwaki, Reino Unido) </li></ol>

generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

A pesar de los avances en la toxicidad de modelado humano de los medicamentos, muchos de los compuestos no durante los ensayos clínicos debido a efectos secundarios imprevistos. El costo de los estudios clínicos son importantes, por lo tanto, es esencial que más pantallas toxicología predictiva se desarrollan y despliegan desde el principio en el desarrollo de fármacos (Greenhough et al 2010). Hepatocitos humanos representan el modelo de referencia actual estándar para evaluar la toxicidad del fármaco, pero son un recurso limitado que muestran la función variable. Por lo tanto, el uso de líneas de células inmortalizadas y en modelos animales de tejido se utilizan de forma sistemática debido a su abundancia. Aunque ambas fuentes son de carácter informativo, se ven limitadas por una mala función, variabilidad de las especies y / o la inestabilidad en la cultura (Dalgetty et al 2009). Las células madre pluripotentes (PSC) son una fuente atractiva alternativa de hepatocitos humanos, como las células (HLC) (Medine et al 2010). PSC son capaces de auto-renovación y diferenciación a todos los tipos de células somáticas en el adulto y representa por lo tantouna fuente potencialmente inagotable de células diferenciadas. Hemos desarrollado un procedimiento que es simple, altamente eficiente, susceptibles de automatización y el rendimiento funcional HLC humanos (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 y Hay et al 2011). Creemos que nuestra tecnología dará lugar a la producción escalable de HLC para el descubrimiento de fármacos, la modelización de enfermedades, la construcción de dispositivos extra-corporal y tratamientos basados ​​en la posible trasplante de células.

Este artículo se centrará en la generación de endodermo hepático humano de las poblaciones humanas con células madre embrionarias.

Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

El objetivo general del siguiente experimento es producir niveles homogéneos de hepatocitos humanos para estudiar la biología del hígado humano in vitro. Esto se inicia conduciendo células madre embrionarias humanas o ESC humanas al endodermo definitivo utilizando estímulos fisiológicos activos en A y WINT tres A.As un segundo paso, el endodermo definitivo es conducido de manera altamente eficiente al endodermo hepático. Siguiente El endodermo hepático derivado de ESC humana se madura in vitro para producir hepatocitos humanos funcionales.Los resultados de la PCR Western blot, la inmunofluorescencia, Eliza y el metabolismo de los fármacos indican que este método deriva hepatocitos de ESC humanas con una eficiencia de alrededor del 90%Con esta técnica, podemos, en teoría, generar suministros inagotables de hepatocitos humanos primarios, que exhiben niveles apreciables de función hepática humana. En el futuro, esto beneficiará la predicción precisa de la toxicidad de los medicamentos y proporcionará apoyo al hígado humano. El truco consiste en impulsar la diferenciación solar y la densidad del núcleo de las células humanas.La demostración visual de este método es fundamental, ya que

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Investigación

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Biology

Biología

Este artículo se centrará en el desarrollo de superficies de polímero recubierto de largo plazo, la cultura estable de células madre derivadas de hepatocitos humanos.

Estabilizar hepatocelular Fenotipo Usando superficies sintéticas optimizadas

El método presentado aquí describe un sistema de diferenciación -ready prácticas de fabricación escalable y bueno (GMP) para generar células hepatocitos como las humanas a partir de células madre pluripotentes. Sirve como un sistema rentable y estandarizado para generar células hepatocitos humanos para la investigación, como el hígado humano básico y aplicado.

Definido y escalable Generación de células hepatocitos como las de las células madre pluripotentes

El protocolo que presentamos describe una plataforma para la identificación de pequeñas moléculas para el tratamiento de la enfermedad hepática. Se presenta una descripción paso a paso detallando cómo iPSCs se diferencian en células con características de hepatocitos en placas de 96 pocillos y utilizar las células para detectar pequeñas moléculas con potencial actividad terapéutica.

Usando humanos inducida por células de hepatocito-como derivado de células madre pluripotentes de descubrimiento de fármacos

Este protocolo describe un enfoque semiautomático para producir células similares a hepatocitos de células de vástago pluripotent humana en formato de 96 placa bien. Este proceso es rápido y eficiente, permitiendo que la producción de calidad asegurada lotes de hepatocitos como las células para investigación básica y aplicada.

Producción semi automatizada de hepatocitos como células de células madre pluripotentes

Este protocolo detalla un método monocapa y libre de suero para generar eficientemente células similares a hepatocitos a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en 18 días. Esto implica seis pasos a medida que los hPSCs se diferencian secuencialmente en tipos celulares intermedios como la raya primitiva, el endodermo definitivo, los progenitores posteriores del antebrazo y del brote hepático antes de formar células similares a los hepatocitos.

Diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas en células hepáticas

Este protocolo describe un enfoque para producir hepatoesferas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando un sistema de cultivo definido y un autoensamblaje celular. Este protocolo es reproducible en una serie de líneas celulares, rentable y permite la producción de hepatóferas humanas estables para aplicación biomédica.

Producción libre de suero de heferas humanas tridimensionales a partir de células madre pluripotentes

El objetivo de este artículo es proporcionar un enfoque estandarizado para inducir la diferenciación de progenitores hepáticos humanos a partir de células madre pluripotentes. El desarrollo de este procedimiento con formulaciones de medios listas para usar ofrece al usuario un sistema fácil para generar células hepáticas humanas para la investigación biomédica y la traducción.

Especificación de progenitores hepáticos a partir de células madre pluripotentes utilizando un sistema de diferenciación definida

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la diferenciación de células madres embrionarias humanas (hESCs) en hepatocito-como las células funcionales (HLCs) complementando continuamente Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación del hESC en el endodermo definitivo (DE).

Un Método Eficiente Para La Inducción De Células Dirigidas Hepatocitos-Como De Las Células Madre Embrionarias Humanas

Aquí presentamos un método no genético para generar esferoides hepáticos autólogos humanos utilizando células mononucleares aisladas de sangre periférica en estado estacionario.

Esferoides hepáticos humanos de sangre periférica para estudios de enfermedad hepática

Este protocolo describe la generación de organoides hepáticos endodérmicos (eHEPOs) rápidos y reproducibles. Con este protocolo, los eHEPOs pueden producirse en 2 semanas y expandirse a largo plazo (más de 1 año) sin perder su diferenciación y funcionalidad.

Generación de organoides hepáticos endodérmicos funcionales

Los sistemas de diferenciación de células madre pluripotentes (PSC) a células funcionales disponibles se ven obstaculizados actualmente por problemas de variabilidad severa de línea a línea y de lote a lote. Aquí, utilizando la diferenciación cardíaca como ejemplo principal, presentamos un protocolo para monitorizar y modular de forma inteligente el proceso de diferenciación de PSC basado en el aprendizaje automático basado en imágenes.

Una estrategia de aprendizaje automático basada en imágenes de células vivas para monitorear la diferenciación de células madre pluripotentes

Aprenda a generar hepatocitos funcionales a partir de células madre embrionarias humanas con eficiencia del 90%. Este método permite estudiar biología hepática in vitro y predecir toxicidad de fármacos.

Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

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