Sistema de cultivo proximal: una técnica de cultivo in vitro para estudiar la señalización paracrina entre células

En la señalización paracrina, las células producen y secretan moléculas de señalización que inducen respuestas en las células vecinas. Para imitar la señalización paracrina, comience preparando suspensiones unicelulares de células de cáncer de ovario y células mesoteliales en su medio apropiado.

A continuación, tome un inserto membranoso poroso invertido en una placa de cultivo estéril. Coloque la suspensión de células cancerosas en la superficie inferior de la membrana de inserción para formar una cúpula líquida. Incubar para permitir que las células se asienten y se adhieran a la membrana.

Invierta el inserto para drenar el medio. Transfiera el inserto a una placa de cultivo fresca que contenga medios de cultivo para nutrir las células cancerosas adheridas a la superficie inferior de la membrana. Ahora, agregue la suspensión de células mesoteliales en el pozo de inserción. Incubar para permitir que las células se adhieran al lado opuesto de la membrana, negando cualquier contacto directo entre los dos tipos de células.

Durante el cultivo, ambos tipos de células secretan factores de señalización. Estas moléculas se difunden a través de la membrana porosa hacia las células vecinas. Se unen a receptores celulares específicos e inducen cascadas de señalización complejas en ambos tipos de células.

Comience separando las células cancerosas de ovario de una mezcla confluente al 80% con 1 mililitro de tripsina al 0,25% durante 40 a 60 segundos, seguido de la neutralización de la reacción con 6 mililitros de medio de crecimiento completo. Recoger las células por centrifugación y volver a suspender el pellet en 5 mililitros de medio de crecimiento completo fresco.

Después del recuento, diluya las células a 100,000 células de cáncer de ovario por mililitro de concentración completa de medio de crecimiento y coloque tres insertos de cultivo celular de membrana de policarbonato tratados con cultivo de tejido de poro invertido de 0.4 micrómetros según la condición experimental en una placa de cultivo de tejido estéril de tamaño apropiado. Etiquete los insertos de acuerdo con las condiciones experimentales y pipetee cuidadosamente las células cancerosas en la parte inferior de cada inserto en círculos concéntricos, comenzando desde el centro de la membrana y moviéndose hacia afuera, para formar una cúpula de 800 microlitros.

Tenga mucho cuidado al sembrar las células en la superficie inferior del inserto para que la cúpula de las celdas que contienen medio no se salga de los bordes del inserto durante la incubación.

Cuando se hayan sembrado todos los insertos, cubra el plato y colóquelos con cuidado en la incubadora de cultivo celular. Después de aproximadamente 4 horas, separe el HPMC con 2 mililitros de tripsina al 0,25% durante uno o dos minutos, seguido de la neutralización de la reacción con 12 mililitros de medio de crecimiento completo.

Recoja el HPMC por centrifugación y vuelva a suspender el gránulo en 10 mililitros de medio de crecimiento completo para su conteo. Diluya las células a 300,000 HPMC por mililitro de medio de crecimiento completo y agregue 2.5 mililitros de medio de crecimiento completo fresco a cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos.

Con unas pinzas estériles, coloque cada inserto con el lado derecho hacia arriba en cada pocillo de la placa de 6 pocillos para que las superficies inferiores adheridas a las células cancerosas de ovario se sumerjan en el medio. Luego, siembre 1,5 mililitros de HPMC en el pocillo de cada inserto y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 72 horas.

• Paracrine Signaling - Cellular communication through secreted molecules affecting neighboring cells.
• Mesothelial Surface - The membrane where the mesothelial cells adhere and function.
• Culture System - Set-up where cells are grown under controlled conditions, often in vitro.
• Corning 10-013-CV - Specific type of culture dish used for cell adhesion and growth experiments.
• In Vitro Cell Culture Techniques - Methods used to cultivate cells in controlled environments outside of the living organism.

• Introduce Paracrine Signaling – Paracrine signaling is the process by which cells communicate and influence the behavior of neighboring cells via secreted molecules (e.g., paracrine).
• Key Concepts - We can simulate this biological process in an in vitro cell culture system using human mesothelial cells and cancer cells (e.g., culture system).
• Underlying Mechanisms - Both cell types secret signaling factors which bind to receptors and trigger complex responses (e.g., mesothelial surface).
• Connect to Experiment - To study this, cells are cultivated on either side of a porous membrane in a culture dish (e.g., corning 10-013-CV).

• What is paracrine signaling and how does it work in an in vitro culture system?
• How are mesothelial and cancer cells cultured for this study?
• What are the key concepts and mechanisms underlying paracrine signaling?

• Practical Applications - Understanding paracrine signaling could improve diagnosis and treatment of diseases like cancer (e.g., in vitro cell culture techniques).
• Industry Impact - The knowledge acquired is beneficial for the medical and pharmaceutical sectors (e.g., culture system).
• Societal Importance - The broader implications extend to improving patient outcomes and quality of care (e.g., mesothelial surface).
• Link to Scientific Advancements - The use of in vitro cultivation techniques continues to advance our understanding of cell communication (e.g., corning 10-013-CV).