Aislamiento mitocondrial: una técnica para aislar mitocondrias de una muestra de tejido de cáncer de ovario humano

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Las mitocondrias, los orgánulos citoplasmáticos conocidos como centrales eléctricas de la célula, experimentan cambios estructurales y funcionales drásticos durante la progresión del cáncer.

Para aislar las mitocondrias, tome tejido canceroso limpio en un plato de vidrio y píquelo en trozos pequeños. Transfiera las piezas a un tubo que contenga tampón de aislamiento mitocondrial. Homogeneizar la muestra para alterar las células y liberar su contenido, incluidos los orgánulos.

Centrifugar la mezcla a baja velocidad. Esto granula los componentes más densos como núcleos, restos de tejido y cualquier célula intacta, dejando componentes menos densos como mitocondrias, microsomas, peroxisomas y lisosomas en el sobrenadante. Recoger el sobrenadante y centrifugar a alta velocidad. Los microsomas, al ser relativamente más ligeros, permanecen en el sobrenadante, mientras que la fracción cruda que contiene mitocondrias se peletiza en la parte inferior.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en un medio de gradiente de densidad adecuado. Establezca un gradiente de densidad discontinuo colocando la fracción mitocondrial cruda dentro de diferentes medios de densidad, organizándolos en orden decreciente de densidades de abajo hacia arriba. Centrifugar a muy alta velocidad. Los orgánulos se separan dentro del tubo para adoptar una posición de equilibrio basada en sus densidades relativas. Recoger la fracción mitocondrial formada en la interfaz entre los medios de densidad, que contiene peroxisomas y lisosomas.

Para comenzar este procedimiento, prepare 250 mililitros del tampón de aislamiento mitocondrial como se describe en el protocolo de texto. Coloque aproximadamente 1,5 gramos de tejidos de cáncer de ovario en un plato de vidrio limpio. Agregue 2 mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial preenfriado para lavar ligeramente la sangre de la superficie del tejido. Repita este lavado tres veces.

Luego, use tijeras oftálmicas limpias para picar completamente el tejido en pedazos de aproximadamente un milímetro cúbico y transfiera los tejidos picados a un tubo centrífugo de 50 mililitros. Agregue 13,5 mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial que contenga nagarse a una concentración de 0,2 miligramos por mililitro. Use un homogeneizador eléctrico para homogeneizar los tejidos picados durante dos minutos a 4 grados centígrados.

Después de esto, agregue otros 3 mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial a los homogeneizados de tejido y mézclelos bien mediante pipeteo. Centrifugar el homogeneizado de tejido preparado a 1.300 x g y a 4 grados centígrados durante 10 minutos. Retire el gránulo y mantenga el sobrenadante.

A continuación, centrifugar el sobrenadante a 10.000 x g y a 4 grados centígrados durante 10 minutos. Retire el sobrenadante que contiene microsomas y guarde el gránulo. Agregue 2 mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial y vuelva a suspender el gránulo completamente mediante un ligero pipeteo.

Centrifugar esta suspensión de pellets a 7.000 x g y a 4 grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y guarde el gránulo, que contiene las mitocondrias crudas. Agregue 12 mililitros de medio de gradiente de densidad al 25% para resuspender las mitocondrias crudas extraídas. Haga un gradiente de densidad discontinuo que contenga las mitocondrias crudas resuspendidas, como se describe en el protocolo de texto, y centrifugue a 52,000 x g y a 4 grados Celsius durante 90 minutos.

Use una jeringa larga y roma para recolectar las mitocondrias purificadas en la interfaz entre los medios de gradiente del 25% y 30% y transfiéralas a un tubo limpio. Agregue tampón de aislamiento mitocondrial a las mitocondrias recolectadas para diluirlo a un volumen tres veces. Centrifugar a 15.000 x g y a 4 grados centígrados durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y guarde la bolita. Recoja el gránulo final, que contiene las mitocondrias purificadas, y guárdelo a menos 20 grados centígrados.

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Última actualización: 1 agosto 2026